Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu

06/13-14, thuộc chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang với Liên bang Nga, Đề tài “Cấu trúc và hoạt tính sinh học của một vài ionic Polysaccha

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN VĂN THÀNH

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP DÙNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG HỖ TRỢ PHÒNG CHỐNG ĐÔNG MÁU

Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản

KHÁNH HÒA - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Một số kết quả trong luận

án này được tài trợ kinh phí từ Đề tài hợp tác quốc tế: “Polysaccharide sulfate từ tảo

nâu Việt Nam: Cấu trúc và hoạt tính sinh học”, Mã số: VAST.HTQT.NGA 06/13-14,

thuộc chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha

Trang với Liên bang Nga, Đề tài “Cấu trúc và hoạt tính sinh học của một vài ionic

Polysaccharide chiết tách từ tảo biển ở Nhật Bản và Việt Nam”, Mã số:

VAST.HTQT.NHATBAN.02/13-15, thuộc chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện

Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang với Nhật Bản và Đề tài: “Nghiên cứu

điều chế dẫn xuất polyguluronat sunphat hóa trọng lượng phân tử thấp từ nguồn rong

mơ Việt Nam để ứng dụng trong dược phẩm”, Mã số: VAST06.05/12-13 mà tôi là một

trong những thành viên tham gia thực hiện và đã được Chủ nhiệm đề tài đồng ý cho phép sử dụng trong báo cáo Luận án Các kết quả, số liệu nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào

Khánh Hòa, Ngày tháng 3 năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận án này,

Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm, Lãnh đạo khoa Sau Đại học sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại Trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho các thầy: PGS TS Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang và PGS TS Trần Thị Thanh Vân - Nguyên Trưởng phòng Hóa phân tích - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Bùi Minh Lý - người thầy

đã tận tình hướng dẫn, truyền cảm hứng, định hướng nghiên cứu cho tôi trong giai đoạn đầu thực hiện Luận án này Vì lý do sức khỏe nên Thầy đã không thể tiếp tục hướng dẫn nghiên cứu

Xin chân thành cám ơn: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Chủ nhiệm đề tài quốc tế, mã số: VAST.HTQT.NGA 06/13-14, VAST.HTQT.NHATBAN.02/13-15 và VAST06.05/12-

13 đã hỗ trợ kinh phí để tôi hoàn thành Luận án có chất lượng

Xin cám ơn Lãnh đạo Trường Đại học Kiên Giang đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi được đi học và hoàn thành Luận án này

Xin chân thành cám ơn các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quý báu

để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng

Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các cán bộ thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Gia đình và bạn bè thân thiết đã giúp đỡ, chia

sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu

Khánh Hòa, Ngày tháng 3 năm 2019

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 NGUỒN LỢI RONG NÂU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 4

1.1.1 Giới thiệu chung về rong nâu 4

1.1.2 Một số thành phần hóa học của rong nâu 4

1.1.3 Tình hình sử dụng rong nâu trên thế giới 6

1.1.4 Rong nâu Việt Nam 7

1.2 TỔNG QUAN VỀ ALGINATE 9

1.2.1 Giới thiệu về alginate 9

1.2.2 Cấu trúc và tính chất hóa học của alginate 10

1.2.3 Kỹ thuật tách chiết alginate từ rong nâu 13

1.3 ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 20

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới điều chế alginate khối lượng phân tử thấp 20

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước điều chế alginate khối lượng phân tử thấp 25

1.4 ỨNG DỤNG CỦA ALGINATE VÀ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 28 1.5 QUÁ TRÌNH ĐÔNG MÁU VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU CỦA ALGINATE 32

1.5.1 Lý thuyết của quá trình đông máu 32

1.5.2 Các nghiên cứu hoạt tính chống đông máu của alginate 35

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 39

2.1.1 Rong mơ nguyên liệu 39

2.1.2 Nguyên vật liệu dùng cho xác định độc chất trên chuột 41

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.2.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu 41

2.2.2 Các phương pháp phân tích fucoidan và sodium alginate 41

2.2.3 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học cơ bản của rong nâu 44

2.2.4 Phương pháp đánh giá chất lượng alginate: 44

2.2.5 Phương pháp định lượng vi sinh vật 44

2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính chống đông máu và độc tính của SGS 44

2.2.7 Phương pháp bố trí thực nghiệm 47

2.3 HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG 58

2.4 PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 59

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 60

3.1 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC LOÀI RONG NÂU DÙNG CHO SẢN XUẤT FUCOIDAN VÀ SODIUM ALGINATE 60

3.1.1 Đánh giá hàm lượng fucoidan và sodium alginate ở một số loài rong nâu 60

3.1.2 Xác định thành phần hóa học cơ bản của rong nâu T ornata 66

3.2 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA CÔNG ĐOẠN NẤU CHIẾT SODIUM ALGINATE TỪ RONG NÂU T ORNATA 70

3.3 NGHIÊN CỨU THU NHẬN SODIUM ALGINATE TỪ RONG NÂU VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SODIUM ALGINATE 83

3.3.1 Nghiên cứu xác định nồng độ ethanol kết tủa thu nhận sodium alginate 83

3.3.2 Đề xuất quy trình sản xuất sodium alginate từ rong nâu T ornata 84

3.3.3 Sản xuất thử và đánh giá chất lượng sản phẩm sodium alginate 87

3.3.4 Xác định khối lượng phân tử trung bình của sodium alginate 89

3.3.5 Xác định các đặc tính cấu trúc của sodium alginate thu nhận từ rong T ornata 92 3.4 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ SODIUM ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA SODIUM ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 104

3.4.1 Xác định hàm lượng các sodium alginate khối lượng phân tử thấp 104

3.4.2 Xác định các đặc tính cấu trúc của các alginate khối lượng phân tử thấp 107

3.4.3 Khối lượng phân tử trung bình của alginate khối lượng phân tử thấp 112

3.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ SODIUM GULURONATE SULFATE (SGS) TỪ SODIUM ALGINATE TÁCH CHIẾT TỪ RONG T.ORNATA VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH CỦA SGS 115

3.5.1 Nghiên cứu điều chế SGS từ sodium alginate tách chiết từ rong nâu T ornata 115

3.5.2 Đề xuất quy trình sản xuất SGS từ sodium alginate của rong nâu T ornata và đánh giá các đặc tính của SGS 126

3.6 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC

3.6.1 Đánh giá hoạt tính chống đông máu in vitro của SGS 131

3.6.2 Đánh giá độc tính của SGS trên chuột thí nghiệm 137

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 147

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 149

TÀI LIỆU THAM KHẢO 150

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

APTT : Activated partial thromboplastin time (Thời gian đông

máu nội sinh)

cP : Centipoise (đơn vị đo độ nhớt)

DS : Degree of substitution (Độ thay thế)

FT-IR : Fourrier Transformation InfraRed spectroscopy (Quang

phổ hồng ngoại)

G : Guluronate (guluronic acid)

GPC : Gel Permeation Chromatography (Sắc ký thẩm thấu gel)

IR : InfraRed spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

M : Mannuronate (mannuronic acid)

NMR : Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (Phổ cộng

S mcclurei : Sargassum mcclurei

SMG : Sodium mannuronate - sodium guluronate

S polycystum : Sargassum polycystum

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

T ornata : Turbinaria ornata

TT : Thrombin time (Thời gian đông máu chung)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thiết kế nghiên cứu độc tính của SGS 46

Bảng 2.2 Các tiêu chí đánh giá kết quả trong nghiên cứu độc tính của SGS 46

Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của rong nâu T ornata 67

Bảng 3.2 Điều kiện thí nghiệm được chọn 70

Bảng 3.3 Kết quả ma trận thực nghiệm trực giao cấp I 71

Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa theo hàm lượng sodium alginate 75

Bảng 3.5 Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa theo độ nhớt sodium alginate 80

Bảng 3.6 Hệ số của phương trình hàm đa mục tiêu 81

Bảng 3.7 Kết quả thí nghiệm tối ưu hàm đa mục tiêu 82

Bảng 3.8 Trạng thái chất lượng của sodium alginate 87

Bảng 3.9 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu lý hóa của sodium alginate 88

Bảng 3.10 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu vi sinh của sodium alginate 88

Bảng 3.11 Kết quả phổ IR của sodium alginate từ rong nâu T ornata 93

Bảng 3.12 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của sodium alginate từ rong T ornata 96

Bảng 3.13 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của sodium alginate từ rong T ornata 98

Bảng 3.14 Tương tác proton từ phổ 1H-1H COSY của sodium alginate từ rong Turbinaria ornata 100

Bảng 3.15 Khối lượng trung bình của chuột nhóm I (đánh giá độc tính cấp) 138

Bảng 3.16 Khối lượng trung bình của chuột nhóm II (giai đoạn hồi phục) 139

Bảng 3.17 Tổng hợp kết quả xét nghiệm nước tiểu chuột nhóm I 141

Bảng 3.18 Kết quả xét nghiệm nước tiểu chuột nhóm II 142

Bảng 3.19 Kết quả xét nghiệm huyết học và sinh hóa máu 143

Bảng 3.20 Kết quả quan sát xác định khối lượng tươi của gan, lách, thận của chuột thí nghiệm 144

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Liên kết (14) glycosidic giữa các uronic 11

Hình 1.2 Cấu trúc 2 gốc uronic trong phân tử alginate 11

Hình 1.3 Độ dài trung bình giữa các uronic trong các block của alginate 11

Hình 1.4 Sự sắp xếp các block polysaccharide trong phân tử alginate 12

Hình 1.5 Các giai đoạn của quá trình đông máu 33

Hình 1.6 Cơ chế tạo thành phức hợp prothrombinase theo con đường nội sinh và ngoại sinh 34

Hình 2.1 Hình ảnh về rong mơ Sargassum mcclurei Setchell 39

Hình 2.2 Hình ảnh về rong mơ Sargassum polycystum C Agardh 39

Hình 2.3 Hình ảnh về rong cùi bắp Turbinaria ornata (Turner) J Agardh 39

Hình 2.4 Vị trí thu mẫu rong mơ 39

Hình 2.5 Sơ đồ cách thức tiếp cận các nội dung nghiên cứu của luận án 47

Hình 2.6 Sơ đồ sàng lọc loài rong nâu 49

Hình 2.7 Sơ đồ tối ưu hóa công đoạn nấu chiết sodium alginate 50

Hình 2.8 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol kết tủa sodium alginate 51

Hình 2.10 Sơ đồ điều chế sodium alginate khối lượng phân tử thấp 52

Hình 2.10 Phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa 53

Hình 2.11 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS 54

Hình 2.12 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS 54

Hình 2.13 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS 55

Hình 2.14 Phản ứng tổng hợp sodium guluronate sulfate 55

Hình 2.15 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS 56

Hình 2.16 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tổng hợp đến độ thay thế

của SGS 57

Hình 2.17 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NaNO2/SG phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS 57

Hình 2.18 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của pH phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS 58

Hình 3.1 Sự biến đổi hàm lượng fucoidan ở 3 loài rong nâu theo thời gian thu mẫu 60

Hình 3.2 Sự biến đổi hàm lượng sodium alginate ở 3 loài rong nâu theo thời gian thu mẫu 64

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng sodium alginate thu được sau kết tủa 83

Hình 3.4 Sơ đồ quy trình sản xuất sodium alginate từ rong nâu T ornata 85

Hình 3.5 Sắc ký đồ GPC của sodium alginate 90

Hình 3.6 Sự phân bố khối lượng phân tử của sodium alginate 90

Hình 3.7 Phổ hồng ngoại của sodium alginate từ rong nâu T ornata 92

Hình 3.8 Phổ ESI-MS của sodium alginate từ rong nâu T ornata 93

Hình 3.9 Phổ ESI-MS của disaccharide tại m/z 369 94

Hình 3.10 Phổ 13C-NMR của sodium alginate từ rong nâu T ornata 95

Hình 3.11 Phổ 1H -NMR của sodium alginate thu được từ rong nâu T ornata 97

Hình 3.12 Phổ COSY của sodium alginate từ rong nâu T ornata 100

Hình 3.13 Phổ HSQC của sodium alginate từ rong nâu T ornata 101

Hình 3.14 Phổ HMBC của sodium alginate từ rong nâu T ornata 102

Hình 3.15 Phổ ROESY của sodium alginate từ rong nâu T ornata 103

Hình 3.16 Tương tác của các proton trên phổ ROESY của sodium alginate từ rong nâu T ornata 104

Hình 3.17 Hàm lượng các sodium alginate khối lượng phân tử thấp 105

Hình 3.18 Phổ 13C-NMR của sodium guluronate 107

Hình 3.19 Phổ 1H-NMR của sodium guluronate 109

Hình 3.20 Phổ 13C-NMR của sodium polymannuronate 110

Hình 3.21 Phổ 1H-NMR của sodium polymannuronate 111

Hình 3.22 Sắc ký đồ của GPC của sodium guluronate 112

Hình 3.23 Sự phân bố khối lượng phân tử của sodium guluronate 112

Hình 3.24 Sắc ký đồ của GPC của sodium mannuronate 114

Hình 3.25 Sự phân bố khối lượng phân tử của sodium mannuronate 114

Hình 3.26 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS 116

Hình 3.27 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS 118

Hình 3.28 Ảnh hưởng của tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 của phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS 119

Hình 3.29 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS 121

Hình 3.30 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS 122

Hình 3.31 Ảnh hưởng tỷ lệ nồng độ NaNO2/SG đến độ thay thế của SGS 123

Hình 3.32 Ảnh hưởng của pH phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS 125

Hình 3.33 Quy trình điều chế sodium guluronate sulfate 127

Hình 3.34 Phổ FT-IR của (a) sodium guluronate và (b) sodium guluronate sulfate 129

Hình 3.35 Sắc ký đồ GPC của SGS 130

Hình 3.36 Sự phân bố khối lượng phân tử của SGS 130

Hình 3.37 Ảnh hưởng của khối lượng phân tử trung bình của SGS đến thời gian đông máu 132

Hình 3.38 Ảnh hưởng của nồng độ SGS có khối lượng phân tử trung bình 25 kDa đến thời gian đông máu 134

Hình 3.39 Hình ảnh vi thể của gan, lách, thận chuột lang uống SGS 145

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đề tài luận án: Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm

thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu

Người hướng dẫn: 1 PGS TS Vũ Ngọc Bội

1) Luận án đã xác định được 3 loài rong mơ S mcclurei, S polycystum và T ornata

có hàm lượng fucoidan cao nhất khi thu hoạch vào các tháng 4 và tháng 5 Ngoài ra, 2 loài rong nâu S mcclurei và T ornata có hàm lượng alginate đạt cao nhất khi thu hoạch vào tháng 4 và loài S polycystum có hàm lượng alginate đạt cao nhất khi thu hoạch vào tháng 5 Trong số 3 loài rong đã nghiên cứu thì T ornata là loài thích hợp dùng làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất đồng thời cả fucoidan và alginate

2) Luận án đã xác định được điều kiện tối ưu cho quá trình nấu chiết sodium alginate có độ nhớt cao từ rong mơ T ornata: dung dịch nấu chiết có pH thích hợp là

11 (điều chỉnh bằng Na 2 CO 3 ), nhiệt độ nấu chiết thích hợp là 59 o C và thời gian nấu chiết là 1,5 giờ, nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa sodium alginate từ dịch chiết là 70% Sodium alginate sản xuất từ rong mơ T ornata có độ tinh sạch cao, có tỷ lệ M/G

là 1,06 và có khối lượng phân tử trung bình 648,32 kDal, độ polymer hóa phân tử trung bình là 1037, chỉ số đa phân tán là 3,56 với hiệu suất nấu chiết đạt 87,93% Sản phẩm sodium alginate sản xuất theo quy trình đạt tiêu chuẩn cảm quan, hóa học và vi sinh vật theo quy định hiện hành của Bộ Y tế

3) Luận án đã điều chế được sodium alginate khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp thủy phân bằng acid Sản phẩm sodium alginate khối lượng phân tử thấp thu được bao gồm sodium guluronate chiếm 49,17 ± 1,21%, sodium mannuronate chiếm 38,13 ± 1,16% và sodium guluronate - mannuronate chiếm 3,96 ± 1,08% Sodium guluronate và sodium mannuronate thu được đều có độ tinh sạch cao, có khối lượng

phân tử trung bình tương ứng là 21,661 kDa và 33,759 kDa, độ polymer hóa phân tử trung bình tương ứng là 89 và 128, chỉ số đa phân tán tương ứng là 1,38 và 1,49 4) Luận án đã xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình điều chế SGS như sau: các điều kiện của phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa là: tỷ lệ NaHSO 3 /NaNO 2 là 4,25/1 mol/g, nhiệt độ phản ứng 90 o C và thời gian phản ứng 90 phút; các điều kiện của quá trình tổng hợp SGS là: pH = 9, tỷ lệ nồng độ tác nhân sulfate hóa/sodium guluronate là 2/198 mol/g, nhiệt độ phản ứng là 40 o C và thời gian phản ứng tổng hợp là 4 giờ Từ đó, xây dựng được quy trình sản xuất SGS từ sodium alginate của rong nâu T ornata Chế phẩm SGS sản xuất theo quy trình có độ tinh sạch cao, có khối lượng phân tử trung bình 25,408 kDa, độ polymer hóa phân tử trung bình là 107, chỉ số đa phân tán là 1,35

5) Kết quả đánh giá hoạt tính chống đông máu của SGS cho thấy hoạt tính chống đông máu phụ thuộc vào khối lượng phân tử trung bình và nồng độ của SGS Chế phẩm SGS có tác dụng kéo dài thời gian đông máu nội sinh (APTT) và thời gian đông máu chung (TT), nhưng tác dụng kéo dài thời gian đông máu ngoại sinh (PT) không đáng kể Bên cạnh đó, SGS không độc đối với chuột thí nghiệm Do vậy, chế phẩm SGS có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu

MỞ ĐẦU

Rong biển là một nguồn lợi sinh vật biển tự nhiên, quý giá đã và đang được sử dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và một số ngành công nghiệp khác Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc, sản lượng thu hoạch rong biển của thế giới đạt 25 triệu tấn tươi/năm, khoảng 80% sản lượng rong biển thế giới được cung cấp từ các nước châu Á Thái Bình Dương Trong nguồn lợi rong biển, ngành rong râu có giá trị cao, với tổng giá trị thương mại rong nâu khô trên toàn thế giới hằng năm vào khoảng trên 300 triệu đô la Hàng năm, ngành công nghiệp chế biến rong biển sản xuất ra nhiều loại sản phẩm với giá trị vào khoảng 6,4 tỷ đô la [75] Trong đó, các sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ rong biển có giá trị khoảng 5 tỷ đô

la và ngày càng có xu hướng tăng [186]

Việt Nam có hơn 3200 km bờ biển trải dài từ Bắc vào Nam với diện tích mặt nước biển hơn 1 triệu km2 Biển Việt Nam có nguồn tài nguyên rong nâu khá đa dạng và phong phú, với hơn 120 loài đã được phân loại, sản lượng thu hoạch rong nâu ước đạt

35 nghìn tấn khô/năm [206] Rong nâu có một số loại polysaccharide có giá trị như alginate, laminaran, fucoidan, Do vậy, chúng được coi là nguồn nguyên liệu quý giá

để sản xuất dược phẩm [182], thực phẩm chức năng [191] và mỹ phẩm [220]

Trong rong nâu, hàm lượng fucoidan chiếm khoảng 4 ÷ 8% khối lượng rong khô [18] Fucoidan là polysaccharide sulfate có nhiều hoạt tính sinh học đáng quý như hoạt tính chống đông máu [228], kháng khối u [218], kháng khuẩn, kháng virus (kể cả HIV) [121], chống ung thư [20, 69], chống viêm khớp, viêm nhiễm [124], giảm cholesterol máu [190] Ở nước ta, hiện nay bên cạnh thu hoạch rong nâu để làm phân bón hoặc bán dưới dạng nguyên liệu thô cho thương lái nước ngoài, rong nâu còn được dùng để sản xuất fucoidan thô với sản lượng ước đạt khoảng 400 ÷ 800 tấn/năm [18] Sau khi sản xuất fucoidan, phần bã rong nâu còn lại chỉ dùng làm phân bón hoặc bỏ đi trong khi phần bã rong vẫn còn chứa alginate với hàm lượng cao Do vậy, cần sử dụng rong nâu

để thu nhận đồng thời fucoidan và alginate nhằm hạn chế sự lãng phí tài nguyên biển Hàm lượng alginate ở rong nâu có thể chiếm tới 40% khối lượng rong khô [194] Hiện alginate được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm [194], [209, [213] Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy alginate khối lượng phân tử thấp có nhiều hoạt tính sinh học quý giá hơn hẳn alginate khối lượng phân tử lớn Alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống

oxy hóa (anti-oxidant) [73], [117], kháng viêm (anti-inflammatory) [224], [241], chống

dị ứng (anti-allergy) [227], kháng khuẩn (anti-bacteria) [41], [232], chống béo phì (anti- obesity) [110], chống đông máu (anti-coagulant) [60], [181], [229], [230], kháng ung thư (anti-cancer) [59], ngăn ngừa tăng huyết áp (anti-hypertensive) [52], giảm cholesterol và giảm lượng đường huyết [172] Nhiều nghiên cứu còn cho thấy alginate không có hoạt tính chống đông máu, nhưng alginate sulfate (alginate được sulfate hóa) nhất là alginate sulfate khối lượng phân tử thấp lại có khả năng tương thích cao với máu

do có cấu trúc tương tự như cấu trúc của heparin và có hoạt tính chống đông máu [37], [240] Hoạt tính chống đông máu của alginate sulfate phụ thuộc vào khối lượng phân

tử, tỷ lệ M/G, trình tự sắp xếp các uronic,… [136] Ngày nay các nhà khoa học tập trung nghiên cứu alginate sulfate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu nhằm ứng dụng trong y dược và thực phẩm chức năng [151], [191] Hiện chưa có một công trình nào công bố nghiên cứu về alginate sulfate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính

chống đông máu từ rong nâu Việt Nam Do vậy, việc “Nghiên cứu điều chế alginate

khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu”

từ rong nâu Việt Nam là cần thiết

* Mục tiêu chính của luận án: Điều chế được alginate khối lượng phân tử thấp

từ rong nâu thu mẫu tại vịnh Nha Trang, có hoạt tính chống đông máu dùng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng

* Mục tiêu cụ thể của luận án:

1) Xác định được loài rong nâu thu mẫu tại vịnh Nha Trang dùng làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất fucoidan và alginate

2) Thu nhận được alginate từ rong nâu và đánh giá chất lượng alginate đã thu nhận được

3) Điều chế được alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu từ alginate thu nhận từ rong nâu dùng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng

* Nội dung nghiên cứu của luận án:

1) Nghiên cứu sàng lọc nguyên liệu rong nâu thích hợp dùng cho cho sản xuất fucoidan và alginate

2) Nghiên cứu tối ưu hóa công đoạn nấu chiết alginate từ rong nâu và đánh giá chất lượng alginate đã sản xuất

3) Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp và xác định các đặc tính của alginate khối lượng phân tử thấp

4) Nghiên cứu quy trình sản xuất sodium guluronate sulfate (SGS) từ alginate của rong nâu T ornata và đánh giá các đặc tính của SGS

5) Đánh giá in vitro hoạt tính chống đông máu và đánh giá độc tính của SGS đã sản xuất

* Ý nghĩa khoa học của luận án:

Lần đầu tiên ở Việt Nam, luận án xây dựng được quy trình điều chế alginate khối

lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu từ rong nâu Turbinaria ornata Kết

quả nghiên cứu của luận án tạo dữ liệu khoa học mới về khối lượng phân tử, cấu trúc

của alginate và alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu Đồng thời, kết quả nghiên cứu của luận án tạo bộ dữ liệu khoa học mới được nghiên cứu một

cách có hệ thống, có giá trị tham khảo cho các nhà nghiên cứu, giảng viên, sinh viên và doanh nghiệp chế biến Thủy sản nghiên cứu, sản xuất alginate và alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu dùng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng

* Ý nghĩa thực tiễn của luận án:

Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ nâng cao hiệu quả khai thác và sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên rong nâu dồi dào của Việt Nam Mặt khác, kết quả nghiên của luận án tạo ra một sản phẩm mới và quy trình chuẩn cho điều chế alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu để doanh nghiệp lựa chọn dùng làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng nhằm nâng cao sức khỏe cộng đồng, nâng cao giá trị nguồn nguyên liệu rong nâu, góp phần tạo công ăn việc làm, xóa đói giảm nghèo và nâng cao chất lượng cuộc sống cho cư dân ven biển

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 NGUỒN LỢI RONG NÂU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.1.1 Giới thiệu chung về rong nâu

Rong nâu là nhóm thực vật đa bào, tự dưỡng, thuộc ngành tảo nâu Phaeophyta [4]

Rong nâu có chứa các sắc tố là diệp lục a, diệp lục c, Xanthophyll, carotene và fucoxanthin (đây là loại sắc tố có màu nâu, không tan trong nước và chỉ có ở rong nâu)

Vì vậy, rong nâu có nhiều màu sắc khác nhau (nâu đậm, nâu vàng) và mầu sắc của rong nâu phụ thuộc vào thành phần và tỷ lệ các sắc tố trên [15] Trên thế giới đã tìm thấy khoảng 2060 loài rong nâu [187], trong đó trên 95% loài rong có nguồn gốc ở biển [221]

Đa số loài rong nâu phân bố chủ yếu ở vùng biển nhiệt đới, trong đó bộ Fucales là phổ biến nhất và có giá trị kinh tế hơn cả, mà đại diện là họ Sargassaceae với hai chi

Sargassum và Turbinaria [138]

Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc, tính theo sản lượng

của 3 ngành rong chủ yếu (rong nâu - Phaeophyta; rong đỏ - Rhodophyta và rong lục -

Chlorophyta) thì Trung Quốc là nước có sản lượng thu hoạch rong nâu lớn nhất thế giới

với trên 667 nghìn tấn rong khô/năm (chủ yếu 3 chi chính là Laminaria, Udaria,

Ascophyllum) Tiếp theo là Hàn Quốc với sản lượng khoảng 96 nghìn tấn rong khô/ năm

(với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria) Sản lượng thu hoạch rong nâu của Nhật Bản

đứng thứ ba trên thế giới và đạt vào khoảng 51 nghìn tấn rong khô/ năm (với 3 chi

Laminaria, Udaria, Cladosiphon) Các nước Na Uy và Chile có sản lượng thu hoạch

rong nâu tương ứng khoảng 40 nghìn tấn rong khô/ năm và 27 nghìn tấn rong khô/ năm Tổng giá trị thương mại của rong nâu khô trên toàn thế giới hằng năm đạt trên 300 triệu USD [75]

1.1.2 Một số thành phần hóa học của rong nâu

Thành phần chủ yếu trong thành tế bào rong nâu là các anionic polysaccharide như alginate, fucoidan, fucin [173] và phlorotannin [83] Hàm lượng các thành phần hóa học của rong nâu thay đổi tùy theo loài rong, mùa vụ, vị trí cơ thể rong, điều kiện môi trường,

vị trí địa lý [118]

Hàm lượng carbohydrate ở rong nâu tương đối cao, có thể đạt đến 75% khối lượng

rong khô đối với loài Eiseina bicyclis [125] Trong đó, alginate có hàm lượng cao nhất,

có thể đạt đến 40% so với khối lượng rong khô [194] Hàm lượng alginate thay đổi tùy

theo loài rong, mùa vụ, thời kỳ sinh trưởng, vị trí địa lý [116]

Fucoidan có hàm lượng từ 4 ÷ 8% khối lượng rong khô, là polysaccharide sulfate

có từ 20 ÷ 60% L-fucose gồm galactose, mannose, xylose, glucose và acid glucuronic [18] Hàm lượng fucoidan ở rong nâu khác nhau tùy thuộc vào mùa vụ thu hoạch, điều kiện khí hậu, loài rong [118]

Hàm lượng mannitol chiếm tỷ lệ tương đối cao và thay đổi theo từng bộ phận của rong, loài rong, thời tiết, môi trường địa lý [244] Chẳng hạn, đối với các họ rong

Laminaria và Saccharina có hàm lượng mannitol từ 20 ÷ 30% khối lượng rong khô,

nhưng với loài Ascophyllum nodosum thì hàm lượng mannitol chỉ khoảng 16% khối

lượng rong khô [106] Mannitol tan được trong alcol, dễ tan trong nước và có vị ngọt Mannitol được ứng dụng tương đối rộng rãi trong các ngành công nghiệp sản xuất bánh kẹo, trong y học, thực phẩm và mỹ phẩm [225] Mannitol được bổ sung vào thành phần của thực phẩm để tăng cường khả năng chống các chất có khả năng oxy hóa cơ thể [86] Laminaran có hàm lượng từ 2 ÷ 30% khối lượng rong khô tùy theo loài rong, độ tuổi, vị trí trên cơ thể, mùa vụ [123] Khả năng hòa tan của laminaran phụ thuộc vào loại M-Laminaran (gốc khử cuối gắn với mannitol) hay G-Laminaran (gốc khử cuối gắn với glucose) [246] Laminaran có khả năng kháng u, chống đông máu, kháng ung thư [152] Rong nâu có hàm lượng protein từ 3 ÷ 15% khối lượng rong khô [198], thấp hơn

so với hàm lượng protein ở rong đỏ và rong lục (từ 10 ÷ 47% khối lượng rong khô) [137] Hàm lượng protein và thành phần các amino acid trong rong nâu thay đổi theo loài rong, mùa vụ [198]

Hàm lượng lipid ở rong nâu thấp từ 1÷ 5% khối lượng rong khô [87] So với thực vật trên cạn thì hàm lượng các acid béo không no (như omega 3 và omega 6) của rong nâu cao hơn rất nhiều Chính vì thế, rong nâu có tác dụng phòng trị bệnh suy nhược cơ thể, viêm xương khớp, tiểu đường [158] Thành phần và hàm lượng các acid béo trong rong phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng, giống loài, mùa vụ, vị trí địa lý [153]

Hàm lượng các chất khoáng ở rong nâu cao gấp từ 10 ÷ 20 lần so với thực vật trên cạn, đặc biệt rất giàu calcium, potassium, phosphorus, magnesium và iodine [198] Hằng ngày chỉ dùng với một lượng nhỏ rong nâu (khoảng 25 gam) có thể cung cấp đầy đủ nhu cầu về khoáng chất cho người trưởng thành [157] Hàm lượng khoáng cũng thay đổi theo loài rong, thời kỳ sinh trưởng, vị trí địa lý [198]

Rong nâu có các sắc tố rất có lợi cho sức khỏe con người, đặc biệt là nhóm chất carotenoid có chức năng là tiền vitamin A có tác dụng kháng viêm và kháng ung thư Ngoài ra, hàm lượng fucoxanthin chiếm từ 3 ÷ 6% tổng hàm lượng carotenoid có trong rong nâu và là chất có khả năng chống oxy hóa, chống bệnh tiểu đường và béo phì, giúp làm trắng da [159]

Vitamin có trong rong nâu ở cả 2 dạng hòa tan trong nước và hòa tan trong dầu, gồm có beta-caroten, thiamin (B1), riboflavin, (B2), cobalamin (B12), acid ascorbic (C) [187] Hàm lượng vitamin C ở rong nâu cao hơn các loài rong đỏ và rong lục [143] Đặc biệt, trong rong nâu có cả α-, - và - tocopherol (vitamin E) (trong khi rong đỏ và rong lục chỉ có α-tocopherol) nên rong nâu có tác dụng chữa bệnh tim mạch và bảo vệ sức khỏe [78] Hàm lượng vitamin ở rong nâu thay đổi phụ thuộc vào giống loài, thời kỳ sinh trưởng, điều kiện môi trường sống [44]

Các hợp chất phenolic trong rong nâu có tác dụng hỗ trợ tích cực cho sức khỏe con người [237], đặc biệt là phlorotannin Phlorotannin chỉ có ở rong nâu, hàm lượng có thể lên đến 25% khối lượng rong khô, là hợp chất sinh học đã được ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng, dược phẩm và mỹ phẩm [48] Hàm lượng các hợp chất phenolic

ở rong nâu phụ thuộc vào giống loài, vị trí địa lý, mùa vụ [147]

1.1.3 Tình hình sử dụng rong nâu trên thế giới

Rong nâu giàu protein, vitamin, carbohydrate, khoáng chất và amino acid nên các

họ rong nâu như Durvillaea, Ecklonia, Fucus, Hizikia, Laminaria và Undaria đã được

con người sử dụng làm thực phẩm từ rất xa xưa ở các nước phương Tây và phương Đông [143] Chúng thường được sử dụng ở dạng tươi hoặc chế biến như salat, súp, sushi, muối chua, chất tạo đông, … hoặc trong các dạng bánh biscuit, snack và trà Sử dụng rong nâu làm thực phẩm có độ an toàn cao đối với con người [119] Bên cạnh đó, rong nâu còn được sử dụng với tỷ lệ bổ sung từ 5 ÷ 10% thay cho lượng protein trong thức

ăn gia cầm, dùng làm thức ăn cho ngựa, cừu, heo, chim, bò sữa [71], [195] Ngày nay, rong nâu đã được đưa vào sản xuất thực phẩm chức năng, đóng vai trò tích cực hỗ trợ

và bảo vệ sức khỏe cho con người [191]

Trong các ngành công nghiệp, các họ rong nâu Ascophyllum, Laminaria,

Macrocystis, Durvellia, Sargassum, Cystoseira và Ecklonia được sử dụng làm nguồn

nguyên liệu chính để chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học như fucoidan,

Rong nâu được xem là nguồn nguyên liệu sản xuất phân bón hữu cơ, có nhiều ưu điểm nổi trội như dễ dùng, chi phí thấp, dinh dưỡng cao, giàu các nguyên tố vi lượng (Fe, Cu, Zn, B, Mn, Co, Mo) và đa lượng (Ca, K, P), vitamin, chất kích thích sinh trưởng (auxin, betaine, cytokinin, gibberellin), Do đó, trong nông nghiệp rong nâu được dùng

để cải tạo đất trồng và kích thích sự sinh trưởng của cây trồng [34] Ở các nước như Trung Quốc, Pháp, Nhật Bản, Hàn Quốc, Hà Lan, Philippine, hầu hết các loài rong nâu

như Ascophyllum nodosum, Dictyopteris australis, Durvillaea potatorum, Ecklonia

maxima, Fucus, Laminaria, Macrocystis pyrifera, Sargassum và Turbinaria được dùng

để sản xuất phân bón sinh học [242]

Dược tính được biết đến đầu tiên của rong nâu Aethiops vegetabilis là chữa bệnh bướu cổ ở Châu Âu, Laminaria chữa bệnh đau đầu ở Alaska, Sargassum và Laminaria còn dùng chữa bệnh huyết áp và làm sạch máu, các dịch chiết suất từ Ascophyllum điều trị bong gân và thấp khớp, Cutleria multifida dùng điều trị bệnh loét dạ dày [217] Các

nghiên cứu gần đây cho thấy dịch chiết suất từ rong nâu có các hoạt tính chống đông máu và chống ung thư [165], kháng viêm [224], ngăn ngừa gốc tự do [90], ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây hại cho sức khỏe con người [31] Chính vì vậy, rong nâu là nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá trong hiện tại và tương lai của ngành công nghiệp dược [182], sản xuất thực phẩm chức năng [191], [216] và mỹ phẩm [40], [220] Ngoài ra, rong nâu còn được cho là nguồn nguyên liệu quan trọng và tiềm năng lớn trong sản xuất nhiên liệu sinh học (biodiesel, biogas và bioethanol) Nhu cầu năng lượng của thế giới ngày càng cao, nhiên liệu sinh học có tính thân thiện với môi trường cho nên rong biển nói chung, rong nâu nói riêng chính là nguồn nguyên liệu để sản xuất

và tái tạo nhiên liệu, năng lượng [85], [215]

1.1.4 Rong nâu Việt Nam

Việt Nam hiện đã tìm thấy trên 120 loài rong nâu và rong nâu phát triển mạnh từ tháng 11 hàng năm đến tháng 7 năm sau Khai thác rong nâu được người dân thực hiện chủ yếu từ tháng 4 đến tháng 6 hàng năm là thời điểm rong trưởng thành, đạt kích thước lớn với sản lượng thu hoạch có thể lên đến 35 nghìn tấn rong khô [22] Trong ngành

rong nâu, họ rong mơ thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với khoảng 73 loài, trong đó có những loài phổ biến như S mcclurei, S polycystum, S crassifolium, S

henslowianum, S siliquosum, S oligocystum, S serratum Phần lớn chúng phân bố ở

ven bờ các đảo phía Bắc vịnh Bắc Bộ, ven biển miền Trung và vịnh Thái Lan [8] Sản

lượng thu hoạch rong mơ ở khu vực miền Trung hàng năm vào khoảng 20 nghìn tấn rong khô [7] Riêng vùng biển Khánh Hòa đã phát hiện và phân loại được trên 39 loài

rong nâu thuộc chi Sargassum Vịnh Nha Trang là nơi có trữ lượng rong nâu lớn, đã

phát hiện trên 21 loài với sản lượng ước tính vào khoảng 4800 tấn rong khô/ năm [204] Rong mơ sinh trưởng và phát triển ở dạng sống bám, thích hợp với môi trường có

độ mặn cao, nước trong và có sóng Các vùng ven biển và các đảo có bãi triều đáy cứng (đá san hô chết, các rạn ngầm, đá tảng) là nơi phân bố phổ biến của rong mơ [4]

Ở nước ta, rong mơ tập trung nhiều nhất dọc theo các vùng biển miền Trung từ Đà Nẵng (chân đèo Hải Vân, bán đảo Sơn Trà), Quảng Nam (Cù Lao Chàm, Núi Thành), Quãng Ngãi (Bình Châu, Đảo Lý Sơn, Sa Huỳnh), Bình Định (Phù Mỹ, Qui Nhơn), Phú Yên (vịnh Xuân Đài, Cù Mông), Khánh Hòa (vịnh Vân Phong, Hòn Khói, vịnh Nha Trang, vịnh Cam Ranh), Ninh Thuận (huyện Ninh Hải, Ninh Phước, Sơn Hải) do đặc điểm phân bố của rong mơ thích hợp ở những bãi triều có nhiều vách đá, san hô chết,

độ mặn nước biển cao, nước trong và sóng lớn Các vùng bờ biển từ Bình Thuận đến Bà Rịa - Vũng Tàu rong mơ phân bố không nhiều bởi đặc điểm địa hình chủ yếu là các bãi triều đáy cát, một ít rong nâu có ở Mũi Né, Long Hương (Bình Thuận), Long Hải (Bà Rịa - Vũng Tàu) [1], [3] Ở vùng biển phía Tây Nam, rong mơ phân bố nhiều từ Hòn Chông, Hòn Trẹm (xã Bình An tỉnh Kiên Giang) đến thị xã Hà Tiên, giáp biên giới Campuchia có nhiều bãi triều đá nên rong nâu phát triển [24] và có nhiều ở các đảo, quần đảo của huyện Kiên Hải tỉnh Kiên Giang [5]

Chi rong Turbinaria (rong Cùi bắp) phân bố rộng khắp nơi ở các vùng biển Đà

Nẵng, Quảng Nam, Quãng Ngãi, Quy Nhơn, Khánh Hòa, Phan Rang, Phan Thiết, Vũng Tàu, Kiên Giang Xét sự phân bố theo độ sâu thì chi rong Cùi bắp mọc cao nhất, trong

đó loài T ornata có thể mọc lên gần mực triều trung bình (khoảng 1 mét) và có thể chịu

được sự lộ thiên không có nước biển khi triều xuống [4]

Tình hình khai thác và sử dụng rong mơ ở Việt Nam vẫn chưa được thống kê một cách đầy đủ và chính xác Tuy vậy, ở các vùng ven biển người dân thu hoạch và sử dụng rong mơ cho nhiều mục đích khác nhau như làm phân bón để trồng các loại cây thuốc

lá, khoai lang, hành tỏi, … hoặc sử dụng một số loài rong mơ như rong mơ vàng (S

flavicans), rong mơ chụm (S carpophyllum), rong mơ mềm (S tenerrimum) như một

loại rau, còn đa phần chúng được dùng làm thức ăn gia súc như là một nguồn cung cấp

cũng đã sử dụng rong mơ như là một loài dược thảo thông qua việc làm trà để chữa bệnh bướu cổ và cung cấp vi lượng cho cơ thể con người Sử dụng rong mơ phục vụ cho sản xuất alginate ở quy mô công nghiệp đã bắt đầu phát triển tại Việt Nam trong thời gian

từ 1980 - 1985 Tuy vậy do sản phẩm alginate của chúng ta sản xuất không thể cạnh tranh với sản phẩm nhập khẩu nên việc sản xuất alginate ở Việt Nam bị đình trệ dần và đến nay không còn cơ sở nào trong nước sản xuất alginate Ngoài ra, việc nghiên cứu về alginate trong nước cũng chưa được quan tâm đúng mức nên việc nghiên cứu chuyên sâu về nguồn polysaccharide quý giá này ít được chú trọng Do vậy, nguồn nguyên liệu rong mơ của nước ta hiện nay chủ yếu được khai thác và bán dưới dạng nguyên liệu thô cho thương lái bán lại cho Trung Quốc nên giá trị kinh tế rất thấp [6]

Các loài rong mơ thường có chu kỳ sống trong vòng 1 năm và sẽ tự tàn lụi sau giai đoạn trưởng thành Vào những khi sóng biển mạnh, rong sẽ bị đứt và trôi dạt vào bờ hoặc trôi nổi trên biển Do vậy, với trữ lượng rong mơ của nước ta khá lớn, có thể là nguyên nhân gây nên vấn đề ô nhiễm môi trường nước biển [4], [6]

Bên cạnh thu hoạch rong mơ để làm phân bón hoặc bán dưới dạng nguyên liệu thô, thì rong mơ ở nước ta còn được sử dụng chủ yếu dùng cho sản xuất fucoidan thô với sản

lượng vào khoảng 400 ÷ 800 tấn fucoidan thô mỗi năm [18] Rong mơ sau khi được sử

dụng cho sản xuất fucoidan, phần còn lại được dùng làm phân bón hoặc bỏ đi Như vậy,

có thể thấy chúng ta đã lãng phí nguồn tài nguyên alginate hầu như còn lại nguyên vẹn trong rong sau chiết rút fucoidan Do vậy, việc nghiên cứu thu nhận alginate từ rong

mơ sau khi đã chiết rút fucoidan là việc làm hết sức cần thiết, góp phần nâng cao giá trị cho nguồn tài nguyên rong mơ Chính vì vậy luận án sẽ tiếp cận theo hướng nghiên cứu thu nhận alginate từ rong mơ sau khi đã dùng rong mơ để chiết rút fucoidan với mong muốn góp phần làm tăng hiệu quả sử dụng nguồn lợi rong mơ của Việt Nam

1.2 TỔNG QUAN VỀ ALGINATE

1.2.1 Giới thiệu về alginate

Alginate là tên gọi chung cho các muối của acid alginic, là anionic polysaccharide được tách chiết từ rong nâu và hàm lượng có thể đạt đến 40% so với trọng lượng rong khô [194] Hàm lượng và chất lượng của alginate có sự thay đổi theo giống loài, mùa

vụ, độ tuổi của rong, bộ phận cây rong và điều kiện sống [116]

Hiện nay, alginate thương mại chủ yếu được sản xuất từ các loài rong nâu:

Laminaria hyperborea, Macrocystis pyrifera, Laminaria digitata, Ascophyllum

nodosum, Laminaria japonica, Ecklonia maxima, Lessonia nigrescen, Durvillaea antarctica và Sargassum spp [91] Ngoài ra, alginate còn được sản xuất từ một số loài

vi khuẩn như Azotobacter vinelandii, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas

mendicina, Pseudomonas putida, Pseudomonas phaseolicola và Pseudomonas Fluorescens [178] Trong đó, alginate được sản xuất từ loài vi khuẩn Azotobacter vinelandii có hàm lượng guluronic acid khá cao, từ 45% đến 69% và có thể đạt trên 90%

[70], trong khi alginate tách chiết từ rong nâu thì hàm lượng acid guluronic dao động từ

10 ÷ 70% [33]

Nhu cầu sử dụng alginate trên thế giới ngày càng tăng, cụ thể: năm 1970 nhu cầu toàn thế giới là 13 nghìn tấn, năm 1986 là 22 nghìn tấn, năm 2003 là 30 nghìn tấn, đến năm 2009 đạt 38 nghìn tấn Nhu cầu alginate trên thế giới hàng năm tăng trung bình 10% [75] Trong đó, 33% alginate được dùng trong ngành thực phẩm và y dược, 67% còn lại được dùng cho các ngành kỹ thuật khác [65] Alginate được xem là nguồn polysaccharide vô tận và tái tạo, đáp ứng nhu cầu cho tất cả các nền sản xuất công nghiệp phát triển mạnh mẽ trong tương lai [42]

Alginate không độc, không gây miễn dịch, có khả năng thích ứng và phân hủy sinh học cao nên còn được gọi là “Hợp chất xanh” và được xem là vật liệu mới phục vụ cho các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, ngành dệt, [128] Đặc biệt, các nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra các tính chất quý giá của alginate khối lượng phân tử thấp được ứng dụng mạnh mẽ vào các ngành công nghiệp quan trọng như thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm [115]

1.2.2 Cấu trúc và tính chất hóa học của alginate

Alginate là anionic polysaccharide, là một co-polymer mạch thẳng được tạo thành

từ liên kết (14) glycosidic của β-D-mannuronic acid (M) và α-L-guluronic acid (G) (Hình 1.1) [55]

Theo công thức cổ điển của Haworth, hai monomer này chỉ khác nhau ở nhóm carboxyl nằm ở trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranose, còn theo quan niệm hiện đại, hai gốc uronic này có cấu tạo dạng ghế, có cấu hình khác nhau: mannuronic acid có cấu hình 4C1 còn guluronic acid là 1C4 (Hình 1.2) [39] Chính sự khác nhau của mạch cấu trúc này nên hai uronic thể hiện các tính chất hóa học, sinh học khác nhau [95]

Hình 1.1 Liên kết (14) glycosidic giữa các uronic

Hình 1.2 Cấu trúc 2 gốc uronic trong phân tử alginate

Các chuỗi polyguluronic acid có dạng nếp gấp, còn polymannuronic acid có dạng phẳng Khoảng cách giữa 2 uronic trong chuỗi polyguluronic acid là là 8,7 Å; polymannuronic acid là 10,35 Å và khoảng cách giữa hai uronic trong chuỗi luân phiên polyguluronic acid và polymannuronic acid là 9,5 Å [38, 39]

Hình 1.3 Độ dài trung bình giữa các uronic trong các block của alginate

Trong phân tử alginate, tỷ lệ, trình tự và sự phân bố của hai monomer thay đổi rất rộng tùy theo nguồn gốc của alginate Sự sắp xếp ngẫu nhiên của 2 monomer M và G

trong mạch alginate theo 3 dạng cấu trúc block (Hình 1.4): i) Block homopolymerric guluronic: gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau (GGGG); ii) Block

homopolymerric mannuronic: gồm các gốc acid mannuronic nối tiếp nhau (MMMM) ;

iii) Block heteropolymerric ngẫu nhiên: hai gốc acid guluronic và acid mannuronic luân

phiên nối tiếp nhau (MGMGMGMG) [126]

Hình 1.4 Sự sắp xếp các block polysaccharide trong phân tử alginate

Tính chất lý học, hóa học và sinh học của alginate thay đổi tùy thuộc vào khối lượng phân tử, độ nhớt và tỷ lệ M/G cũng như trình tự sắp xếp các uronic trong polymer [55] Tỷ lệ M/G là thông số quan trọng đặc trưng cho tính chất hoá học, tính chất lý học của alginate và có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu khả năng tạo gel [16] Alginate tách chiết từ rong nâu có tỷ lệ M/G dao động từ 0,2 đến 2,5 và có trọng lượng phân tử trung bình từ 100 kDa đến 1.500 kDa [179]

Độ nhớt của alginate phụ thuộc chủ yếu vào chiều dài mạch polymer, trong khi đó khả năng tạo gel và tính chất giữ nước thì phụ thuộc vào các phân đoạn và sự phân bố các gốc guluronic acid trong phân tử alginate [235] Ngoài ra, độ nhớt của dung dịch alginate cũng phụ thuộc vào nhiệt độ Khi nhiệt độ tăng 1oC thì độ nhớt giảm khoảng 2,5% Khi làm nguội, độ nhớt quay về giá trị thấp hơn ban đầu một ít Tuy nhiên, nếu duy trì nhiệt độ 50oC trong nhiều giờ thì sẽ làm alginate bị cắt mạch và giảm độ nhớt Trái lại, khi hạ nhiệt độ đến khi đông đặc và sau đó làm tan giá cũng không làm cho alginate bị giảm độ nhớt hoặc bị kết tinh [76] Ở pH dưới 5, các ion – COO- bắt đầu bị proton hóa thành -COOH, do đó lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi bị giảm, chúng trở nên gần nhau hơn và tạo liên kết hydro, làm tăng độ nhớt Khi pH bị giảm sâu xa hơn, khoảng

từ 3 đến 4, sẽ tạo thành gel, nếu alginate có chứa một ít ion Ca2+thìsự tạo gel sẽ sớm

hơn ở pH khoảng 5 Nếu pH giảm nhanh từ 6 xuống 2 sẽ tạo thành kết tủa của acid alginic Khi pH trên 11, alginate sẽ bị de-polymer hóa từ từ và làm cho nó bị giảm độ nhớt Liên kết glycosidic rất nhạy cảm bởi cả acid và kiềm, do đó dưới các điều kiện thủy phân, alginate có thể sẽ bị cắt mạch rất nhanh chóng Ngoài ra, tác dụng oxy hóa bởi các gốc tự do cũng làm cho dung dịch alginate bị giảm độ nhớt [92]

Khả năng hòa tan của alginate phụ thuộc vào nhiều yếu tố như pH, nồng độ, các ion trong dung dịch và các ion hóa trị II [51] Sodium alginate hòa tan được trong nước, khi acid hóa alginate dưới pKa sẽ tạo thành dung dịch acid alginic không hòa tan pKa của mannuronic acid là 3,38 và của guluronic acid là 3,65 Mức độ hòa tan của alginate khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của nó ở pH thấp [92]

Acid alginic không tan trong nước nhưng nó có khả năng hấp thụ một lượng nước rất lớn, trương nở và tạo thành dạng bột nhão Ngược lại, sodium alginate và các muối alginate tồn tại dưới dạng các ion kim loại hóa trị I như K+, NH4+, (CH2OH)3NH+ thì tan được trong nước và tạo thành dung dịch có độ nhớt cao Trong khi đó nếu alginate tồn tại dưới dạng các muối ion kim loại hóa trị II thì sẽ không tan được trong nước Alginate có khối lượng phân tử trung bình càng lớn thì độ nhớt dung dịch của nó càng cao Trong sản xuất có thể khống chế điều kiện chiết rút để sản xuất ra alginate có độ nhớt theo yêu cầu và nó có thể biến thiên trong một dãy rộng từ 10 ÷ 1.000 cP (dung dịch alginate 1%) Alginate có độ nhớt từ 200 ÷ 400 cP được sử dụng rộng rãi nhất Alginate dùng trong thực phẩm, mỹ phẩm và nha khoa thường yêu cầu có độ nhớt cao (lớn hơn 700 cP), nhưng dùng cho ngành dược, chất thay thế cho nhũ tương máu và thức

ăn thú cưng thì yêu cầu có độ nhớt trung bình (400 ÷ 700 cP) Alginate độ nhớt thấp (dưới 400 cP) sử dụng cho công nghiệp giấy, nhuộm và in vải [99]

1.2.3 Kỹ thuật tách chiết alginate từ rong nâu

Trong rong nâu, alginate có ở thành tế bào và chủ yếu tồn tại dưới dạng các muối calcium, magie và sodium Khi tồn tại ở dạng với muối của các ion kim loại hóa trị II (calcium và magie) thì alginate không tan trong nước, tuy nhiên alginate lại hòa tan được trong nước khi nó tồn tại dưới dạng muối với ion kim loại hóa trị I (sodium, potassium)

Do đó người ta dựa vào đặc tính trên để chiết alginate ra khỏi tế bào rong Điểm mấu chốt căn bản trong quá trình chiết tách alginate từ rong biển là chuyển hóa tất cả muối alginate về dạng muối sodium, hòa tan trong nước và loại bỏ cặn rong biển bằng phương pháp lọc, sau đó alginate cần được thu hồi từ dịch lọc Hiện có hai con đường thu hồi

alginate: con đường thứ nhất là thêm acid để tạo thành gel acid alginic không tan trong nước và tách nó dưới dạng rắn ra khỏi nước Alginic acid được tách ra dưới dạng gel mềm và một phần lượng nước cần phải được loại khỏi chúng Sau công đoạn này cồn được đưa vào acid alginic, tiếp theo là dùng sodium carbonate để chuyển hóa acid alginic

về sodium alginate Sodium alginate không hòa tan trong hỗn hợp cồn-nước nên có thể tách chúng ra khỏi hỗn hợp, làm khô, nghiền đến kích thước hạt thích hợp phụ thuộc vào từng ứng dụng riêng của nó Con đường thứ 2 thu hồi sodium alginate là thêm vào dung dịch chiết ban đầu một muối calcium Nó tác dụng tạo thành gel calcium alginate với một kết cấu dạng sợi, không hòa tan trong nước và có thể tách ra khỏi chúng Calcium alginate tách ra nằm lơ lửng trong nước và acid được thêm vào để chuyển hóa thành alginic acid Acid alginic dạng sợi này được tách ra rất dễ và đặt vào trong một máy trộn hình cầu với cồn và sodium carbonate được đưa từ từ vào bột nhão cho đến khi tất cả acid alginic được chuyển hóa về sodium alginate, bột sodium alginate đôi khi còn được ép thành những viên nhỏ sau đó sấy và nghiền mịn [98]

1.2.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Alginate lần đầu tiên được nhà hóa học người Anh E C Stanford nghiên cứu tách chiết từ rong nâu vào cuối thế kỷ 18 (1881) và gọi là algin Nhưng mãi đến năm 1923 nghiên cứu về alginate mới bắt đầu phát triển khi Thornley sử dụng alginate để làm chất kết dính các bụi than tạo thành dạng bánh than Năm 1926, Thornley chuyển công ty đến San Diego, California và sử dụng alginate trong sản xuất các bình kín và sau đó đổi tên công ty thành Kelp Products Corp Năm 1929, Kelp Products Corp tổ chức sắp xếp lại lấy tên là Kelco Company và từ đó alginate bắt đầu được sản xuất ở qui mô công nghiệp Ở Anh Quốc, sản xuất alginate được tiến hành trong giai đoạn 1934 ÷ 1939, còn

ở Na Uy thì sản xuất alginate được tiến hành chỉ vài năm sau chiến tranh thế giới lần thứ 2 [150]

Nghiên cứu tách chiết alginate đã được thế giới nghiên cứu công bố với các thông

số kỹ thuật khác nhau tùy thuộc vào phương pháp chiết, loại rong, … Theo Patent sáng chế của Arne Haug, thì qui trình sản xuất alginate như sau: rong được khuấy đảo trong 2% CaCl2 trong 1 giờ, rửa sạch bằng nước khử ion, tiếp tục xử lý với 40% formaldehyde trong 2 giờ Sau đó rửa 3 lần bằng nước khử ion Tiếp tục nấu chiết bằng 5% Na2CO3

trong 48 giờ, lọc bằng vải mỏng rồi kết tủa bằng ethanol, kết tủa được rửa sạch bằng acetone và sấy khô ở 60oC [94] Mc Hugh (1987) đưa ra chế độ nấu chiết alginate đối

với một số loài rong thương mại: nồng độ sođa khoảng 1,5%, nhiệt độ nấu chiết từ 50 ÷

95oC, thời gian nấu chiết từ 1 ÷ 2 giờ [150] Rodolfo và cộng sự (1993) có nghiên cứu

chiết rút alginate từ loài rong Sargassum ở Philippine và đề xuất chế độ chiết alginate:

nồng độ sođa là 3%, nhiệt độ chiết 50oC, thời gian chiết là 2 giờ [180] Cũng với loài

rong Sargassum của Philippine nhưng Calumpong và cộng sự (1999) đã đưa ra quy trình

tách chiết alginate như sau: 20 gam rong khô được ngâm trong 800 mL formaldehyde 2% suốt 24 giờ ở nhiệt độ phòng, rửa bằng nước sạch rồi tiếp tục thêm vào 800 mL dung dịch HCl 0,2M rồi để trong 24 giờ Sau đó, mẫu được rửa sạch bằng nước deion hóa trước khi tách chiết với 2% Na2CO3 ở 100oC trong 3 giờ Ly tâm tách dịch chiết rồi kết tủa bằng ethanol 95% với thể tích gấp 3 lần thể tích dịch chiết Sodium alginate được rửa hai lần với 100 mL acetone, sấy ở 65oC Sodium alginate được hòa tan lại trong 100

mL nước deion hóa, kết tủa lặp lại với ethanol 95% với thể tích gấp 3 lần thể tích dịch sodium alginate, rửa bằng acetone rồi sấy ở 65oC thu được sodium alginate khô [47] Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ nấu chiết đến độ nhớt và trọng lượng phân tử alginate cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu: theo nghiên cứu của Vauchel và cộng sự (2008) thấy rằng khi chiết alginate trong môi trường kiềm thì thời gian chiết làm giảm đáng kể độ nhớt và trọng lượng phân tử của alginate Cụ thể khi thay đổi thời gian chiết từ 1 ÷ 4 giờ thì độ nhớt alginate giảm gần 20% và khối lượng phân tử trung bình của alginate giảm khoảng 17,6% (từ 91,902 kDa xuống còn 16,154 kDa) [211] Nhóm tác giả cũng đã đưa ra phương pháp mới để tách chiết alginate từ

rong Laminaria digitata, theo như phương pháp của các tác giả trước đây trong bước

tách chiết bằng kiềm theo phương pháp chiết theo mẻ (gián đoạn) sẽ mất nhiều thời gian, tiêu hao nhiều nước và hóa chất, thì trong nghiên cứu mới của tác giả sử dụng phương pháp chiết đùn phản ứng liên tục, kết quả cho thấy hiệu quả hơn do thời gian giảm từ 1 giờ còn chỉ vài phút, lượng nước và hóa chất sử dụng giảm hơn 1/2, hiệu suất cao hơn 15%, các tính chất lưu biến của sản phẩm được tăng cường Vì thế phương pháp này có thể đưa vào sản xuất alginate công nghiệp để sản xuất alginate có tính chất lưu biến cao [212] Còn nghiên cứu của Chou và cộng sự (1977) thấy rằng quá trình tách chiết alginate từ rong nâu với nồng độ sođa 3% thì độ nhớt alginate giảm đáng kể so với nồng

độ sođa 1%; nhiệt độ chiết ở 20oC cho hiệu suất chiết và độ nhớt của alginate thấp hơn

so với nhiệt độ chiết từ 50 ÷ 70oC [54]

Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng, độ nhớt và khối lượng phân tử của

alginate được tác giả Chee và cộng sự (2011) nghiên cứu trên 4 loại rong nâu của

Malaysia (S baccularia, S binderi, S siliquosum và T conoides) được lấy từ cảng

Dickson thuộc bang Negeri Sembilan Alginate được tách chiết bằng 2 phương pháp: nóng và lạnh Với phương pháp chiết nóng, thời gian chiết alginate là 3 giờ ở nhiệt độ

50oC còn với phương pháp chiết lạnh thì quá trình chiết tiến hành qua đêm ở nhiệt độ phòng 27oC Hàm lượng alginate chiết tách bằng phương pháp nóng cao hơn phương pháp chiết lạnh, nhưng phương pháp chiết lạnh cho alginate có độ nhớt và khối lượng phân tử lớn hơn Hàm lượng alginate thu được theo phương pháp chiết nóng từ các loại

rong S siliquosum, T conoides, S binderi và S baccularia tương ứng là 49%, 41,4%,

38,9% và 26,7%, nhưng với phương pháp chiết lạnh thì hàm lượng alginate chỉ đạt tương ứng là 38,9%, 40,5%, 28,7% và 23,9% Bên cạnh đó, nhóm tác giả nghiên cứu cũng cho rằng, so với phương pháp chiết ở nhiệt độ thường thì khi chiết alginate ở nhiệt độ 50oC

cũng làm giảm độ nhớt nội của alginate, cụ thể là độ nhớt nội của rong S baccularia giảm mạnh nhất (83%), tiếp theo là rong S siliquosum (16%), độ nhớt nội của 2 loài rong S binderi và T conoides giảm ít hơn trong khoảng 13 ÷ 14% Khối lượng phân tử alginate cũng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, đối với rong S baccularia, khối lượng phân tử

alginate giảm trên 83% do ảnh hưởng của nhiệt độ, 3 loại rong còn lại thì khối lượng phân tử của alginate giảm từ 13% đến 16% do ảnh hưởng của nhiệt độ cao [51]

Khi nghiên cứu tách chiết alginate, Finn Hjelland (2010) thấy rằng các loài rong

Alginophytes ngoài alginate, fucoidan và laminaran chúng còn có chứa acid mannuronic

có hoạt tính kích thích hệ miễn dịch Vì vậy, tác giả đã xây dựng quy trình chiết rút alginate kết hợp với việc thu hồi mannuronic acid bằng cách thay đổi pH phù hợp với quá trình xử lý rong trước khi chiết rong bằng sođa [103]

Nghiên cứu tách chiết alginate ở qui mô pilot được nghiên cứu bởi carmona và cộng sự (1998): trước khi xử lý acid, dùng formaldehyde 0,1% xử lý rong Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng formaldehyde thì sản phẩm ít có màu, có thể làm cho ion calcium từ 33,4% đến gần 0, hiệu suất chiết alginate 7% Độ mạnh của acid khi

Hernández-xử lý tỷ lệ thuận với sự thay đổi tỷ lệ calcium nhưng tỷ lệ nghịch với độ nhớt alginate thu được Với acid mạnh độ nhớt đo được là 168 cP, trong khi đó nếu sử dụng các acid trung bình, độ nhớt đo được là 623 cP [97] Theo một nghiên cứu khác cũng của nhóm tác giả trên vào năm 1999 đã xác định được điều kiện chiết tách alginate tốt nhất trong môi trường kiềm ở pH = 10, nhiệt độ 80oC trong thời gian 2 giờ Tỷ lệ thu alginate tăng

theo thời gian chiết và đạt cao nhất sau khi chiết 3,5 giờ, tuy nhiên nhiệt độ và thời gian chiết có ảnh hưởng rõ rệt đến độ nhớt của dung dịch alginate [99] Năm 2002, nhóm tác giả đã thiết lập ba bước chính trong sản xuất alginate qui mô pilot [98]: chuyển acid alginic thành sodium alginate; làm khô và nghiền nhỏ Nhiệt độ và thời gian tốt nhất để làm khô alginate xuống độ ẩm 12% là 60oC trong 2,5 giờ; ảnh hưởng của nhiệt độ làm khô đến độ nhớt của dung dịch alginate phụ thuộc vào loại alginate Với loại alginate có

độ nhớt thấp, nhiệt độ làm khô không ảnh hưởng, còn đối với loại alginate có độ nhớt cao, độ nhớt sẽ giảm từ 40 ÷ 54% khi thay đổi nhiệt độ làm khô từ 60 ÷ 80oC

Năm 2005, các nhà khoa học Liên Bang Nga đã đưa ra một quy trình công nghệ phức hợp chế biến rong nâu cho phép thu nhận đồng thời các chế phẩm riêng biệt, đó là các acid (acid alginic, polymannuronic acid), các polysaccharide trung tính (fucoidan, laminaran) và các chế phẩm làm giàu của các chất có hoạt tính sinh học trọng lượng phân tử thấp [154] Quy trình bao gồm các bước sau: 1) Xử lý rong với cồn để thu nhận các hợp chất trọng lượng phân tử thấp tan trong cồn và bã rong lần 1; 2) Tách phân đoạn cồn; 3) Phân đoạn cồn được cho bay hơi để thu dung dịch làm giàu chứa các hợp chất trọng lượng phân tử thấp có hoạt tính sinh học; 4) Chiết bã rong lần 1 với một dung dịch nước ở pH < 6, để thu được một dịch chiết lần 1 với nước và bã rong lần 2; 5) Cô đặc dịch chiết nước lần 1 và chỉnh pH dung dịch chiết về 5 ÷ 8 thu được phân đoạn chứa hỗn hợp laminaran và fucoidan, tủa với cồn sau đó tách riêng fucoidan và laminaran; 6) Chiết bã rong biển lần 2 với nước Cô đặc dung dịch chiết lần 2 và sấy khô thu được một phân đoạn polysaccharide chứa hỗn hợp laminaran, fucoidan và polymannuronic acid Chỉnh pH của dịch chiết về 2,5 để kết tủa acid mannuronic còn lại fucoidan và laminaran tan trong nước Trung hòa dung dịch còn lại sau khi tách tủa và tách tủa với cồn thu được phân đoạn polysaccharide có chứa fucoidan và laminaran và bã rong lần 3; 7) Xử lý bã rong lần 3 với NaHCO3 sau đó kết tủa với cồn thu được alginate

1.2.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu tách chiết alginate ở nước ta được thực hiện lần đầu tiên vào năm 1961 dùng trong ngành dệt Năm 1966, bộ môn Chế biến Trường Đại học Thủy sản đã tách chiết alginate từ rong mơ vùng biển Hải Phòng và đã ứng dụng vào việc in hoa trên vải Năm 1978, quy trình sản xuất alginate bán cơ giới năng suất 10tấn/năm tại Xí nghiệp Chế biến Hải sản Hạ Long, Hải Phòng, đây là cơ sở sản xuất alginate lớn nhất nước ta, tuy nhiên vì nhiều lý do phân xưởng sau đó ngừng sản xuất [14]

Năm 1999, Ngô Đăng Nghĩa đã nghiên cứu tối ưu hóa qui trình công nghệ sản xuất alginate từ rong mơ Việt Nam và ứng dụng nó trong một số lĩnh vực sản xuất [16] Trong nghiên cứu tác giả tiến hành tách chiết alginate theo qui trình acid hóa và kết quả nghiên

cứu như sau: Với rong S mcclurei: điều kiện nấu chiết alginate tối ưu là: nồng độ

Na2CO3 từ 1,54 ÷ 1,68%; tỷ lệ dung dịch chiết gấp 20 lần rong khô; nhiệt độ nấu chiết

55 ÷ 60oC; thời gian nấu chiết 1,15 ÷ 2,2 giờ Kết quả sản phẩm thu được ở điều kiện tách chiết tối ưu là: Độ nhớt dung dịch alginate 1%: 2.165 ÷ 2.998 cP; hiệu suất quy

trình: 34 ÷ 35,87% Với rong S kjellmanianum điều kiện nấu chiết alginate tối ưu là:

nồng độ Na2CO3 từ 1,54 ÷ 1,68%; tỷ lệ dung dịch chiết gấp 20 lần rong khô; nhiệt độ nấu chiết 60oC; thời gian nấu 2 giờ Kết quả sản phẩm thu nhận được ở điều kiện tách chiết tối ưu là: độ nhớt dung dịch alginate 1% là 857 ÷ 983 cP; hiệu suất quy trình 25 ÷ 30,5%

Năm 2003, Trần Thị Luyến và cộng sự đã nghiên cứu hoàn thiện và cải tiến qui trình công nghệ sản xuất alginate theo phương pháp xử lý CaCl2 0,1% từ 2 loại rong nâu

thu hoạch tại Hòn Chồng, Nha Trang là S mcclurei và S kjellmanianum Theo kết quả

nghiên cứu, rong nâu được xử lý bằng CaCl2, sau đó đem nấu và xử lý tẩy trắng Chất

lượng keo rong nâu như sau: đối với rong S mcclurei hiệu suất 32,68%, độ nhớt 1.480 centipoise, còn đối với rong S kjellmanianum hiệu suất 28,42%, độ nhớt 1.238

centipoise [13] Tính đến thời điểm hiện tại, quy trình sản xuất alginate theo phương pháp xử lý CaCl2 0,1% là một công nghệ mới lần đầu tiên được nghiên cứu Qua thực nghiệm thu được alginate có chất lượng cao và hiệu suất thu nhận không thua kém alginate thu nhận theo phương pháp sử dụng formaldehyde và chất lượng còn cao hơn alginate sản xuất theo một số phương pháp khác có trên thị trường Mặt khác quy trình

xử lý CaCl2 còn có ưu việt là giảm thiểu ô nhiễm môi trường do không sử dụng formaldehyde - chất độc có ảnh hưởng đến sức khoẻ của công nhân và ảnh hưởng xấu đến môi trường

Năm 2008, Nguyễn Bích Hải Thủy và cộng sự đã nghiên cứu chiết tách alginate

từ rong mơ S mcclurei, sử dụng dung môi Na2CO3 0,5% và tinh chế alginate bằng cách kết tủa tạo acid alginic tự do trong dung dịch (có chứa CaCl2 2% trong HCl pH = 2), thu được sản phẩm alginate có màu nâu Tác giả cũng xác định một cách định tính tỷ lệ M/G

là khoảng 1/2, alginate giàu gốc guluronate và hình thành gel khỏe, nhưng lại giòn và

dễ gãy [21]

Năm 2010, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã cùng với Viện VNITRO và PIBOC (Liên Bang Nga) thiết lập quy trình công nghệ thu nhận đồng thời fucoidan và calcium alginate từ rong mơ Việt Nam, trong đó chủ yếu là sản xuất fucoidan Quy trình tiến hành như sau: chiết fucoidan với điều kiện chiết tối ưu: tỷ lệ rong/dung dịch chiết là 1/10 (w/v); pH của dung dịch chiết là 1,9 ÷ 2,5 Sử dụng màng siêu lọc kích thước 50 ÷ 100 kDa để đồng thời cô đặc và làm sạch dung dịch fucoidan khỏi alginate và các chất khoáng; tủa fucoidan bằng cồn 60 ÷ 70% Sử dụng dung môi

là ethanol để hòa tan tủa fucoidan dưới dạng huyền phù và tiến hành sấy phun tại nhiệt

độ 65oC Chiết calcium alginate: bã thải rong nâu (sau khi tách chiết fucoidan) thì rửa sạch acid (pH = 5,5 ÷ 6,0) rồi được phơi khô Sau đó xử lý bã rong khô bằng dung dịch formaldehyde 1% theo tỷ lệ rong/nước là 1/10 (w/v), khuấy trộn đều, ngâm trong 24 giờ Lọc bằng túi vải, loại bỏ dung dịch, lấy bã rong, rửa nước loại bỏ formaldehyde Lọc bằng vải thô, loại bỏ dung dịch, lấy bã rong rửa bằng nước đến pH = 6,0 Chiết rong bằng nước theo tỷ lệ 1/15 (w/v), sau đó chỉnh pH của huyền phù bằng Na2CO3 đến pH

= 10, khuấy nhẹ huyền phù và ngâm trong 5 giờ tại nhiệt độ phòng (25 ÷ 35oC) Pha loãng huyền phù đến khi tỷ lệ rong/nước = 1/20, lọc qua lớp diatomit Dung dịch sau đó được đưa vào dung dịch CaCl2 10% theo tỷ lệ khối lượng CaCl2/alginate (có trong nguyên liệu thô) là 2,5/1, đồng thời khuấy nhẹ Hỗn hợp được lọc qua lưới kim loại, rửa tủa bằng nước cất Tẩy trắng tủa bằng dung dịch NaClO 5%, sau đó rửa tủa 03 lần bằng nước cất Tách nước khỏi tủa bằng ép tủa dưới áp suất, sấy kết tủa tại nhiệt độ 45oC thu được calcium alginate [27]

Nhìn chung, công nghệ chiết tách alginate từ rong nâu đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu Các kết quả nghiên cứu cho thấy tùy theo từng loài rong nâu mà có sự khác nhau về chế độ xử lý rong Hiệu suất tách chiết alginate từ rong nâu phụ thuộc vào các yếu tố công nghệ như nhiệt độ nấu chiết, pH nấu chiết, và chế độ nấu chiết sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt của alginate Độ nhớt của alginate là một trong những thông số quan trọng phản ánh chất lượng của sodium alginate thu nhận và ảnh hưởng đến hiệu suất thu nhận alginate Nếu độ nhớt của alginate thấp tức alginate ngắn mạch Khi cấu trúc mạch alginate bị cắt ngắn trong quá trình nấu chiết thì hiệu suất thu hồi alginate thấp Sở dĩ có hiện tượng này là do alginate mạch phân tử ngắn khó bị kết tủa bởi cồn Hiệu suất tách chiết và độ nhớt của alginate có liên quan mật thiết với nhau trong quá trình nấu chiết alginate từ rong nâu Ở Việt Nam, các nghiên cứu về công

nghệ chiết tách alginate chưa được quan tâm đúng mức và hiện không còn cơ sở nào ở Việt Nam sản xuất alginate Alginate có trên thị trường Việt Nam chủ yếu là được nhập khẩu từ nước ngoài

Nghiên cứu tách chiết alginate từ bã rong nâu đã được Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang nghiên cứu trong thời gian từ năm 2008 ÷ 2010 Theo đó,

bã thải rong nâu sau khi chiết fucoidan sẽ được tận dụng để chiết rút alginate Tuy nhiên, luận án nhận thấy nghiên cứu này có một số hạn chế như sau: (1) Bã rong nâu sau khi tách chiết fucoidan được phơi khô, sau đó mới chiết tách alginate Việc làm khô sau đó lại ngâm chiết sẽ dẫn đến tốn kém năng lượng, dung môi chiết rút, trong khi

bã thải rong có thể sử dụng ngay cho việc chiết tách alginate; (2) Sử dụng formaldehyde

để khử màu của bã rong 24 giờ trước khi tách chiết alginate Việc sử dụng formaldehyde

sẽ gây ảnh hưởng đến sức khỏe và gây ô nhiễm môi trường, đồng thời cũng ảnh hưởng đến độ nhớt và khối lượng phân tử của alginate; (3) Sản phẩm thu được là calcium alginate không tan trong nước, để chuyển về dạng sodium alginate hòa tan được trong nước cũng khá phức tạp và quy trình có quá nhiều công đoạn; (4) Quy trình sản xuất alginate chưa quan tâm đến độ nhớt của alginate, chưa đánh giá được chất lượng alginate và cũng chưa xác định được các đặc tính cấu trúc của alginate

Từ tất cả các phân tích ở trên cho thấy để hoàn thiện quy trình nấu chiết alginate

từ rong nâu thì yếu tố độ nhớt của alginate là một thông số quan trọng, cần phải quan

tâm hàng đầu

1.3 ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP

Alginate là co-polymer mạch thẳng được tạo thành từ hai monomer là acid  - D

- mannuronic và acid  - L - guluronic được nối với nhau qua liên kết glycosidic (14) Hiện có thể sử dụng tác nhân vật lý, hóa học và sinh học để cắt đứt liên kết glycosidic trong phân tử alginate và tạo thành các phân tử alginate có khối lượng phân tử thấp

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới điều chế alginate khối lượng phân tử thấp 1.3.1.1 Điều chế alginate khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp vật lý

Sử dụng phương pháp chiếu xạ tia γ (Co-60) được Mollah và cộng sự (2009) nghiên cứu xử lý dung dịch sodium alginate 3% với liều lượng chiếu xạ 3,5 kGy/ giờ để điều chế alginate khối lượng phân tử thấp Kết quả nghiên cứu cho thấy độ nhớt của alginate ban đầu là 30,75 centipoise giảm tương ứng là 5,97; 4,62; 4,83 và 4,56

centipoise khi liều lượng chiếu xạ tăng từ 12,5; 25; 37,5 và 50 kGy Khối lượng phân tử trung bình của alginate giảm tương ứng từ 10 kDa xuống 1 kDa [162] Cũng bằng phương pháp này, tác giả El-Mohdy (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ từ 20 ÷ 100 kGy, đồng thời có sử dụng kết hợp với potassium per-sulfate (KPS)

để giảm liều lượng chiếu xạ Kết quả cho thấy alginate chiếu xạ có khối lượng phân tử thấp nhất ở 100 kGy và có KPS, ngược lại thì sản phẩm có khối lượng phân tử lớn khi chiếu xạ ở liều lượng 20 kGy và không có KPS [66]

Sử dụng phương pháp cắt mạch alginate bằng bức xạ tia tử ngoại (UV) kết hợp với

sử dụng chất xúc tác titanium dioxide (TiO2) được Buranaosot và cộng sự (2009) nghiên cứu Kết quả nhận thấy khối lượng phân tử trung bình của alginate sau chiếu xạ phụ thuộc vào pH, thời gian tiếp xúc tia bức xạ tử ngoại và điều kiện tối ưu cho phản ứng cắt mạch là ở pH = 7, trong 3 giờ, khối lượng phân tử trung bình của alginate giảm gần 50%, từ 198 kDa xuống còn 96 kDa [46]

Sóng siêu âm cũng có khả năng cắt mạch alginate để tạo ra các alginate khối lượng phân tử thấp Feng và cộng sự (2017) đã sử dụng sóng siêu âm ở tần số 135 kHz để thủy phân alginate có khối lượng phân tử trung bình 192,7 kDa và kết quả tạo thành alginate

có khối lượng phân tử trung bình từ 35 kDa đến 73 kDa [76] Ở một nghiên cứu khác,

Hu và cộng sự (2013) sử dụng vi sóng 1600W ở 135oC trong 15 phút để thủy phân polyguluronate có khối lượng phân tử trung bình 6,1 kDa thành guluronate có khối lượng phân tử trung bình 3,2 kDa với hiệu suất phân cắt đạt 71% [109]

Phương pháp thủy nhiệt (180 ÷ 240oC) để cắt mạch sodium alginate cũng được một số nhà khoa học nghiên cứu Chẳng hạn, Aida và cộng sự (2010) đã sử dụng kỹ thuật thủy nhiệt (180 ÷ 240oC) để cắt mạch sodium alginate và nhận thấy quá trình cắt mạch tạo ra các oligosaccharide, monosaccharide và các sản phẩm phân hủy khác như acid lactic, acid glycolic Quá trình cắt mạch alginate lúc đầu giải phóng các mannuronic acid và tiếp sau đó giải phóng các guluronic acid Các monosaccharide tạo ra trong điều kiện thủy nhiệt là kết quả của tạo thành liên kết glycosid giữa các monomer với các thành phần chọn lọc khác trong chuỗi M-M, M-G và G-G hơn là các gốc tự do trong alginate Đây được xem là phương pháp thích hợp dùng để xác định cấu trúc mạch alginate [28]

Như vậy, đa số các nhà khoa học trên thế giới đã sử dụng kỹ thuật chiếu xạ hoặc

kỹ thuật đồng vận kết hợp giữa chiếu xạ và tác nhân hóa học để phân cắt alginate thành

alginate khối lượng phân tử thấp Tuy vậy, các nghiên cứu thuộc lĩnh vực này chưa đề cập đến hoạt tính và ứng dụng vào trong lĩnh vực thực phẩm của các alginate khối lượng phân tử thấp thu được sau phân cắt

1.3.1.2 Điều chế alginate khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp hóa học

Thủy phân alginate bằng tác nhân hóa học chẳng hạn như acid hay H2O2 đã được một số nhà nghiên cứu công bố Haug và cộng sự (1963) cho thấy alginate bị thủy phân bởi HCl ở pH = 3,8 Quá trình cắt đứt mạch alginate thực hiện ở liên kết giữa 2 mắc xích

M và G theo kiểu đứt mạch tự nhiên Thông thường sự thủy phân được thực hiện bằng acid loãng ở 100oC trong thời gian từ 6 đến 12 giờ [92] Trong một nghiên cứu khác,

vào năm 1966 các tác giả trên đã thực hiện việc thủy phân alginate từ rong Laminaria

digitata bằng acid oxalic 1M ở 100oC trong 5 giờ, điều chỉnh pH = 2,85 thu được 80 ÷ 90% phân đoạn hòa tan (mannuronic acid) và phân đoạn không hòa tan (guluronic acid) [93] Chandía và cộng sự (2001) cũng thủy phân sodium alginate bằng HCl 0,3M và gia nhiệt ở 100oC trong 0,5 giờ, làm nguội và ly tâm lần 1 Phần không hòa tan tiếp tục thủy phân với HCl 0,3M ở 100oC trong 2 giờ, ly tâm lần 2 Phần hòa tan trong 2 lần ly tâm đem trung hòa rồi kết tủa thu được các block heteropolymeric Phần không tan sau khi

ly tâm lần 2 được trung hòa, rồi sau đó điều chỉnh pH về 2,85 sau đó ly tâm thu được hai phân đoạn giàu mannuronic acid và guluronic acid [49] Cũng bằng phương pháp

này, Sari Chmayssem và cộng sự (2015) đã thủy phân alginate từ rong nâu S vulgare

và kết quả thu được guluronate và mannuronate với hàm lượng tương ứng là 32,6% và 22,3% [188]

Thủy phân alginate bằng H2SO4 đã được Muramatsu và cộng sự (1993) nghiên cứu Nhóm tác giả sử dụng 20 mL H2SO4 70% ở 30oC để thủy phân 2 gam mannuronate trong thời gian 25 phút và 2 gam guluronate trong 90 phút, trong quá trình thủy phân thỉnh thoảng có khuấy đảo Kết quả nghiên cứu đã thu nhận được các oligoguluronate

và oligomannuronate [164]

Điều chế acid alginic khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp thủy phân acid alginic bằng H3PO4 đã được nghiên cứu bởi Ikeda và cộng sự (2000) Theo nghiên cứu, tác giả sử dụng 5 gam acid alginic phân tán trong 85% H3PO4 (94 mL), thủy phân ở nhiệt độ phòng trong 1 đến 10 ngày Phân đoạn không hòa tan là phân đoạn giàu polyguluronic acid được tách ra bằng cách lọc Phần dịch lọc được cho vào 400 mL nước Phần không tan trong nước được tách ra bằng phương pháp lọc, thu được phân

đoạn giàu polymannuronic acid Đối với phần hòa tan trong nước tiếp tục cho vào 2 lít methanol thu được kết tủa là phân đoạn luân phiên của polymannuronic acid và guluronic acid [112]

Thủy phân alginate bằng H2O2 được Li và cộng sự (2010) nghiên cứu và thu được các alginate có khối lượng phân tử thấp Alginate có khối lượng phân tử trung bình 254,5 kDa sau khi xử lý H2O2 ở 50oC và 80oC thì khối lượng phân tử trung bình của alginate còn lại tương ứng là 230 kDa và 143 kDa [132]

Bên cạnh việc sử dụng acid thủy phân alginate thu được các alginate khối lượng phân tử thấp Quá trình cắt mạch alginate còn diễn ra dưới tác động của tác nhân kiềm Haug và cộng sự (1963) nghiên cứu thấy rằng alginate bị thủy phân cắt mạch ở môi trường pH = 12 và quá trình cắt mạch diễn ra một cách tự nhiên [92] Còn theo nghiên cứu của Niemela và cộng sự (1985) đã cho thấy tùy theo nồng độ kiềm xử lý mà hàm lượng acid carboxylic được hình thành tương ứng từ 30 ÷ 70% so với alginate ban đầu,

do xảy ra phản ứng -elimination cắt mạch alginate [167]

1.3.1.3 Điều chế alginate khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp enzyme

Họ enzyme thủy phân cắt mạch alginate (alginate lyase) có hơn 50 loại khác nhau, được thu nhận từ rong biển, động vật biển không xương sống, vi sinh vật có nguồn gốc

từ biển và từ đất Enzyme thuộc nhóm này gồm có enzyme thủy phân cắt mạch mannuronate (mannuronate lyase) (EC.4.2.2.3) và enzyme thủy phân cắt mạch guluronate (guluronate lyase) (EC 4.2.2.11), đặc hiệu cắt đứt liên kết (14) glycosidic

theo kiểu -elimination

Nghiên cứu sử dụng enzyme để thủy phân alginate thành các alginate khối lượng phân tử thấp đã được một số tác giả công bố Các kết quả nghiên cứu đều cho thấy đó

là quá trình thủy phân có tính chọn lọc Khả năng cắt mạch alginate bởi enzyme từ các nguồn khác nhau cho thấy chúng có tính đặc hiệu: có loại enzyme chỉ thể hiện tính đặc hiệu thủy phân đối với liên kết của block acid guluronic, có loại enzyme thể hiện tính đặc hiệu thủy phân đối với block acid mannuronic Tuy nhiên, cũng có loại enzyme có khả năng thủy phân đặc hiệu đối với liên kết giữa acid mannuronic và acid guluronic Những enzyme có khả năng thủy phân đặc hiệu block guluronic acid đã được

nghiên cứu như enzyme thủy phân alginate thu nhận từ vi khuẩn phân lập từ rong S

fluitans, enzyme có khối lượng phân tử 38 kDa, điểm đẳng điện pI = 4,5 và hoạt động

mạnh khi có mặt của NaCl 0,5M [45] Enzyme thủy phân alginate thu nhận từ loài vi

khuẩn Enterobacter cloacae M-1 có khối lượng phân tử 38 kDa và 32 kDa, pI = 8,9, pH

thích hợp là 7,8, nhiệt độ thích hợp là 30oC, enzyme không bền với nhiệt, EDTA hoàn toàn ức chế hoạt tính của enzyme, nhưng hoạt tính của enzyme phục hồi lại được khi xử

lý với CaCl2 [166]

Những enzyme có khả năng thủy phân đặc hiệu block mannuronic acid đã được nghiên cứu Người ta nghiên cứu và nhận thấy enzyme thu nhận từ loài vi khuẩn

Pseudomonas syringae thích hợp để deacetyl acid mannuronic, có điều kiện thích hợp

cho hoạt động: pH = 7, nhiệt độ 42oC, NaCl 0,2M [174] Cả 2 loại enzyme thủy phân

cắt mạch alginate AkAly28 và AkAly33 thu nhận từ loài Sên biển Aplysia kurodai có

khối lượng phân tử tương ứng 28 kDa và 33 kDa đều có tác dụng thủy phân đối với mannuronate Nhiệt độ và pH thích hợp cho cả 2 enzyme này tương ứng là ở 40oC và

6,7 [177] Đối với enzyme thủy phân alginate thu nhận từ loài vi khuẩn Pseudomonas

alginovora chỉ tác dụng vào bộ đôi block M-M, nhưng không tác động vào giữa các

block M-MG, G-MM, hoặc G-MG [142]

Những enzyme có khả năng xúc tác đặc hiệu đối với cả block M và block G đã được một số nhà khoa học nghiên cứu, như: enzyme thu nhận từ loài vi khuẩn

Alteromonas sp strain H-4 phân lập từ rong nâu Laminaria có khối lượng phân tử 32

kDa, pI = 4,7, với hệ số Km (mg/mL) trong khoảng 20 lần [189] Enzyme thu nhận từ

loài vi khuẩn Vibrio sp YKW-34 có khối lượng phân tử 60 kDa, pI = 5,5 ÷ 5,7, pH thích

hợp là 7,0 và nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme ở 40oC Enzyme này ổn định trong pH = 7,0 ÷ 10,0 và nhiệt độ dưới 50oC, nhưng nó hoàn toàn bị mất hoạt tính bởi quá trình thẩm tách và khi tiếp xúc với Na+ hoặc K+ ở nồng độ 0,1M [82] Enzyme tách

chiết từ loài vi khuẩn Pseudoalteromonas sp SM0524 phân lập từ tảo bẹ có khối lượng

phân tử 32 kDa, nhiệt độ thích hợp 50oC và pH thích hợp là 8,5 Enzyme này được đánh giá là có triển vọng tốt trong sản xuất dimer và trimer từ alginate [129] Enzyme thu

nhận từ loài vi khuẩn có trong nước biển Sphingomonas sp MJ-3 có khả năng thủy phân

alginate thành các alginate monosaccharide và vi khuẩn sử dụng alginate monosaccharide như là nguồn carbon Hỗn hợp các monosaccharide đạt đến 3,3 mg/mL

từ 1% alginate (w/v) khi dùng 200 g/mL enzyme thủy phân alginate ở 30oC và pH=

6,5 [185] Enzyme thu nhận từ loài vi khuẩn Flavobacterium sp có khả năng thủy phân

alginate và có điều kiện thích hợp cho hoạt động là pH = 7 và nhiệt độ 40oC Quá trình

thủy phân dung dịch alginate 0,8% diễn ra mạnh mẽ và tạo ra oligosaccharide có độ

polymer hóa trung bình (DP) là 6,0 có tác dụng ức chế hoạt động của Pseudomonas

aeruginosa [32]

Ogura và cộng sự (2008) cũng tách chiết được enzyme thủy phân alginate từ loài

vi khuẩn Sphingomonas sp A1, enzyme này có khả năng thủy phân α-L-guluronate,

β-D-mannuronate và heteropolymer trong phân tử alginate [169]

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước điều chế alginate khối lượng phân tử thấp 1.3.2.1 Điều chế alginate khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp vật lý

Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp vật lý cũng được một số nhà khoa học ở Việt Nam nghiên cứu và đa số là các nghiên cứu sử dụng phương pháp chiếu xạ tia  (nguồn Co-60) để cắt mạch alginate Chẳng hạn, Hien

và cộng sự (2000) đã nghiên cứu chiếu xạ tia  (nguồn Co-60) vào dung dịch alginate 4% với liều lượng 100 kGy, alginate sau chiếu xạ có khối lượng phân tử dưới 104 [102] Trong khi đó, Luan và cộng sự (2003) sử dụng nguồn chiếu xạ Co-60 với cường độ chiếu xạ 75 kGy để chiếu vào dung dịch alginate 4% có khối lượng phân tử trung bình khoảng 9,04x105 Da, sản phẩm thu được là alginate phân tử lượng thấp, có khối lượng trung bình là 1,43x104 Da [140] Trong một nghiên cứu khác năm 2009, tác giả đã dùng tia  (nguồn Co-60) với liều lượng chiếu xạ 200 kGy chiếu vào dung dịch alginate có khối lượng phân tử trung bình 900 kDa, tỷ lệ M/G là 1,3 thu được các oligosaccharide

có khối lượng phân tử từ 1 kDa đến 3 kDa [141] Năm 2012, Luan và cộng sự nghiên cứu điều chế oligoalginate bằng 3 phương pháp: chiếu xạ  (nguồn Co-60), dùng H2O2

và kết hợp chiếu xạ với sử dụng H2O2 Khối lượng phân tử trung bình của oligoalginate thu được tương ứng là 7 ÷ 26 kDa, 40 ÷ 77 kDa và 11 ÷ 26 kDa Kết quả cho thấy khi

sử dụng H2O2 thì có tác dụng làm giảm liều lượng chiếu xạ và có thể ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nhằm giảm giá thành điều chế oligoalginate [139] Nguyễn Huỳnh Phương Uyên và cộng sự (2014) đã nghiên cứu hoàn thiện quy trình chế tạo oligoalginate bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp xử lý hóa học bằng H2O2 thu được oligoalginate có khối lượng phân tử 14 kDa ở liều 5 kGy + 0,5% H2O2, tương đương khối lượng phân tử oligoalginate thu được khi sử dụng liều chiếu xạ 75 kGy mà vẫn cho hiệu quả cao trên các đối tượng rau thủy canh ở nồng độ 75 ppm, nhưng có ưu điểm nổi trội là tiết kiệm thời gian và chi phí chiếu xạ, tăng hiệu quả kinh tế [25]

1.3.2.2 Điều chế alginate khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp hóa học

Thủy phân alginate bằng phương pháp hóa học để thu nhận alginate khối lượng phân tử thấp ở nước ta chưa được quan tâm nghiên cứu đúng mức Bởi vì nhu cầu sử dụng alginate ở nước ta trong một số lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm chủ yếu là alginate có khối lượng phân tử lớn, có độ nhớt cao Chính vì vậy, các nghiên cứu phần lớn tập trung nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng alginate trong quá trình nấu chiết làm cắt mạch alginate (kiềm, acid) hoặc tẩy màu alginate bằng H2O2 Khi

đó, sự cắt mạch alginate bởi các tác nhân hóa học là điều không mong muốn

Năm 2008, tác giả Chu Đình Kính và cộng sự nghiên cứu sử dụng HCl thủy phân alginate có khối lượng phân tử trung bình 77,75 kDa, tỷ lệ M/G = 1,05 như sau: 5 gam alginate hòa tan trong 500 mL HCl 0,3M, đun cách thủy ở 100oC trong 4 ÷ 5 giờ, để nguội rồi lọc thu kết tủa Pha loãng kết tủa bằng nước cất về dung dịch alginate khoảng 1% rồi điều chỉnh pH = 7 bằng NaOH 5M Dùng dung dịch HCl 0,25M điều chỉnh về

pH = 2,4 Ly tâm và tách được hai phần, phần kết tủa sấy khô thu được phân đoạn giàu acid guluronic Phần dịch hòa tan tiếp tục điều chỉnh về pH = 1,3 bằng HCl 0,25M, ly tâm rồi thu được kết tủa, sấy kết tủa thu được phân đoạn giàu acid mannuronic Các phân đoạn acid guluronic và acid mannuronic thu được có độ tinh sạch cao, khối lượng phân tử trung bình tương ứng là 21,177 kDa và 14,863 kDa và hiệu suất tương ứng là 29% và 6,9% [11]

1.3.2.3 Điều chế alginate khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp enzyme

Phương pháp thủy phân cắt mạch alginate bằng enzyme ở nước ta vẫn còn trong giai đoạn tìm kiếm, bước đầu đã có nghiên cứu tách chiết được enzyme thủy phân alginate từ một số nguồn vi khuẩn biển, vi khuẩn đất và động vật thân mềm

Nguyễn Ngọc Hữu (2008) đã nghiên cứu tách chiết được enzyme thủy phân

alginate từ loài vi khuẩn Klebsiella sp có hoạt độ xác định theo phương pháp độ nhớt

là 12 mL/20’ (nghĩa là với 12 mL dung dịch enzyme thủy phân cắt mạch alginate làm cho độ nhớt dung dịch alginate 1% giảm xuống 50% trong 20 phút) Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme từ 30 ÷ 40oC Mặt hạn chế của nghiên cứu này là enzyme thu được chưa tinh sạch, chưa xác định được khả năng xúc tác đặc hiệu của enzyme [10]

Nhược điểm khác đó là chủng vi khuẩn Klebsiella sp là chủng vi khuẩn có khả năng

gây bệnh ở con người Do vậy việc sử dụng chủng vi khuẩn này để sản xuất enzyme