β GALACTOSIDASE từ BACILLUS

Cho đến nay trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh βgalactosidase.Tuy nhiên việc nghiên cứu và đưa vào ứng dụng sản xuất của βgalactosidase có đặc tính chịu nhiệt, chịu axit còn rất hạn chế. Xuất phát từ thực tế đó mà chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme β galactosidase và bước đầu xác định một số đặc tính của enzyme ” được tiến hành.

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME β-GALACTOSIDASE VÀ BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Chữ viết tắt NA NB Abs v/v Cs B.sub Chữ tiếng Anh Nutrient Agar Nutrient broth Absorbance Volume/volume Nghĩa tiếng Việt Môi trường thạch dinh dưỡng Mơi trường canh thang Độ hấp thụ Thể tích/Thể tích Cộng Bacillus subtilis DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH PHẦN I - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Enzyme β-galactosidase gọi lactase, enzyme xúc tác cho trình thủy phân chuyển hóa gốc β-D-galactozyl, có thủy phân lactose thành glucose galactose (Davail cs, 1994) Nhờ khả phân giải lactose mà β-galactosidase sử dụng nhiều cho ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt ngành công nghiệp chế biến sữa sản phẩm từ sữa βgalactosidase sử dụng để thủy phân lactose nhằm làm tăng khả tiêu hóa sữa cho người bị dị ứng với lactose, cải thiện chức sản phẩm từ sữa, bổ sung vào trình lên men bơ sữa để tránh kết tinh lactose tăng độ sản phẩm Ngoài y dược, chúng sử dụng làm thuốc trợ tiêu hóa cho người thiếu khả hấp thụ lactose (Trương Nam Hải cs, 2004) Enzyme β-galactosidase có khả chịu nhiệt chịu pH axit đóng vai trò quan trọng q trình thủy phân lactose sản phẩm chế biến nhiệt độ cao sản phẩm sữa lên men Sữa thủy phân lactose sử dụng cho việc chế biến hương liệu, phô mai, sữa chua Sự thủy phân lactose sữa dùng sữa để ngăn ngừa kết tinh lactose chế biến sản phẩm sữa cô đặc, sản phẩm sữa cần gia nhiệt Hơn việc sử dụng βgalactosidase có khả hoạt động pH axit sản xuất sữa chua phomat làm tăng q trình axit hóa, thủy phân lactose thường bước làm chậm tốc độ trình, làm giảm thời gian đơng đặc sữa chua tăng tốc độ phát triển cấu trúc hương vị cho phomat (Parmjit S Panesar cs, 2010) β-galactosidase tìm thấy thực vật, vi khuẩn, quan động vật, nấm men, nấm mốc (Lê Xuân Phương, 2001) Trong số nguồn thu nhận enzyme từ động vật, thực vật, vi sinh vật việc thu enzyme từ vi sinh vật tỏ phương pháp ưu việt vi sinh vật sinh sản nhanh, sinh khối nhỏ, tỉ lệ enzyme tế bào lớn Mặt khác, môi trường dinh dưỡng lại rẻ tiền, dễ kiếm nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao tốn (Ngơ Xn Mạnh cs, 2006) Trong loài vi khuẩn nghiên cứu sản xuất βgalactosidase, vi khuẩn Bacillus nhà khoa học nghiên cứu nhiều loài vi khuẩn phân bố nhiều tự nhiên, tồn điều kiện khác nhau, nhiều loài coi an toàn thực phẩm Các enzyme ngoại bào vi khuẩn có đặc tính cao khả sinh enzyme mạnh so với enzyme ngoại bào vi sinh vật khác (Nguyễn Văn Cách cs, 2008) Vì dễ tìm chủng có enzyme đặc tính chịu nhiệt Cho đến giới Việt Nam có nhiều nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả sinh β-galactosidase.Tuy nhiên việc nghiên cứu đưa vào ứng dụng sản xuất βgalactosidase có đặc tính chịu nhiệt, chịu axit hạn chế Xuất phát từ thực tế mà đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả sinh enzyme β- galactosidase bước đầu xác định số đặc tính enzyme ” tiến hành 1.2 Mục đích, yêu cầu 1.2.1 Mục đích Tuyển chọn định danh vi khuẩn Bacillus có khả sinh enzyme β- galactosidase chịu nhiệt, chịu axit 1.2.2 Yêu cầu - Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus có khả sinh enzyme β-galactosidase - Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy phân có đặc tính chịu nhiệt - Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy phân có đặc tính chịu nhiệt, pH - Định danh chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy phân có đặc tính chịu nhiệt, pH phương pháp xác định trình tự gen 16S rRNA PHẦN II - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương enzyme β-galactosidase 2.1.1 Enzyme β-galactosidase β-galactosidase (β-D-galactoside galactohydrolase E.C.3.2.1.23) enzyme có khả xúc tác cho hai kiểu phản ứng: phản ứng thủy phân phản ứng chuyển gốc galactozyl Phản ứng thủy phân β-galactosidase thủy phân đường đôi lactose thành hai đường đơn glucose galactose, số trường hợp enzyme tham gia phản ứng transgalactosylation chuyển gốc galactose đến chất lactose tạo galactose-oligosaccharides (GOS) (Davail cs, 1994) Galactose-oligosaccharides với fructooligosaccharides nghiên cứu nhiều tạo prebiotic oligosaccharides có lợi cho người cách kích thích tăng trưởng hoạt động vi khuẩn có lợi hệ tiêu hóa người Hình 2.1 Sơ đồ thủy phân lactose enzyme β-galactosidase 2.1.2 Nguồn thu nhận Lactase tự nhiên tìm thấy loài thực vật, động vật vi sinh vật Tuy nhiên, tính chất enzym thu nhận từ nguồn khác có khác rõ rệt Enzyme sản xuất từ vi sinh vật ngày nhiều, giới vi sinh vật sử dụng nguồn sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp Nguồn enzyme từ động vật thực vật khó triển khai theo quy mơ cơng nghiệp hạn chế sinh lí hạn chế kỹ thuật So với động vật thực vật, vi sinh vật có nhiều ưu điểm (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Những ưu điểm là: Tốc độ sinh sản vi sinh vật mạnh Trong thời gian ngắn, ta thu lượng sinh khối lớn Nhiều nghiên cứu cho thấy ngày đêm, tốc độ tạo sinh khối vi sinh vật cao gấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng sinh khối động vật thực vật Để đạt tốc độ tăng sinh khối lớn vậy, vi sinh vật phải chuyển hóa khối lượng chất lớn Cũng từ nghiên cứu E.coli, nhiều nhà khoa học cho thấy vòng 24 giờ, vi khuẩn E.coli chuyển hóa khối lượng chất lớn ngàn lần khối lượng thể chúng Để chuyển hóa khối lượng chất lớn vậy, chúng phải tổng hợp lượng enzyme lớn Bởi vì, chuyển hóa chất tế bào enzyme đảm nhận Chính thế, sử dụng vi sinh vật nguồn sinh học để sản xuất enzyme có lợi Trong khoảng thời gian ngắn, ta thu lượng sinh khối lớn (để thu enzyme nội bào) mà thu lượng enzyme ngoại bào vừa nhiều, vừa có hoạt tính riêng cao Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao Ưu điểm gắn liền với tốc độ chuyển hóa chất gắn liền với tốc độ sinh sản phát triển vi sinh vật Vi sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp Trong sản xuất này, trình sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật hồn tồn khơng phụ thuộc vào khí hậu bên ngồi Trong đó, sản xuất enzyme từ nguồn thực vật động vật đưa vào quy mô công nghiệp Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền dễ kiếm Đây lợi quan trọng Nhờ đó, ta làm giảm giá thành sản phẩm sản xuất nơi giới 2.1.3 Enzyme β-galactosidase từ vi khuẩn β-galactosidase vi khuẩn dạng ngoại bào nội bào (Dalvai cs, 1994) Enzyme ngoại bào dễ tách, phá vỡ tế bào, không lẫn chung với thành phần nội bào, có enzyme ngoại bào khác, có tính bền vững mạnh, phương pháp tinh dễ rẻ tiền Enzyme nội bào khó tách, phải phá vỡ tế bào, thường lẫn chung với chất khác tế bào sau phá vỡ (axit nucleic, chất nguyên sinh, lipid,…), bền vững môi trường nội bào, phương pháp tinh khó thực hiện, quy trình cơng nghệ phức tạp, giá thành đắt β-galactosidase ngoại bào tổng hợp sau tiết ngồi tế bào tham gia vào trình thủy phân hợp chất hữu bên ngồi mơi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Đây enzyme thích ứng điển hình, tổng hợp mơi trường có lactose hay chất có cấu trúc tương tự lactose axit lactobiotic β-galactosidase vi khuẩn có khối lượng phân tử lớn (trên 100 kDa), thường hoạt động tối ưu 37ºC điều kiện mơi trường pH trung bình 6.0-8.0 (Trương Nam Hải cs, 2004) Vi khuẩn E.coli đối tượng nghiên cứu Cấu trúc bậc ba enzyme từ E.coli chế điều hòa phiên mã gen lacZ khẳng định tạo điều kiện cho việc nghiên cứu kỹ chế xúc tác enzyme Mặc dù vậy, việc sử dụng enzyme vào trình sinh học kiểm nghiệm quy mơ phòng thí nghiệm vi khuẩn khơng phép có mặt thực phẩm Lĩnh vực chủ yếu enzyme từ vi khuẩn E.coli nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ nghệ hóa miễn dịch Enzyme β-galactosidase từ Streptcoccus thermophiles – vi khuẩn sử dụng công nghệ chế biến sản phẩm lên men từ sữa sử dụng để thủy phân lactose sữa quy mơ cơng nghiệp tính bền nhiệt mà độ an toàn sử dụng dạng phụ gia thực phẩm Nó dùng làm chất xúc tác cho trình sản xuất galactose-oligosaccharides từ lactose hoạt tính chuyển hóa galactozyl cao Đối với vi khuẩn chúng phát triển tối ưu dải pH từ 6.5 đến 7.5 Chúng phát triển pH (Coenen cs, 2000) Một số β-galactosidase từ vi khuẩn để có hoạt tính cần phải có mặt ion hóa trị ion hóa trị Ví dụ βgalactosidase từ S.restivirgula cần phải có mặt nhiều ion kim loại hóa trị để đạt đến độ bền nhiệt hoạt tính tối đa Tuy nhiên số β-galactosidase khắc lại khơng cần có mặt ion kim loại enzyme từ Rhizobium melioti (Toru Nakayama cs, 1996) 2.1.4 Phương pháp thu nhận enzyme Để thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật, người ta dùng môi trường đặc trưng cho nhóm vi sinh vật Hiện nay, hai phương pháp nuôi mặt nuôi bề sâu hai phương pháp dùng phổ biến 2.1.4.1 Phương pháp nuôi bề mặt Theo Nguyễn Đức Lượng (2004) phương pháp ni mặt thích hợp cho q trình ni nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn Môi trường nuôi cấy rắn xốp Phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, khơng đòi hỏi cao thiết bị, khơng đòi hỏi vơ trùng tuyệt đối Tuy nhiên, lại có nhược điểm tốn diện tích mặt bằng, khó khí hóa, khó tự động hóa tồn q trình, chi phí nhân cơng, điện nước… cho sản phẩm cao, sản phẩm tạo thành không tinh 2.1.4.2 Phương pháp nuôi bề sâu 10 Kết bảng 4.2 cho thấy 26 chủng có hoạt tính βgalactosidase có chủng NT2.7, NT2.8, ĐT1, ĐT2, B1.1 B1.8 cho màu xanh đậm thời gian có màu xanh 24h đầu coi chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme β- galactosidase cao Chủng có màu sắc đậm thời gian có màu xanh sớm chủng NT2.8 chủng sử dụng để tiếp tục xác định hoạt độ enzyme 4.2 Xác định hoạt độ enzyme β–galactosidase vi khuẩn Bacillus theo phương pháp sử dụng chất oNPG Dựa vào kết định tính chúng tơi tiến hành bước định lượng enzyme β-galactosidase chủng vi khuẩn Bacillus tuyển chọn (ở mục 4.1) Các chủng vi khuẩn hoạt hóa mơi trường NB có nguồn cacbon lactose làm môi trường để nuôi sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase Sau 24h, thu dịch nuôi cấy, li tâm 6000 vòng, 4ºC 10 phút Dịch ni cấy thu mang đặc 10 lần màng đặc có kích thước 10 kDa, enzyme đặc xác định hoạt độ mô tả mục 3.3.3 Kết xác định hoạt độ β-galactosidase chủng thể bảng 4.2 Bảng 4.2 Kết xác định hoạt độ β-galactosidase ngoại bào chủng vi khuẩn STT Tên chủng U/l `3 NT2.8 NT2.7 ĐT1 ĐT2 B1.1 B1.8 42.4 5.4 5.3 6.2 5.2 6.5 29 % so với chủng cao 100% 12.7% 12.5% 14.6% 12.3% 15.3% Dưạ vào bảng 4.2 nhận thấy chủng vi khuẩn chọn để xác định hoạt độ β-galactosidase chủng Bacillus NT2.8 cho hoạt tính cao, trội nhất, đạt 42.4 U/l Để so sánh hoạt độ chủng với chúng tơi lấy chủng NT2.8 có giá trị cao 100% để so sánh với chủng khác Nhận thấy chủng NT2.8 có giá trị cao nhiều lần so với chủng lại, hoạt độ chủng chiếm từ 12% đến 15% so với chủng NT2.8 Cụ thể, chủng NT2.7 chiếm 12.7%, chủng ĐT1 chiếm 12.5%, chủng ĐT2 chiếm 14.6%, chủng B1.1 chiếm 12.3% chủng B1.8 chiếm 15.3% so với chủng NT2.8 Kết xác định khả sinh βgalactosidase phương pháp đĩa thạch có tương đồng với phương pháp xác định hoạt độ enzyme Chọn chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8 cho nghiên cứu 4.3 Xác định đặc tính β-galactosidase từ chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8 4.3.1 Xác định vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy phân có đặc tính chịu nhiệt Nhiệt độ có tác động mạnh mẽ tới độ bền enzyme, gây ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác enzyme Để xác định tính bền nhiệt enzyme enzyme thơ ủ nhiệt độ 60ºC vòng 50 thời gian 30 phút, giờ, giờ, giờ,…, 50 mẫu enzyme lấy để xác định độ bền nhiệt mô tả mục 3.3.4 Kết thể bảng 4.3 hình 4.2 Bảng 4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến tính bền β-galactosidase tử chủng Bacillus NT2.8 Thời gian (giờ) Hoạt tính (U/l) 0.5 1.5 2.5 42.4 40.4 38.4 36.6 35.8 35.7 34.6 Hoạt tính tương đối (%) 100 95.6 90.6 86.3 84.5 84.1 81.7 30 Thời gian (giờ) Hoạt tính (U/l) 5.5 16 18 20 22 32.5 31.9 31.7 31.6 31.6 30.9 30.8 Hoạt tính tương đối (%) 76.7 75.2 74.8 74.5 74.5 72.8 72.7 3.5 4.5 33.7 32.7 32.6 79.5 77.1 76.9 24 30 50 31 30.6 30.1 29.9 72.3 71.1 70.5 Hình 4.2 Độ bền nhiệt β-galactosidase tử chủng Bacillus NT2.8 60ºC Kết bảng 4.5 hình 4.3 cho thấy enzyme bền nhiệt độ 60oC Trong hoạt enzyme lại 81.7%, 80% so với hoạt độ ban đầu Và theo dõi 50 ta thấy hoạt độ enzyme giảm dần với tốc độ chậm, enzyme bền, hoạt độ enzyme lại lại 70.5% so với hoạt độ sau 50 Từ kết ta kết luận chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8 có khả sinh enzyme β-galactosidase bền nhiệt độ 60ºC Kết tương tự kết Chen W cộng , 2008 nghiên cứu tính bền nhiệt β-galactosidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus stearothemophilus, 65ºC 50 hoạt độ enzyme giữ 50% so với hoạt độ ban đầu 4.3.2 Xác định vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy phân có đặc tính chịu nhiệt, pH = Chủng NT2.8 khảo sát có khả chịu nhiệt nhiệt độ 60ºC, kiểm tra khả chịu pH = 4, độ bền enzyme pH = Enzyme ủ dung dịch đệm với pH để 30ºC, sau khoảng thời gian xác định hoạt độ enzyme so sánh hoạt độ với hoạt độ enzyme ban đầu, kết thể bảng 4.4 hình 4.6 sau: 32 Bảng 4.4 Độ bền β-galactosidase pH Thời gian (giờ) Hoạt tính (U/l) 0.5 1.5 68.9 67.4 64.3 61.5 58.8 55.6 54.9 52.1 51.6 Hoạt tính tương đối (%) 100 97.8 93.2 89.2 85.2 80.6 79.7 75.5 74.8 Thời gian (giờ) Hoạt tính (U/l) 24 50 72 96 144 168 360 480 50.1 50.1 50.1 50.0 49.4 49.3 47.5 44.5 39.7 Hoạt tính tương đối (%) 73.5 73.5 73.4 72.6 71.6 71.5 68.9 64.5 57.5 Hình 4.3 Độ bền enzyme pH Kết bảng 4.4 hình 4.3 cho thấy enzyme bền pH = Sau hoạt độ enzyme 80.6% Sau 144 hoạt độ enzyme giảm 28.5% lại 71.5% so với hoạt tính ban đầu Sau 20 ngày theo dõi hoạt độ enzyme lại 57.5%, 50% so với hoạt độ ban đầu Kết luận: β-galactosidase từ chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8 có độ bền nhiệt bền pH = cao Đã có nghiên cứu Shaikh SA, 1999, nghiên cứu enzyme β-galactosidase sinh từ loại nấm ưa nhiệt Rhizomucor sp có khả bền nhiệt độ 60ºC, pH 4.5, enzyme ổn định 60ºC, pH 4.5 vòng Hoạt độ enzyme lại 50% so với ban đầu 2.5 Kết cho thấy độ bền nhiệt bền pH4 vi khuẩn Bacillus NT2.8 cao nhiều so với nghiên cứu trước Chưa có nhiều nghiên cứu khả sinh chịu nhiệt, chịu ph vi khuẩn Khả sinh enzyme chịu nhiệt vi khuẩn Bacillus chủ yếu hoạt động pH trung tính (Chen cs, 2008) Vì việc ứng dụng khả sinh β- 33 galactosidase chịu nhiệt chịu pH axit vi khuẩn Bacillus NT2.8 vào thực phẩm có tiềm cao 4.4 Định danh chủng tuyển chọn phương pháp xác định định trình tự gen 16S rRNA Kết định tính, định lượng kiểm tra đặc tính enzyme cho thấy vi khuẩn Bacillus NT2.8 có khả sinh enzyme β-galactosidase cao, có khả chịu nhiệt 60ºC chịu pH = tốt Vì chúng tơi tiến hành xác định danh tính vi khuẩn phương pháp phân tích sinh học phân tử 4.4.1 Kết tách chiết DNA tổng số DNA tổng số sau tách chiết kiểm tra độ tinh cách chạy điện di agarose M Bs Hình 4.4 Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ sinh khối vi khuẩn chủng Bacillus NT2.8 Giếng số 1: Thang DNA chuẩn 100 bp DNA ladder, New England Biolabs Giếng số 2: DNA tổng số tinh Kết thể hình 4.4 cho thấy mẫu tách chiết xuất vạch lớn so với thang DNA chuẩn Kết khẳng định DNA tổng số sạch, sử dụng cho chạy phản ứng PCR 34 4.4.2 Kết PCR với cặp mồi 27F/1492R Để định danh xác chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8 phân lập từ nước thải nhà máy sữa, tiến hành thực phản ứng PCR với cặp mồi 27F 1492R để nhân tồn vùng gen mã hóa tiểu phần 16S RNA ribosome Kết PCR thể hình 4.5 M Bs ~ Hình 4.5 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA từ DNA tổng số chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8 Giếng số 1: Thang DNA chuẩn thang DNA chuẩn 100 bp DNA ladder, New England Biolabs Giếng số 2: DNA tổng số tinh Kết PCR cho thấy mẫu vi khuẩn NT2.8 tạo băng sản phẩm ~ 1500bp dự định Sản phẩm PCR tinh từ agarose sử dụng làm khuôn để giải trình tự 4.4.3 Kết xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA Sản phẩm PCR tinh xác định trình tự hãng First-base, Malaysia Kết giải trình tự cho thấy sản phẩm giải trình tự có chất lượng tốt Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng Bacillus NT2.8: CTATACATGCAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACG GGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGC 35 TAATACCGGATAACATTTTCTCTTGCATAAGAGAAAATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACT TACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACG ATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACT CCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG CCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTAC AAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCG CGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTG GAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAAT GCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGC TGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA ACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAG CACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCC GCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTT GACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTG GTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttga tcttagttgccagcattaagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgac gtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggctgcaagaccg cgaggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaa tcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccac gagagtttgtaacacccgaagtcggtggggtaacctttatggagccagccgcctaa 4.4.4 Kết tìm kiếm chuỗi tương ứng ngân hàng gen Trình tự nucleotide đoạn gen 16S rRNA sau xác định trình tự mục 4.4.3 sử dụng để Blast lên ngân hàng liệu NCBI để nhận diện loài Kết blast cho thấy Bacillus NT2.8 phân lập từ nước thải nhà máy sữa vi khuẩn Bacillus flexus đặt tên Bacillus flexus NT2.8 Đã có nhiều nghiên cứu vi khuẩn Bacillus flexus có khả sinh enzyme ngoại bào có ứng dụng nhiều ngành cơng nghiệp Theo nghiên cứu Thirumalai Maruthiah cs, 2014 vi khuẩn Bacillus flexus có khả sinh enzyme protease, enzyme tinh muối amoni sulfat sắc kí lọc, enzyme có hoạt động cao pH 40ºC Nghiên cứu Francois cs, 2014 vi khuẩn Bacillus flexus XJX-1 có khả sinh đồng thời enzyme amylase kiềm, lipase kiềm protease kiềm, xác định môi trường tối ưu nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme Các enzyme 36 sử dụng công thức chất tẩy rửa, vi khuẩn khai thác thương mại để tiết enzyme có tính kiềm để sử dụng công nghiệp chất tẩy rửa Đây báo cáo cho sản xuất đồng thời enzyme loại vi khuẩn Các nghiên cứu chủ yếu sinh enzyme ngoại bào hoạt động pH kiềm, ứng dụng ngành công nghiệp chế biến chất tẩy rửa Chưa tìm thấy nghiên cứu nói vi khuẩn Bacillusb flexus có khả sinh β-galactisidase bền nhiệt hoạt động pH Vì nghiên cứu nghiên cứu khả sinh β-galactisidase vi khuẩn β-galactisidase mang đặc tính bền nhiệt bền pH có ứng dụng cao cơng nghiệp thực phẩm nói chung nghành cơng nghiệp sữa nói riêng 37 PHẦN V - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - 24/160 chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu có kết sinh enzyme β-galactosidase định tính mơi trường có X-gal chất cảm ứng IPTG Trong chủng (NT2.7, NT2.8, ĐT1, ĐT2, B1.1, B1.8) có màu xanh đậm thời gian xuất màu sớm tuyển chọn để tiến hành xác định hoạt tính enzyme - Từ chủng tuyển chọn, sau xác định hoạt tính enzyme đãxác định chủng NT 2.8, có hoạt độ cao đạt 42.4 U/l trội sử dụng để kiểm tra tính bền nhiệt độ 60ºC độ bền pH - Kết xác định đề bền nhiệt, pH β-galactosidase từ chủng Bacillus NT 2.8 sau + Độ bền nhiệt: Enzyme bền nhiệt 60ºC, sau 50h 70.5% so với hoạt độ ban đầu + Độ bền pH 4: Enzyme bền pH cao, sau 20 ngày hoạt độ enzyme lại 57.5% so với hoạt độ ban đầu - Đã giải trình tự định danh chủng Bacillus NT 2.8 vi khuẩn Bacillus flexus đặt tên Bacillus flexus NT 2.8 5.2 Kiến nghị Do thời gian thực tập điều kiện nghiên cứu hạn chế nên đạt số nghiên cứu Trước sản xuất ứng dụng β-galactosidase vào thực tế, số nghiên cứu cần tiến hành: - Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus flexus NT 2.8 đến khả sinh β-galactosidase - Tiến hành xác định hoạt độ enzyme nội bào đặc tính enzyme nội bào - Tinh xác định đặc tính enzyme để có định hướng ứng dụng 38 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Văn Cách, Bùi Thị Hải Hòa, Đặng Thị Thu (2008), Tách, tinh chế xác định đặc tính β-galactosidase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 3, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, 287289 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nôi, Tập 3 Trương Nam Hải (2004), Nghiên cứu, phân lập tạo chủng giống kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzyme betagalactosidase có hiệu suất cao ứng dụng thực phẩm, Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Ngơ Xuân Mạnh, Võ Nhân Hậu, Nguyễn Thị Tú (2006), Nghiên cứu điều kiện tối ưu cho việc thu nhận α-amylase chịu nhiệt từ vi khuẩn Bacillus lichenifomis, Tạp chí Khoa học Nông nghiệp, số 5,1 Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh công nghiệp, Nhà xuất Xây dựng Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Trần Văn Giang (2008), Nhân dòng phân tích trình tự gene mã hoá β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilis G1, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, NXB Khoa học Kỹ thuật, 908 Đặng Thị Thu cộng (2012), Công nghệ enzyme, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Thị Trần Thụy (2009), Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm, luận văn thạc sĩ trường Đại học sư phạm TP HCM, 40 10 Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007), Tương lai ứng dụng enzyme xử lý phế thải,Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 23, 75-85  Tài liệu tiếng Anh 11 Bhalla TC, Devi A, Angmo K, Thakur N, Kumari A (2015) βGalactosidase from Lactobacillus brevis PLA28: Purification, Characterization and Synthesis of Galacto-oligosaccharides J 12 Food Ind Microbiol 1:104 Chen W, Chen H, Xia Y, Zhao J, Tian F, Zhang H (2008), Production, purification, and characterization of a potential thermostable galactosidase for milk lactose hydrolysis from 13 Bacillus stearothermophilus J Dairy Sci May; 91(5):1751-8 Coenen, T.M.M; Bertens, A.M.C; Hoog, S.C.M.de; Verspeek Rip, C.M (2000) Safety evaluation of a lactase enzyme perpartion derived from Kluyveromyces lactic Food-ang-Chemical- 14 Technology, 671-677 Davail, S.; Feller, G.; Narinx, E.; Gerday, C (1994) Cold 15 adaptation of protein J Biol Chem, 269 Driks A (1999) Bacillus subtilis spore coat, Microbiology and 16 Molecular Biology Reviews 63 Francois N, Sunils More (2014), Concomitant production of detergen compatible rnzymes by Bacillus flexus XJX-1, Braz J 17 Microbiol Vol.45 no.3 Harju M, Kallioinen H, Tossavainen O (2012), Lactose hydrolysis and other conversions in dairy products: technological aspects, 18 Int Dairy J, 22, 104-109 Li JM, Chiou CY, Lee TR, Chen YS, Shaw GC (2005), Identification of a lactose-responsive element upstream of the promoter of Bacillus megaterium -galactosidase-encoding gene 19 mbgA, Cur Microbiol 51, 31-34 Li Y, Wang H, Lu L, Li Z, Xu X, Xiao M (2008), Purification and characterization of a novel 41 β-galactosidase with trans glycosylation activity from Bacillus megaterium 2-37-4, Appl 20 Biochem Biotechnol, 158(1): 192-9 Mirac Yilmaz et al (2006), Antimirobial activities of some 21 Bacillus spp, Microbiological Research 161, 127-131 Nakayama T, & Amachi T (1999), β-galactosidase, enzymology, In: Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation (Flickinger, M.C., Drew, S.W., 22 Eds), John Wiley and Sons, New York, NY, vol 3, 1291-1305 Nguyen H A, Nguyen T H, Kren V, Eijsink V G H, Haltrich D, Peterbauer C K Characterization (2012), of an Heterologous Expression N-Acetyl-β-D-hexosaminidase and from Lactococcus lactis ssp lactis IL1403, J Agric Food Chem, 60 23 (12), 3275-81 Park AR, Oh DK (2010), Galacto-oligosaccharide production using 24 microbial beta-galactosidase: current state and perspectives, Appl Microbiol Biotechnol 85, 1279-1286 Parmjit S Panesar, Shwta Kumari and Reeba Panesar (2010), Protential Applications of Ininiobilized β-galactosidase in Food Prossesing Industries, SAGE-Hindawi Access to Research, Enzyme 25 Research, Article ID473/37, 16 page Priest FG and Grigorova R (1991), Method for studying the ecology 26 of endospore- forming bacteria, Method in microbiology 22, 565-591 Rosovitz M J, Voskuil M I, Chambliss G (1998), Bacillus, In: A Balows and B I Duerden (Eds), Systematic Bacteriology Arnold 27 PRESS, London: 709-720 Rosenberg M, Mlishova Z, Current trends of β-galactosidase application in food technology, J Food Nutr Res, 45, 47-54 28 Shaikh SA, Khire JM, Khan MI (1999), Characterization of a thermostable extracellular beta-galactosidase from a thermophilic fungus Rhizomucor sp Biochim Biophys Acta, 29 1472: 314-322 Thu Ha Nguyen, Barbara Splechtna, Marlene Steinock, Wolfgang Kneifel, Hans Peter Lettner, Klaus D Kulbe and Dietmar Haltrich (2006), Purification and Characterization of 42 Two Novel β-Galactosidases from Lactobacillus reuteri, J Agric 30 Food Chem, 54, 4989-4998 Toru Nakayama, Teruo Amachi (1996), Beta – galactosidaza enzymology Encyclopaedia of Food science, food technology 31 and nutrion Vol.3.Academic Press, 1291 – 1305 Xia Y, Zhao J, Chen H, Liu X, Wang Y, Tian F, Zhang H P, Zhang H, Chen W (2010), Extracellular secretion in Bacillus subtilis of a cytoplasmic thermostable β-galactosidase from Geobacillus 32 stearothermophilus, J Dairy Sci Jul,93(7).2838-45 Zeigler, Daniel R (2001), The Genus Geobacillus, Bacillus Genetic Stock Center 3: 7-11 43 ... thấy nguồn gen mã hóa β- galactosidase phân lập từ nguồn vi khuẩn khác tạo dòng biểu E.coli Một số cơng trình cơng bố tạo dòng biểu β- galactosidase từ Lactobacillus reuteri 103X Bacillus megaterium... 15 2.2.3 Khả sinh β- galactosidase vi khuẩn Bacillus Các chủng vi khuẩn Bacillus có khả tổng hợp mạnh mẽ đồng thời nhiều enzyme khác enzyme định đó, β- galactosidase từ vi khuẩn Bacillus ổn định,... sinh enzyme β- galactosidase chịu nhiệt, chịu axit 1.2.2 Yêu cầu - Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus có khả sinh enzyme β- galactosidase - Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β- galactosidase