ENZYME HUA THUY VA DAO 20 12 2015

1 Tình hình nghiên cứu enzyme 1.1 Vấn đề nghiên cứu enzyme nước ta Hầu phản ứng hoá học thể sống cần phải có vai trò xúc tác enzyme - chất xúc tác sinh học Chính vậy, nghiên cứu enzyme thu hút quan tâm cán hoá sinh học, sinh học thực nghiệm nhiều nhà nghiên cứu lĩnh vực liên quan khác Trước kỷ XVII, người ta biết sử dụng q trình enzyme đời sống song có tính chất kinh nghiệm thực tế thơng qua hoạt động vi sinh vật Ðó q trình lên men rượu, muối dưa, làm tương nước chấm Ở thời kỳ người ta chưa hiểu chất enzyme trình lên men Cho đến đầu kỷ XIX nhà khoa học khái quát trình lên men tượng phổ biến sống vai trò quan trọng enzyme chuyển hố chất q trình lên men Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh enzyme, tạo chế phẩm có độ khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan cấu trúc hoạt tính sinh học enzyme, khả ứng dụng enzyme thực tế Nghiên cứu công nghệ enzyme tiến hành nhiều tác sử dụng phủ tạng lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase Đã có thử nghiệm cơng nghệ sản xuất amino acid từ nhộng tằm protease, bột protein thịt bromelain từ đọt dứa, lên men rượu enzyme cố định cột Cũng có nghiên cứu sử dụng peroxydase, cyt-P450 chế tạo biosensor thuốc phát chất độc Trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu chế tác dụng số enzyme nhằm mục đích kiến tạo nên số thuốc dùng điều trị số bệnh đặc biệt tạo số chế phẩm thuốc chống suy dinh dưỡng trẻ em, đồng thời tiến hành sản xuất đại trà Đây đóng góp thiết thực kịp thời việc phòng chống suy dinh dưỡng nước ta 1.2 Cơng nghệ sản xuất enzyme giới Đến nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme loại phát triển mạnh mẽ qui mô công nghiệp, hàng năm lượng enzyme sản xuất giới đạt khoảng 300.000 với giá trị 500 triệu USD Thực tế có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán thị trường giới, chế phẩm enzyme phổ biến amylase, protease, catalase, glucoseoxydase, cellulase, lipase…Các chế phẩm khai thác tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn cơng nghiệp ứng dụng Đến việc nghiên cứu enzyme bước vào giai đoạn với kết hợp nhiều ngành khoa học khác hoá học protein, lý sinh phân tử, sinh học phân tử…Trong nghiên cứu thu nhận, tinh chế enzyme, hay thiết kế định hướng phân tử enzyme ưu việt dạng tự nhiên Chế phẩm enzyme không ứng dụng y học mà ứng dụng nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, nông nghiệp, hóa học… Do vậy, q trình thu nhận tinh protein/enzyme giữ vai trò quan trọng không ngừng cải tiến để đạt độ tinh cao để phục vụ cho người Giới thiệu chung enzyme 2.1 Định nghĩa Enzyme (E) protein có khả xúc tác cho phản ứng hoá học với mức đặc hiệu khác nhiệt độ tương đối thấp E có tất tế bào sống, chất xúc tác sinh học Trong phản ứng E xúc tác phân tử lúc bắt đầu trình gọi chất (substrate), E biến đổi chúng thành phân tử khác E có hiệu suất xúc tác lớn tất chất xúc tác hữu vơ khác E khơng xúc tác phản ứng thể sống, mà sau tách khỏi hệ thống sống chúng giữ hoạt tính xúc tác điều kiện định Có 4000 phản ứng sinh hóa xúc tác enzym E có tính đặc hiệu cao, nghĩa E tác dụng hay số S (cơ chất) định nhiệt độ áp suất bình thường 2.2 Nguồn thu nhận enzyme Enzyme chất xúc tác sinh học, có nhiều thể sống Việc điều chế chúng phương pháp hóa học với số lượng lớn việc làm khó khăn đầy tốn khơng muốn nói điều không tưởng, nên người ta thường thu nhận chúng từ nguồn sinh học Mặc dù enzyme có tất quan, mô động vật thực vật tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme đáp ứng yêu cầu mặt kinh tế tiến hành nguyên liệu có chứa lượng lớn enzyme chophép thu enzyme với hiệu suất cao dễ dàng tinh chế chúng Việc phân bố enzyme tế bào không đồng đều, loại tế bào có nhiều enzyme song khơng có enzyme khác Lượng enzyme lại thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng phát triển sinh vật tùy theo lồi nên phải chọn nguồn ngun liệu thích hợp cho việc chiết rút tinh chế enzyme Có ba nguồn nguyên liệu sinh học bản: - Các mô quan động vật - Mô quan thực vật - Tế bào vi sinh vật 2.2.1 Các mô quan động vật Trong tất ngun liệu có nguồn gốc động vật tuyến tuỵ, màng nhầy dày, tim dùng để tách enzyme thuận lợi Dịch tuỵ tạng có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease số enzymekhác Từ ngăn tư dày bê nghé người ta thu nhận chế phẩm renin để làm đông sữa sản xuất fomat Người ta sản xuất pepsin từ dày động vật Nhưng khác với pepsin, renin có khả đông tụ sữa cao mà không thủy phân sâu sắc casein Renin chế phẩm enzyme có giá trị lớn công nghiệp 2.2.2 Mô quan thực vật Ở thực vật: Thơng thường enzyme hay có mặt quan dự trữ hạt, củ, Ví dụ hạt thầu dầu có nhiều lipase, hạt đậu tương có nhiều enzyme urease Thóc nảy mầm chứa nhiều α - amylase, củ khoai lang lại có nhiều β - amylase Người ta thu số chế phẩm enzyme thủy phân papain, bromelain, fixin từ thực vật bậc cao Papain thu từ mẫu nhựa đu đủ xanh, bromelain thu từ phận (lá, thân, quả) dứa… Qua nguồn ngun liệu động, thực vật từ chiết xuất chế phẩm enzyme, thấy hai nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất chế phẩm enzyme với quy mô lớn nhược điểm sau đây: - Chu kỳ sinh trưởng chúng dài - Nguồn nguyên liệu không cải tạo - Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) dùng làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn chế phẩm enzyme nhằm thoả mãn nhu cầu kinh tế quốc dân Dùng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất chế phẩm enzyme có nhiều ưu điểm bật có tính chất độc đáo vượt xa so với nguồn nguyên liệu từ động vật, thực vật, khắc phục khó khăn hạn chế 2.2.3 Tế bào vi sinh vật Trước hết vi sinh vật nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn Đây nguồn nguyên liệu mà người chủ động tạo Chu kỳ sinh trưởng vi sinh vật ngắn (từ 16 - 100 giờ) ni cấy hàng trăm lần năm Enzyme vi sinh vật có hoạt tính mạnh, vượt xa sinh vật khác Vì cần lượng nhỏ enzyme chuyển hóa lượng lớn chất Số liệu tính tốn cho biết, vòng 24 giờ, vi sinh vật có khả chuyển hóa lượng thức ăn gấp 30 - 40 lần so với trọng lượng thể chúng Trong đó, hệ enzyme lợn 50 kg chuyển hóa vài kg thức ăn ngày Hệ enzyme vi sinh vật vô phong phú Vi sinh vật có khả tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, có enzyme động, thực vật khơng tổng hợp Ví dụ cellulase, raxemase Phần lớn thức ăn để nuôi vi sinh vật lại dễ kiếm giá rẻ Nhiều vi sinh vật cho enzyme thường có khả phát triển môi trường đơn giản, giá rẻ, dễ kiếm phế liệu ngành sản xuất Hơn nữa, dùng nguyên liệu thực phẩm, dung dịch muối vơ để ni visinh vật Vì dùng vi sinh vật làm nguồn thu enzyme mang lại giá thành rẻ, thời gian nhanh hiệu kinh tế cao Vi sinh vật sinh sản phát triển với tốc độ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, tỷ lệ enzyme tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao Lượng enzyme sản xuất thời gian ngắn Đối với số trường hợp dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme Vi sinh vật nhạy cảm tác động môi trường, thành phần dinh dưỡng nuôi chúng số tác nhân lí hóa, học khác Do thay đổi điều kiện nuôi cấy để chọn giống tạo chủng đột biến cho ta hàm lượng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao Có thể nói rằng, nhờ nguồn enzyme vi sinh vật, người ta điều khiển tổng hợp enzyme dễ dàng nguồn nguyên liệu khác để tăng lượng enzyme tổng hợp tổng hợp định hướng enzyme Tuy trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lưu ý số vi sinh vật có khả sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp Nói chung vi sinh vật muốn sử dụng làm nguồn nguyên liệu tách enzyme cần phải thoả mãn điều kiện sau: - Khả tổng hợp enzyme mạnh thời gian ngắn - Dễ tách enzyme khơng sinh độc tố Có điều lí thú là: Trong điều kiện bình thường, vi sinh vật tổng hợp lượng enzyme vừa đủ cho hoạt động sinh lý thể chúng (thường gọi tổng hợp enzyme "bản thể") Nếu tăng hàm lượng số chất thêm số chất vào môi trường nuôi cấy, đặc biệt chất enzyme, tổng hợp enzyme tương ứng tăng lên cách đáng kể, khác thường có tổng hợp enzyme tượng gọi cảm ứng sinh tổng hợp enzyme Chất gây nên cảm ứng sinh tổng hợp gọi chất cảm ứng Sự tổng hợp lượng đáng kể enzyme gọi siêu tổng hợp enzyme Để thu nguồn enzyme dồi từ vi sinh vật, cần phải ni cấy chúng Có hai phương pháp ni cấy vi sinh vật để thu enzyme phương pháp nuôi cấy bề mặt phương pháp nuôi cấy bề sâu phương pháp phương pháp chìm Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt, người ta cho vi sinh vật phát triển bao phủ bề mặt hoạt chất dinh dưỡng rắn, để làm ẩm, dùng làm môi trường (cám gạo, cám nếp, bắp xay nhỏ ) Để môi trường xốp người ta trộn thêm lượng nhỏ mạt cưa Sau nuôi đủ thời gian để vi sinh vật tổng hợp enzyme môi trường sấy nhẹ, nghiền nhỏ Chế phẩm thu dạng rắn thơ Muốn có chế phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tách tinh chế enzyme Khác với phương pháp nuôi cấy bề mặt, phương pháp nuôi cấy bề sâu người ta cho vi sinh vật phát triển mơi trường lỏng Ngun liệu phổ biến dịch đường glucose, fructose, maltose, saccharose dịch thủy phân cellulose, tinh bột Nguồn nitơ hữu thường dùng nước chiết bắp, chiết malt, dịch tự phân nấm men Cần chọn pH phù hợp với chủng vi sinh vật tổng hợp enzyme theo mong muốn Sau nuôi, ta thu canh trường lỏng dạng thô Để làm tăng lượng enzyme vi sinh vật cần ý tuyển lựa chọn giống chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, tổng hợp enzyme cần thiết với số lượng nhiều Các chủng phân lập theo phương pháp thông thường tổng hợp lượng nhỏ enzyme (enzyme thể), cần tiến hành gây đột biến phương pháp sinh học, lý học, hóa học để tạo chủng có khả siêu tổng hợp enzyme Vi sinh vật sau tuyển chọn, cần nhân giống nuôi điều kiện tối ưu để chúng sinh trưởng tốt, tổng hợp nhiều enzyme Ngồi cần phải chọn mơi trường thành phần mơi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng tổng hợp enzyme vi sinh vật Trong thành phần mơi trường phải có đủ chất đảm bảo sinh trưởng bình thường vi sinh vật tổng hợp enzyme Đặc biệt lưu ý để tăng tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào tượng cảm ứng Vì thành phần mơi trường có chất cảm ứng chất hay sản phẩm phân giải kìm hãm làm yếu tác dụng kìm tỏa chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả sinh tổng hợp enzyme cho không bị cản trở Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường chất tương ứng enzyme cần tổng hợp Ví dụ: Muốn tách α - amylase nấm mốc (Asp.Oryzae), người ta cho vào môi trường nuôi cấy tinh bột, maltose, isomaltose, oligosaccharid có chứa liên kết α - 1,6 glucozid Muốn tách pectinase Asp.Niger, người ta cho thêm vào môi trường pectin Đối với hemicellulase chất cảm ứng hemicellulose; proteinase chất cảm ứng có hiệu lực protein, bột đậu nành, lông, sừng nghiền nhỏ (ởActinomyces fradiae) Chất cảm ứng chất giống chất sản phẩm thủy phân chúng Ví dụ: Thay cho protein peptid thay cho tinh bột erithrodextrin có tác dụng cảm ứng Có nhiều yếu tố ảnh hưởng mơi trường nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25 – 30oC Trị số pH ban đầu môi trường (chủ yếu mơi trường nước) gây ảnh hưởng đến tạo thành enzyme, cần tính đến khả biến đổi nhanh chóng số vi sinh vật 2.3 Phân loại Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế thống phân loại enzyme thành lớp dựa vào kiểu phản ứng Enzyme xúc tác, đánh số từ đến 6: Oxidoreductase: Xúc tác cho phản ứng oxy hóa – khử Transpherase: Xúc tác cho phản ứng chuyển vị Hydrolase: Xúc tác cho phản ứng thủy phân Lyase: Xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết tạo thành hai phân tử không cần nước, loại nước tạo thành nối đôi, kết hợp phân tử nước vào nối đôi Isomerase: Xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa Lygase: Xúc tác cho phản ứng kết hợp hai phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giàu lượng ATP nucleoside triphosphate khác Mỗi lớp lại chia thành nhiều tổ, tổ lại chia thành nhiều nhóm Do đó, bảng phân loại enzyme, trước tên enzyme thường có số: số thứ lớp, số thứ hai tổ, số thứ ba nhóm số thứ tư enzyme Khi ghi tên enzyme nào, thường để ngoặc đơn mã số enzyme bảng phân loại (gồm số) thêm tiếp đầu ngữ “E.C.” (Enzyme Commision) Để đặt tên enzyme, lấy tên chất chất, thêm tiếp vĩ ngữ “-ase” Ví dụ: Một enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị nhóm amin có tên hệ thống L-alanine: 2-oxoglutarate aminotranspherase (E.C 2.6.1.2), Enzyme xúc tác cho phản ứng sau: (L-alanine) + (2-oxoglutarate) = pyruvate + (L-glutamate) Mã số Enzyme rõ enzyme thuộc lớp (transpherase), tổ (chuyển nhóm chứa N), nhóm (chuyển nhóm amin từ chất cho amino acid đến chất nhận thường 2-oxoacid) Như ta thấy tên hệ thống mô tả rõ ràng phản ứng enzyme xúc tác chất Tuy nhiên tên hệ thống thường dài, để thuận tiện hơn, enzyme có tên quen dùng từ trước (tên thường dùng) sử dụng khơng gây hiểu lầm chế phản ứng enzyme xúc tác Ví dụ trường hợp trên, tên thường dùng “alanine transaminase” Số enzyme phân loại ngày tăng: Bảng phân loại enzyme năm 1992 bao gồm 3196 enzyme, đến đầu năm 2003 4000 enzyme Chiết tách enzyme 3.1 Quy trình tách tinh chế enzyme Enzyme vi sinh vật Enzyme ngoại bào Enzyme nội bào, periplasmic Phá vỡ tế bào (trích ly) Dịch enzyme Kết tủa enzyme Tinh Chế phẩm enzyme 3.1.1 Quy trình tách tinh chế enzyme thực vật: Papatin 10 3.1.2 Quy trình tách tinh chế enzyme động vật: pepsin 36 Hình 6: Minh họa sắc ký trao đổi ion Hình 7: Minh họa chế protein hệ sắc ký trao đổi ion (a) Những hạt mang điện tích dương trao đổi ion âm với dung dịch đệm Protein tích điện âm ion dương tương tác với (b) Khi protein gắn với hạt, protein thay ion âm tương tác với hạt hạt thay ion dương tương tác với protein Urease đậu nành sau tinh phương pháp tủa phân đoạn sunfatamon qua thẩm tích đối nước qua cột trao dổi ion DEAE – cellulose, dùng hệ đệm phosphat pH7 1/15M, gradient muối NaCl nồng độ từ – 1M Hình 7: Sắc ký đồ DEAE-Cellullose 37 Hình 8: kết điện di sau bước tinh 5.8.2 Sắc ký lọc gel Nguyên tắc: Là dựa vào khác kích thước hình dạng phân tử lượng E có hỗn hợp để tách chúng ra, dựa mức độ di chuyển khác phân tử hệ thống lưới phân tử gel sắc ký Mẫu nạp vào đầu cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer khơng tan có tính hydrate hóa cao dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide Sephadex, Sepharose, molselect Bio-gel loại gel phổ biến thị trường có sẵn hạt có lỗ với đường kính chuẩn 100μm (0.1mm) Những phân tử nhỏ bên lẫn hạt, phân tử lớn bên ngồi hạt Vì vậy, phân tử có kích thước lớn cột chảy nhanh ngồi trước Phân tử có kích thước trung bình, vào bên hạt rời khỏi cột vị trí giữa; phân tử nhỏ phải qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sau 38 Hình 9: Hình minh hoạ sắc ký lọc gel Các sephadex có ký hiệu khác từ G10 dến G200 phục vụ việc lọc phân tử cho phép chất có trọng luợng phân tử khác lọt vào nguỡng sau đây: Các Molselect có ký hiệu từ G10 dến G200 phục vụ việc lọc phân tử chophép chất có trọng luợng phân tử khác lọt vào nguỡng sau đây: Kỹ thuật áp dụng để loại muối thay cho phương pháp thẩm tích Và q trình tinh chế protein enzyme, sử dụng để đặc dung dịch protein enzyme Phương pháp lọc gel không áp dụng với phương pháp mẫu lớn 39 dùng bước tinh ban đầu Tuy nhiên lượng mẫu đặc lại dùng phương pháp lọc gel Ví dụ: Tinh urease từ đậu nành Hình 10: Sắc ký đồ dịch trích ly từ Hình 11: Kết điện di mẫu đậu nành qua cột SephadexG-50 qua cột Sephadex, phân đoạn Sắc ký đồ gel acrylamide cho thấy tất vạch mẫu trích ly xuất mẫu qua tinh sephadex Ðiều có nghĩa trước sau chạy sắc ký lọc gel cột Sephadex G-50 chưa có hiệu mặt tinh sạch, Sephadex G-50 khơng phù hợp nên chưa thể loại bỏ số tạp chất Việc chọn kích thước hạt gel vô quan trọng trình tinh E (Nghiên cứu thu nhận, tinh urease từ đậu nành-Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vi, Nguyễn Tấn Ðạt-Truờng Ðại học Bán công Tôn Ðức Thắng- Tạp chí phát triển KH&CN, tập 9, số7 -2006) 5.8.3 Sắc ký lực Phương pháp cho phép tinh nhanh chóng hợp chất hay E quan tâm Nguyên tắc phương pháp dựa tương tác đặc hiệu sinh học để tạo gắn kết đăc hiệu chất cần tách với gel sắc ký Đối với E, người ta gắn với gel chất có lực đặc hiệu với E chất, cofactor, chất ức chế cạnh tranh, chất tương đồng (analogue) chất Q trình gắn trực tiệp hay qua cầu nối hay cánh tay đòn (spacer) Khi hỗn hợp protein chứa E qua cột sắc ký lực, E chất có lực với nhóm chất đặc hiệu gel giữ lại, chất khác qua E 40 tách cách thay đổi nồng độ muối, pH môi trường hay dùng mộy chất cạnh tranh với E Hiện nay, sắc ký lực sử dụng nhiều tinh E hợp chất sinh học khác, nhiên khó khăn lớn phương pháp tìm chất gắn kết thích hợp 5.8.4 Sắc ký lỏng cao áp Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp dạng mở rộng kỹ thuật sắc ký cột có khả phân tách protein cải thiện đáng kể Bản thân vật liệu tạo cột vốn có phân chia rõ ràng có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả phân tách tăng lên đáng kể Bởi cột làm từ vật liệu mịn nên phải có áp lực tác động lên cột để có tốc độ chảy thích hợp Kết thực có phân giải cao phân tách nhanh 5.9 Phương pháp dùng chất hấp phụ Nhiều protein enzyme gắn cách chọn lọc vào chất hấp phụ định nhưsilicagel, bentonite, γ - aluminium hydroxid, hydroxyapatite nhờ vậy, chúng có làm với hiệu suất cao Phương pháp hấp phụ chọn lọc - 41 hấp phụ thể tích (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào dịch E) cột (sắc ký hấp phụ) dùng phổ biến việc tách làm E Chất hấp phụ chủ yếu thuờng dùng hydroxyapatite cho hiệu phân tách đặc biệt cao Hấp phụ chọn lọc enzyme thực hai cách: chất hấp phụ hấp phụ protein tạp hấp phụ enzyme Quá trình hấp phụ thường tiến hành 0oC Bằng cách đổi độ pH lực ion dung môi thích hợp, E hấp phụ chiết khỏi chất hấp phụ 5.10 Kết tinh protein enzyme Ðây phương pháp đặc hiệu tốt để tách phần protein enzyme giai đoạn tinh chế cuối Khi protein enzyme làm tinh khiết hoàn toàn, trường hợp riêng biệt, ta tiến hành kết tinh chúng Chú ý: protein enzyme trạng thái tinh thể coi tinh khiết hoàn toàn Đặc biệt tinh thể protein E kết tinh lần đầu đơi có độ khơng vượt 50% chứa protein E khác Quá trình kết tinh protein E thực dung dịch (NH 4)2SO4 Quá trình kết tinh kéo dài vài ngày chí hàng tuần muốn nhận tinh thể tinh khiết Thường ta thêm muối (NH4)2SO4 vào dung dịch protein E đậm đặc làm đục nhẹ nhàng dung dịch Sau đặt dung dịch vào nơi, đồng thời tăng từ từ nồng độ muối dung dịch Có thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách: + Thêm dung dịch muối đậm đặc vào dung dịch protein enzyme theo giọt + Thêm muối qua màng bán thấm + Có thể cho bay chậm chạp dung dịch protein E Trong trình kết tinh thay đổi số pH nhiệt độ Ðể kết tinh protein E dễ dàng, giai đoạn truớc đó, người ta thường tách phần protein E dung môi hữu Ðiều liên quan đến việc chất có chất lipid bị loại khỏi dung dịch protein enzyme tạo điều kiện tốt cho trình kết tinh 5.11 Đánh giá kết tinh enzyme 42 Sau nhận E trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể Độ đồng thể chế phẩm protein enzyme phải kiểm tra số phương pháp dựa nguyên lý khác Trong số trường hợp protein enzyme coi đồng thể ly tâm, lại phân chia thành số isoenzyme phương pháp điện di gel Vì dùng nhiều phương pháp khác để kiểm tra độ E mà kết cho đồng thể E cơng nhận tinh khiết Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể thường dùng xây dựng đồ thị độ hòa tan, điện di siêu ly tâm 5.11.1 Xây dựng đường biểu diễn độ hòa tan Trong hàng loạt mẫu dùng thể tích khơng đổi loại dung môi (nước dung dịch muối) lắc với số lượng E khác Sau lọc xác định số protein dịch lọc Cuối xây dựng đường đồ thị Trong loại mẫu đầu, tất protein thêm vào bị hòa tan số lượng protein thêm vào số lượng protein có dịch lọc hay dịch ly tâm Kết nhận biểu diễn đường thẳng Sau dung dịch đạt bão hòa Nếu protein đem hòa tan tinh khiết nghĩa đồng thêm protein dịch lọc không tăng lên đường biểu diễn có điểm uốn Nếu mẫu có protein thứ hai sau đạt độ bão protein hòa tan hơn, loại protein thứ hai hòa tan Kết có điểm bão hòa thứ hai đường biểu diễn có hai điểm uốn Nếu dịch chiết có nhiều protein E có nhiều điểm uốn Phương pháp Northrop Kunitz sử dụng có kết đến ứng dụng nhiều 43 Hình 12: Đường biểu diễn độ hòa tan protein A: Protein đơn thể B: Hỗn hợp protein 5.11.2 Phân tách protein/enzyme điện di gel Là phương pháp tách phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) cách cho qua chất gel điện trường Tốc độ di chuyển protein điện trường: V = Ez/f V: Tốc độ di chuyển E: Lực điện trường z: Điện tích protein f: Hệ số ma sát, tuỳ thuộc vào hình dạng khối lượng protein độ nhớt mơi trường Hình 13: Minh họa phương pháp điện di 44 Đây phương pháp để đánh giá q trình tinh protein/E có hiệu hay khơng, ngồi cách xác định hoạt tính đặc trưng protein/E có tăng lên sau bước tinh sạch, cách làm phát protein diện mẫu sau bước tinh Tuy nhiên, phương pháp khó áp dụng quy mô lớn Gel trạng thái trung gian pha gắn lỏng, gel giống ray phân tử làm tăng phân tách, vậy, điện di ln thực gel Những phân tử nhỏ kích thước lỗ gel di chuyển xuyên qua gel, phân tử lớn lỗ gel gần khơng di chuyển Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển gel với nhiều vận tốc khác Điện di protein thực bảng polyacrylamide mỏng, thẳng đứng Gel polyacrylamide (PAGE), tạo thành từ polymer hóa acrylamide liên kết chéo methylenebisacrylamide, có tính trơ mặt hóa học tạo hình nhanh chóng Trong nhiều trường hợp, để khẳng định chắn băng protein tinh điện di đồ E cần quan tâm, người ta phải dùng đến phương pháp điện di gel hoạt tính Thường dùng đồng trùng hợp chất gel polyacrylamide, sau điện di rửa gel mộtdung dịch thích hợp, sau ủ gel với dung dịch chất điều kiện phản ứng thích hợp Băng protein có hoạt tính chuyển chất thành sản phẩm có màu khác với màu gel chứa chất, nhờ dễ dàng nhận băng có hoạt tính E Ví dụ: Với protease, chất casein, sau nhuộm gel với coomassie vị trí có E khơng có màu (do E phân giải chất), tạo thành vệt sáng gel có chất nhuộm màu xanh Các protein/E phân tách dựa khối lượng điện di gel polyacrylamide điều kiện bị biến tính Một số chất biến tính protein như: SDS (sodium dodecyl sulfate), LDS (lithium dodecyl sulfate), Ureùa, Formamide Thường dùng SDS Hỗn hợp protein có chứa E hòa tan dung dịch SDS, chất tẩy mang điện tích âm phá tất nối 45 khơng cộng hóa trị protein ban đầu Mercaptoethanol (2- thioethanol) hay dithiothreitol thêm vào để làm giảm số nối disulfide Phức hợp SDS với protein bị biến tính có điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng protein Điện tích âm có gắn với SDS lớn nhiều điện tích thân protein ban đầu Vì thế, điện tích ban đầu protein không ảnh hưởng đáng kể đến điện tích phức hợp Phức hợp SDS - protein sau mẫu để chạy điện di Và protein/E gel nhìn thấy dãy băng cách nhuộm với bạc hay chất nhuộm màu Coomassie blue Những đánh dấu phóng xạ phát cách đặt phim chụp x quang lên miếng gel, trình gọi phóng xạ tự ghi Những protein nhỏ di chuyển nhanh gel, protein lớn phía đầu, gần giếng Tính di động phần lớn chuỗi polypeptide điều kiện tỉ lệ với khối lượng chúng Tuy nhiên, có vài protein giàu carbohydrate protein màng không tuân theo mối tương quan SDS-PAGE có độ phân tách cao, cho kết nhanh độ nhạy cao Chỉ với lượng nhỏ khoảng 0.1ug (~2pmol) protein cho vạch rõ nhuộm với Coomassie blue chí (~0.02ug) phát nhuộm bạc Những protein chênh lệch khối lượng khoảng 2% (ví dụ: 40 kD 41 kD hay khác khoảng 10 acid amin) Bảo quản chế phẩm enzyme Sau làm sạch, người ta tiến hành thực giai đoạn cuối tạo sản phẩm, đóng bao Chế phẩm enzyme tạo thành loại sản phẩm sau: enzyme dạng dung dịch, enzyme dạng huyền phù, enzyme dạng bột khô, enzyme dạng viên nhỏ Enzyme dạng dung dịch hay dạng huyền phù: có nhược điểm khó bảo quản người ta thường đưa chúng vào dung dịch chất bảo quản mặt khác sử dụng người ta phải giữ điều kiện nhiệt độ định, không bảo quản nhiệt độ cao 46 Enzyme dạng bột khô dạng viên nhỏ: thường dễ dàng bảo quản khả bảo quản lâu Ngoài ra, chế phẩm enzyme thường dễ vận chuyển Một số công nghệ nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzym phân giải protein từ gan tụy cua biển Việt Nam Gan tụy loại cua biển tổ chức kết hợp chức gan túi mật Bộ phận thường tiết khối lượng lớn loại enzym tiêu hóa phổ rộng, có khả thủy phân protein với hoạt tính cao đặc biệt Tổ hợp enzym phân giải protein tách chiết từ nhiều nguồn khác thực vật, vi sinh vật động vật (dạ dày bê, tụy tạng, gan tụy cua biển…), song tổ hợp enzym từ gan tụy cua biển có khả ứng dụng điều trị vết thương tốt nhất, đặc biệt vết thương mưng mủ - hoại tử vết loét khó lành Hiện nay, từ gan tụy cua người ta thu nhận chế phẩm enzym có độ cao (hepatopancreas) chủ yếu chứa chất xúc tác hyđrolaza, cụ thể proteaza phân hủy colagen Ngoài ra, gan tụy cua biển thuộc loại nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền, không độc thân thiện môi trường tận dụng nguồn phế thải từ nhà máy chế biến hải sản xuất Cấu trúc tinh thể Trypsin 47 Trên sở đó, nhà khoa học Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt Moska (Bộ Công nghiệp nhẹ, Liên bang Nga) chế tạo thành công băng gạc phủ vết thương từ xenlulo vi mô cấy enzym phân giải protein tách chiết từ gan tụy cua biển, có khả làm vết thương mà không cần đến trợ giúp phẫu thuật, nghĩa có khả làm tan protein hoại tử để chúng thấm vào lớp vải phủ Trong khuôn khổ Nghị định thư Hợp tác Khoa học Công nghệ với Liên bang Nga (2010-2011), hai đơn vị Viện KHCNVN Viện Công nghệ Môi trường Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang tiến hành nghiên cứu khảo sát, tìm điều kiện thích hợp cho q trình tách chiết tinh proteaza từ gan tụy cua biển, đánh giá hoạt tính tổ hợp enzym thu được, tiến tới chế tạo băng gạc điều trị vết thương mang lại sản phẩm có giá trị cơng nghệ cao ứng dụng y học sống Việc phân lập tinh chế tổ hợp enzym proteaza từ gan tụy cua biển Việt Nam thực theo quy trình Liên hiệp Khoa học Sản xuất Trinita đề xuất, áp dụng theo patent Mỹ Hàm lượng protein xác định theo phương pháp Bradford Lowry Nội tạng cua biển thu nhận bảo quản nhiệt độ -5 đến -6 0C Sau đó, cắt nhỏ nghiền với dung dịch đệm Photphat đệm Tris.Base theo tỷ lệ thích hợp, hỗn hợp ngâm chiết giờ, loại bã cách ly tâm dịch nghiền Dịch nghiền điều chỉnh pH 5-6 keo tụ lipit chitosan 0.001%, dịch chiết làm cách ly tâm Tiếp theo, kết tủa phân đoạn enzym cồn sulfat amôni cho dịch chiết qua màng siêu lọc để tinh enzym Cuối cùng, enzym sấy đông khô bảo quản nhiệt độ thấp - 40C Quy trình tách chiết enzym proteaza trình bày sơ đồ sau: 48 Quy trình tách chiết enzym proteaza Các nhà nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng số điều kiện đến khả hiệu suất tách enzym proteaza ảnh hưởng dung dịch đệm, tỷ lệ Vdịch chiết/Vcồn, tốc độ ly tâm, tách phân đoạn enzym sử dụng màng siêu lọc quy trình tách chiết Kết khảo sát cho thấy sử dụng dung dịch đệm Tris.Base thích hợp để tách chiết proteaza Kết tủa enzym cồn, (NH4)2SO4 sử dụng màng siêu lọc để tinh chế thu enzym có độ tinh khiết cao khơng lipit Chế phẩm enzym proteaza thu phương pháp kết tủa phân đoạn với cồn 960 cho hoạt tính phân giải protein cao (6256 U/g) tỷ lệ V dịch chiết /Vcồn = 1/2, phương pháp kết tủa phân đoạn với sunfat amơni, hoạt tính enzym đạt giá trị cao phân đoạn 40 - 60% (NH 4)2SO4 Enzym proteaza tách chiết tinh sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn sunfat amôni có dải khối lượng hẹp (20-60kDa) so với phương pháp kết tủa phân đoạn cồn qua màng siêu lọc (10-100kDa) Kết chạy điện di phân đoạn kết tủa sunfat amôni cho thấy tổ hợp proteaza thu từ gan tụy cua biển Việt Nam có trọng lượng phân tử TLPT ≤ 60 kDa 49 Điện di xác định trọng lượng phân tử enzyme (Viện Công nghệ sinh học - Viện KHCNVN) Việc phát huy tiềm khoa học công nghệ quan khoa học, y tế nước để chế tạo sản phẩm băng gạc xenlulo cấy enzym proteaza có tính chất lượng tương đương với sản phẩm nhập ngoại điều cấp thiết Trên sở kết Viện KHCNVN đạt năm qua khẳng định nghiên cứu đem lại sản phẩm cơng nghệ mới, có giá trị thực tiễn cao 50 MỤC LỤC ... transaminase” Số enzyme phân loại ngày tăng: Bảng phân loại enzyme năm 1992 bao gồm 3196 enzyme, đến đầu năm 200 3 4000 enzyme Chiết tách enzyme 3.1 Quy trình tách tinh chế enzyme Enzyme vi sinh vật Enzyme. .. bào Enzyme nội bào, periplasmic Phá vỡ tế bào (trích ly) Dịch enzyme Kết tủa enzyme Tinh Chế phẩm enzyme 3.1.1 Quy trình tách tinh chế enzyme thực vật: Papatin 10 3.1.2 Quy trình tách tinh chế enzyme. .. tổng hợp enzyme tượng gọi cảm ứng sinh tổng hợp enzyme Chất gây nên cảm ứng sinh tổng hợp gọi chất cảm ứng Sự tổng hợp lượng đáng kể enzyme gọi siêu tổng hợp enzyme 6 Để thu nguồn enzyme dồi