Do đó, luận văn “Nghiên cứu tính kháng và cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực nước Echinochloa crus-galli đối với hoạt chất quinclorac ở Đồng bằng Sông Cửu Long” đã được thực hiện.. 5 D
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
Mã ngành: 9620112
LÊ DUY
NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG VÀ CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC
CỦA CỎ LỒNG VỰC NƯỚC (Echinochloa crus-galli (L.)
Beauv.) ĐỐI VỚI HOẠT CHẤT QUINCLORAC
TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
Cần Thơ, 2018
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Minh Chơn
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường
Họp tại: Hội trường …….; Khoa……… ……
………; Trường Đại học Cần Thơ
Vào lúc … giờ … ngày … tháng … năm …
Phản biện 1: ………
Phản biện 2: ………
Phản biện 3: : ………
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ
1 Duy Le, C M Nguyen, R K Mann, C N Yerkes and B V
N Kumar 2017 Genetic diversity and herbicide resistance of
15 Echinochloa crus-galli populations to quinclorac in
Mekong Delta of Vietnam and Arkansas of United States
Journal of Plant Biotechnology, 44: 472-477
2 Duy Le, C M Nguyen, R K Mann, B V N Kumar and
M Morell 2018 Efficacy of Rinskor (florpyrauxifen-benzyl
ester) on Herbicide Resistant Barnyardgrass (Echinochloa crus-galli) in Rice Fields of Mekong Delta, Vietnam Journal
of Crop Science and Biotechnology, 21: 75-81
3 Duy Le, C M Nguyen, B V N Kumar and R K Mann
2018 Weed management practices to control
herbicide-resistant Echinochloa crus galli in rice in Mekong Delta, Vietnam Research On Crops , 19: 20-27
Trang 4Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề
Cỏ lồng vực (Echinochloa crus-galli) được xem là một trong
những loài cỏ dại quan trọng nhất trên ruộng lúa, do là cây C4 nên cỏ lồng vực có khả năng phát triển lấn át cây lúa trên ruộng Ngoài ra cỏ
lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) và cỏ lồng vực cạn (Echinochloa colona) còn có khả năng “bắt chước” hình thái của cây
lúa ở giai đoạn đầu Do đó, việc phân biệt và nhổ cỏ bằng tay ở giai đoạn này trở nên khó khăn hơn Sử dụng thuốc cỏ là một biện pháp giúp kiểm soát cỏ lồng vực một cách hiệu quả, tuy nhiên, cỏ lồng vực kháng thuốc đã trở thành vấn đề nghiêm trọng trên ruộng lúa Cỏ lồng vực có khả năng kháng với nhiều hoạt chất trừ cỏ trên thị trường Trong điều kiện hiện nay việc nghiên cứu sâu hơn về tính kháng thuốc
của cỏ lồng vực là cần thiết Do đó, luận văn “Nghiên cứu tính kháng
và cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) đối với hoạt chất quinclorac ở Đồng bằng Sông Cửu Long” đã được
thực hiện
1.2 Mục tiêu của luận văn
(1) Đánh giá đa dạng hình thái và đa dạng di truyền của quẩn
thể cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) ở Đồng bằng Sông Cửu Long
(ĐBSCL)
(2) Đánh giá tính kháng của cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) với
bispyribac, penoxsulam và quinclorac trên ruộng lúa ở ĐBSCL (3) Giải thích cơ chế kháng quinclorac ở mức sinh hóa và mức
độ di truyền phân tử của cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli)
1.3 Các nghiên cứu của luận văn
(1) Khảo sát tập quán canh tác lúa và quản lý cỏ dại ở ruộng lúa tại ĐBSCL
(2) Đánh giá sự đa dạng của quần thể cỏ lồng vực (Echinochloa
spp.) ĐBSCL
(3) Đánh giá mức độ kháng bispyribac-sodium, penoxsulam và
quinclorac của các mẫu cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) bằng phương
pháp thử bằng dãy nồng độ của thuốc
Trang 5(4) Đánh giá hiệu quả của, hoạt chất trừ cỏ mới chuyên dùng
cho cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) kháng thuốc để kiểm soát quần
thể cỏ lồng vực kháng thuốc
(5) Dùng phân tích RAPD để đánh giá đa dạng gene của quần
thể cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli), sự tương quan giữa các quần thể cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) kháng
quinclorac và khoảng cách gene giữa các quần thể cỏ lồng vực nước
(Echinochloa crus-galli) ở ĐBSCL
(6) Đo lường hoạt tính của enzyme β-cyanoalanine synthase (CAS) trong mô lá cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) để tìm
ra cơ chế kháng quinclorac ở mức sinh hóa của cỏ lồng vực nước
1.4 Thời gian và địa điểm
Luận văn được tiến hành từ 2014 đến 2018
Thí nghiệm 1; 2 và 3 được tiến hành tại khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Đại học Cần Thơ; Nghiên cứu 4; 5 và 6 được tiến hành tại Trung tâm nghiên cứu của Dow AgroSciences tại
Indianapolis, Indiana, Hoa Kỳ
1.5 Tính mới của nghiên cứu
Các nghiên cứu trong luận văn đã xác nhận sự tồn tại của các
quần thể cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) kháng thuốc cỏ ở ĐBSCL
Nghiên cứu này còn đánh giá sự tương quan giữa tập quán quản
lý cỏ của nông dân và tính kháng thuốc của cỏ, và từ đó đưa ra được giải pháp thực tiễn để quản lý cỏ hiệu quả
Cơ chế kháng quinclorac của cỏ lồng vực được xác định và phân tích sâu ở mức enzyme và di truyền phân tử, thông qua đo lường mức hoạt động của enzyme giải độc quinclorac và mức độ biểu hiện gene trên cỏ lồng vực Kết quả này cung cấp thông tin quan trọng và đặt nền móng cho những nghiên cứu sâu hơn và sự kháng thuốc ở cỏ lồng vực
1.6 Bố cục luận văn
Luận văn bao gồm 102 trang (21 bảng, 38 hình và 202 tài liệu tham khảo) Trong đó, phần Giới thiệu: 3 trang, Tổng quan tài liệu: 33 trang; Phương tiện và Phương pháp: 18 trang; Kết quả và Thảo luận:
43 trang; Kết luận và đề nghị: 2 trang; Tài liệu tham khảo: 18 trang; Phụ lục: 42 trang, bao gồm số liệu và hình ảnh
Trang 6CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Chi Echinochloa gồm hơn 250 loài và hầu hết đều là cỏ dại Cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) là cây C4 đơn tử diệp, bắt nguồn từ châu
Âu và đã được phát hiện khắp thế giới Hình thái của Echinochloa
spp có mức đa dạng cao, trong nhiều trường hợp thường nhằm lẫn các loài với nhau Ruộng lúa ở châu Á có 3 loại cỏ lồng vực chủ yếu,
Echinochloa crus-galli, Echinocloa colona, và Echinochloa glabrescens, các loài này đều được tìm thấy ở Việt Nam
Thuốc cỏ bispyribac và penoxsulam là hai hoạt chất trừ cỏ nhóm ức chế enzyme ALS phổ biến trên ruộng lúa, hai hoạt chất này được sử dụng phổ biến để quản lý lồng vực ở Việt Nam Quinclorac
là thuốc cỏ nhóm auxin tổng hợp, các thương phẩm chứa quinclorac được sử dụng rộng để kiểm soát cỏ lồng vực trên ruộng lúa Rinskor
là hoạt chất mới thuộc nhóm auxin tổng hợp, hoạt chất này chưa được
sử dụng để trừ cỏ ở Việt Nam từ thời điểm bắt đầu luận văn này vào năm 2014
Hạt cỏ từ 78 quần thể cỏ lồng vực được thu thập từ ruộng lúa ở
7 tỉnh ĐBSCL Cây con được trồng từ các hạt thu thập được và sau đó được xử lý bằng thuốc bispyribac, penoxsulam, quinclorac và rinskor
để xác định liều gây chết 90% quần thể (LD90) và mức độ kháng thuốc của quần thể Các nghiên cứu tiếp theo được thực hiện nhằm tìm hiểu
về độ đa dạng di truyền và cơ chế kháng thuốc quinclorac của cỏ, 15 quần thể được chọn để phân tích khoảng cách di truyền bằng phương pháp RAPD Hoạt động của CAS cũng được phân tích để xác định hàm lượng enzyme trong mô lá của 5 quần thể cỏ khác nhau dưới tác động của quinclorac Ngoài ra mức thể hiện của mRNA của gene quy định enzyme cyanoalanide synthase của 5 quần thể cỏ đã được phân tích bằng phương pháp so sánh 2−ΔCt Hoạt động của enzyme và mức thể hiện của mRNA tương ứng trong 5 quần thể đã được đối chiếu để tìm sự liên quan giữa hai yếu tố này trong mô cỏ sau khi xử lý thuốc Kết quả của nghiên cứu này cung cấp thêm kiến thức về cơ chế kháng quinclorac của cỏ lồng vực
Trang 7CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát hoạt động canh tác lúa và kiểm soát
cỏ dại ở ĐBSCL, Việt Nam
Mục tiêu của nghiên cứu: Điều tra tập quán của nông dân về
quản lý cỏ dại trên ruộng lúa ở ĐBCSL
Hạt của cỏ lồng vực được thu từ 90 ruộng lúa Sau khi kiểm tra
tỉ lệ nảy mầm trong nhà kính, 78 mẫu được chọn làm thí nghiệm Trong công đoạn thu hạt cỏ từ ruộng lúa, đồng thời phỏng tập quán canh tác của nông dân, 9 câu hỏi sau được dùng trong khảo sát:
- Số vụ lúa canh tác trong năm
- Diện tích ruộng lúa (ha)
- Số lần phun thuốc cỏ mỗi vụ
- Điều kiện quản lý nước tưới
- Hiểu biết về các loại cỏ dại quan trọng trên ruộng lúa
- Những loại thuốc trừ cỏ quan trọng cho cỏ lồng vực
- Chi phí quản lý cỏ dại cho 1 ha/vụ
- Chi phí phun thuốc cho 1 ha/vụ
- Chi phí nhổ cỏ 1 ha/vụ
Bộ câu hỏi trên được thiết kể để lấy được những thông tin quan trọng về điều kiện tại ruộng lúa, tập quán quản lý cỏ của nông dân, bộ câu hỏi trên được hỏi sau khi thu mẫu hạt cỏ trên từng ruộng
Phân tích thống kê
Sau khi kiểm tra chéo, những thông tin không đủ tin cậy hoặc không rõ ràng được loại bỏ khỏi bộ số liệu Bộ số liệu sau cùng được phân tích với trả lời từ 71 nông dân
Dữ liệu được phân tích với giá trị trung bình được so sánh bằng kiểm định Tukey-Kramer test ở mức α=0,05 Phân tích Phương sai một chiều (Oneway ANOVA) với t-test ở mức P<0,05 được dùng để phân tích tương quan giữa diện tích ruộng lúa và tập quán nhổ cỏ tay Phân tích thống kê bằng phần mềm JMP Pro 13 (SAS)
Trang 83.2 Thí nghiệm 2 Phân loại quần thể cỏ Echinochloa spp bằng đặc điểm hình thái
Mục tiêu nghiên cứu
Phân loại các quần thể Echinochloa spp bằng các đặc điểm
phân loại đã được công bố trước đó Mục tiêu của nghiên cứu này là
xây dựng cơ sở dữ liệu về sự đa dạng của các quần thể Echinochloa
spp ở ĐBSCL trước khi tiến hành nghiên cứu về cơ chế kháng thuốc
của cỏ lồng vực (Echinochloa crus-galli)
Từng loài trong các mẫu cỏ lồng vực thu được được xác định dựa vào khóa phân loại được đề xuất bởi Pignatty và Carretero – khóa phân loại được kiểm chứng lại với các đánh giá dựa trên phân tích di
truyền bởi Tabacchi et al (2006) Các đặc điểm hình thái sau được
ghi nhận: (1) Chiều cao cây: đo từ gốc cây đến lá trên cùng lúc 56 ngày sau nảy mầm; (2) Trọng lượng khô: sinh khối khô (phần trên mặt đất) lúc 56 ngày sau khi gieo được đo bằng cách phơi cây trong vòng
7 ngày đến khi trọng lượng không thay đổi; (3) Màu sắc đốt thân gốc: quan sát màu sắc của đốt thân gốc của cây con là xanh lá hay màu đỏ (4) Số đốt thân: số đốt được đếm lúc 56 ngày sau nảy mầm; (5) Thời gian trổ bông: thời gian từ lúc nảy mầm đến lúc hoa đầu tiên nở hoàn toàn (6) Chu kỳ sinh trưởng: thời gian từ lúc nảy mầm đến khi hạt chín; (7) Hình thái bông: chụp hình bông và hạt, sau đó sử dụng tài liệu tham khảo để xác định tên loài; (8) Định danh dựa trên hình thái
và khóa phân loại nhằm giảm thiểu khả năng sai sót trong khi lựa chọn mẫu cho các phân tích enzyme và di truyền phân tử về sau Các thông tin thu được ban đầu sẽ được sàng lọc để chọn ra quần thể để xác định
đa dạng di truyền, hoạt động enzyme và mức thể hiện gene dưới tác động của quinclorac
Phân tích thống kê
Trung bình được so sánh bằng kiểm định Tukey-Kramer test ở mức α=0,05 Phương sai một chiều (one way ANOVA) với t-test ở mức P<0,05 Các phân tích được thực hiện bằng phần mềm JMP Pro
13 (SAS)
Trang 93.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá mức độ kháng thuốc của các quần thể
Echinochloa spp với 3 hoạt chất bispyribac-sodium, penoxsulam
và quinclorac
Mục tiêu của nghiên cứu
Sử dụng phương pháp thử thuốc theo dãy nồng độ để xác định các quần thể mẫn cảm và quần thể kháng của cỏ lồng vực ở ĐBSCLvà đánh giá mức kháng của các quần thể với 3 hoạt chất bispyribac,
penoxsulam và quinclorac
Đánh giá mức kháng thuốc
Ở giai đoạn 3-4 lá, cây cỏ lồng vực được phun lên lá bằng các loại hoạt chất bispyribac (10% SC), penoxsulam (2.5% OD) và quinclorac (25% SC) ở 6 liều 0,25X, 0,5X, 1,0X, 2,0X, 4,0X và 8,0X, với X là liều được khuyến cáo, liều khuyến cáo của bispyribac là 25 g/ha, penoxsulam là 12,5 g/ha, và quinclorac là 250 g/ha
Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), 4 lặp lại Một chậu 1 lặp lại và 10 cây 1 chậu
Thuốc cỏ được phun trong buồng phun thuốc (Máy phun chuyên dụng SB-8, Devries Manufacturing), áp lực phun chỉnh về mức 300 L/ha với áp lực 140 kPa 14 ngày sau phun, tỉ lệ chết được ghi nhận bằng cách đếm cây còn sống và cây chết hoàn toàn Các kết quả ghi nhận được dùng để tính toán giá trị LD90 của từng quần thể bằng mô hình hồi quy không tuyến tính sử dụng bốn thông số điều chỉnh (four parameters) của phần mềm GraphPad Prism 7.02 (San Diego, CA) software Tính kháng đơn hoặc kháng đa hoạt chất được tính toán dựa vào đáp ứng của từng quần thể với từng hoạt chất Phương pháp tính toán được trình bày chi tiết ở phần xử lý số liệu
nghiên cứu của Moss et al (2007) Trong đó, quần thể mẫn cảm (S)
Trang 10có tỉ lệ chết khoảng 81-100%; R? (có thể đã kháng thuốc) cho mức kiểm soát 72-80%; RR có tỉ lệ chết khoảng 36-71% và RRR có tỉ lệ chết khoảng 0-35% Sự tương quan giữa các nhân tố thí nghiệm được phân tích bằng phương pháp hồi quy và tương quan Pearson Phân tích hồi quy và đường hồi quy được xử lý bằng phần mềm JPM Pro
13 (SAS)
3.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá hiệu quả của hoạt chất rinskor cho quần thể cỏ lồng vực kháng thuốc
Mục tiêu nghiên cứu
Sau khi sàng lọc tính kháng với các hoạt chất bispyribac, penoxsulam và quinclorac, 78 quần thể cỏ lồng vực được xử lý thuốc bằng cách phun lên lá với rinskor 2.5% với liều 0,25X, 0,5X, 1,0X, 2,0X, 4,0X và 8,0X Liều 1,0X là 25 g/ha Phần trăm (%) cỏ chết được ghi nhận lúc 14 ngày sau xử lý thuốc
Kết quả của thí nghiệm này được dùng để đưa ra khuyến nghị
về giải pháp kiểm soát cỏ lồng vực hiệu quả ở ĐBSCL
Xác định mức độ kháng của các quần thể cỏ lồng vực nước bằng mức biểu hiện của β-cyanoalanine trong mô lá của cây sống sót trong thí nghiệm thử dãy nồng độ với quinclorac
Chọn quần thể để phân tích và phương pháp xử lý thuốc
Chọn 5 quần thể cỏ lồng vực nước thể hiện tính ổn định cao nhất với các kiểm tra tính kháng và mẫn cảm quinclorac cho phân tích enzyme Ở giai đoạn 3-4 lá, các cây được chọn được xử lý bằng cách phun quinclorac lên lá với liều 125 g/ha (1/2 liều khuyến cáo để đảm bảo xử lý thuốc không giết cây mẫn cảm trong quá trình thí nghiệm) Thuốc cỏ được phun trong buồng phun thuốc (Máy phun chuyên dụng SB-8, Devries Manufacturing), áp lực phun chỉnh về mức 300 L/ha với áp lực 140 kPa Mẫu lúa giống IR50404 ở giai đoạn
Trang 113-4 lá và 2 quần thể cỏ lồng vực được xác định là kháng và mẫn cảm quinclorac được thu từ Arkansas Hoa Kỳ cũng được đưa vào thí nghiệm để phân tích hoạt tính enzyme
Xác định hoạt tính enzyme CAS trong mô lá
Hoạt tính của enzyme CAS trong mô lá cỏ lồng vực nước được
phân tích bằng phương pháp của Chon et al (2008):
- 1 gram lá tươi từ 4 cây trong mỗi quần thể được thu lúc 1 giờ
và 3 ngày sau khi phun thuốc
- Mẫu lá được ngâm và đông lạnh nhanh bằng nitơ lỏng sau đó được nghiền với TissueLyzer II (Qigen), mô lá được trộn đều ở mức 30 vòng lắc trong 1 giây trong vòng 1 phút Quá trình trộn này được tiến hành 2 lần và đảo chiều 2 lần để đảm bảo mẫu trộn đồng đều
- Ly tâm 10,000 g trong 10 phút ở 4oC
- Thêm 2,5 mL dung dịch 100 M Tris buffer (pH=8,5) vào từng
vi ống chứa 1 g mẫu mô lá đã được trộn đều
- Phần dịch trích được dùng để phân tích enzyme
- 100 mM dung dịch Tris buffer (pH=8,5) được dùng để chuẩn
bị 2 dung dịch 25 mM NaCN và 5mM L-cysteine
- Dịch trích được để trong 10 phút ở nhiệt độ 30oC, sau đó trộn với 0,5 ml dịch trích enzyme, 2 ml NaCN, 2 ml L-cysteine và được ủ 30oC trong 60 phút
- Sau khi ủ, 1 ml dung dịch được chuyển vào ống ly tâm chứa sẵn 0,1 ml dung dịch 0,03 M FeCl3 trong dung dịch 1,2 N HCl
và 0,1 ml dung dịch 0,02 M N,N-dimethyl-p-phenylenediamine
sulfate trong dung dịch 7,2 N HCl
- Mẫu được trữ trong tối trong vòng 20 phút và ly tâm ở 1020 g
trong 5 phút để protein lắng tụ dưới đáy ống
- Quá trình khử methylene blue bằng hydrogen sulfide được dùng để xác định hoạt tính của CAS trong mô lá
- Hoạt tính của enzyme được xác định bằng chỉ số hấp thu methylene blue ở bước sóng 650 nm và Na2S được dùng làm thang chuẩn
Trang 12- Hoạt tính của enzyme được thể hiện bằng đơn vị nmol H2S/g lá tươi/phút Mỗi mẫu được thực hiện với 4 lặp lại
Phân tích thống kê
Phân tích enzyme được bố trí hoàn toàn ngẫu nghiên, mỗi mẫu gồm 4 lặp lại Dữ liệu của 4 lặp lại được phân tích bằng Tukey-Kramer Test ở mức α=0,05 Phân tích dữ liệu bằng JPM Pro 13 (SAS)
3.6 Thí nghiệm 6: Xác định đa dạng di truyền giữa quần thể cỏ lồng vực kháng thuốc và quần thể cỏ mẫn cảm ở ĐBSCL
Mục tiêu nghiên cứu
Phương pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) được dùng để đánh giá đa dạng di truyền giữa các quần thể để cung cấp thông tin giá trị về mức phổ biến và sự phân bố của quần thể cỏ kháng quinclorac ở ĐBSCL
Vật liệu nghiên cứu
Từ kết quả của nghiên cứu hình thái, hạt của 15 quần thể cỏ
lồng vực (Echinochloa spp.) được chọn lại Quá trình chọn lọc dựa
vào từng nhóm loài cỏ và tính kháng quinclorac 4 quần thể của mỗi nhóm cỏ được chọn và chỉ chọn quần thể có tính ổn định cao trong các đợt thử về tính kháng và tính mẫn cảm với quinclorac Cỏ được trồng trong nhà kính, thu mẫu lá từ cây mẫu đại diện quần thể vào giai đoạn 3-4 lá thật
Phân tách DNA từ mô lá
DNA từ nhân tế bào được trích từ mô lá theo quy trình DNAzol Reagent (CAS No 593-84-0, Invitrogen, Thermo Scientific Corp., Waltham, MA) như sau:
- Mô lá tươi (1 g) từ cây đại diện của mỗi quần thể được nghiền nhuyễn trong dung dịch ni tơ lỏng để chuẩn bị trích DNA
- Mỗi mẫu được nghiền bằng cối và chày sứ, 100g mẫu trộn đều được chuyển vào ống ly tâm có chứa sẵn DNAzol (1,5 mL) và RNAse (150 µL)
- Hỗn hợp được trộn và lắc đều trong 5 phút ở 25oC
- Chloroform (900 µL) được thêm vào và trộn đều trong 5 phút
ở 25oC
- Hỗn hợp được ly tâm 12000 g trong 10 phút Phần dịch lỏng
được chuyển sang ống mới
Trang 13- Phần dung dịch được trộn với 100% ethanol (700 µL) để kết tủa DNA
- Ống được lật ngược 6-8 lần ở nhiệt độ phòng (25oC) trong 5
phút và ly tâm lại ở mức 5000 g trong 5 phút để lắng DNA
- DNA kết tủa được rửa sạch bằng dung dịch với tỉ lệ 1:0,75 (v/v) DNAzol và 100% ethanol (900 µL) bằng cách lắc nhẹ trong 10 giây
- Dung dịch rửa DNAzol được loại bỏ và thay bằng 75% ethanol (700 µL, pha bằng nước không chứa nuclease)
- Hỗn hợp được ly tâm ở mức 5000 g trong 4 phút
- Ethanol sau đó được loại bỏ và tủa DNA được để khô tự nhiên trong 1-2 phút
- Mẫu DNA sau đó được hòa tan bằng 50 µL TE buffer, pH 8,0
- Nổng độ DNA và độ tinh khiết sau đó được kiểm tra bằng cách
đo quang phổ qua máy NanoDrop (Thermo Scientific Corp, USA)
Phương pháp phân tích đa dạng di truyền RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
40 đoạn mồi oligonucleotide 10 bp (được tổng hợp bởi công ty Integrated DNA Technology, Inc., Coralville, IA) được dùng để phân tích RAPD
Tất cả đoạn mồi được dùng cho 15 quần thể Echinochloa spp
và đánh giá tính lặp lại, độ phân giải và tính đa hình Dung dịch PCR Master mix gồm 2,7 µL H20, 1 µL PCR buffer (Invitrogen Cat No 18067-017), 80 µL MgCl2, 5 µM primer, 0,25 µL template DNA, 0,05
µL Taq polymerase (0,5 units), và 1 µL dNTP
PCR được thực hiện bằng máy LightCycler 480 II (Roche Molecular Diagnostics, Indianapolis, IN) bằng các bước sau:
- Ủ ở 94oC trong 2 phút
- 45 chu kỳ ở nhiệt độ 94oC trong 45 s (ramp rate 4,8oC/s)
- 38oC trong 5 phút (ramp rate of 2,5oC/s)
- 72oC trong 2 phút (ramp rate 4,7oC/s), và 72oC trong 7 phút
- Sản phẩm PCR được phân tích bằng máy LabChip GXII (PerkinElmer, Waltham, MA)
Trang 143.7 Thí nghiệm 7: Đo lường mức thể hiện của mRNA của gene CAS trong quần thể cỏ lồng vực kháng và mẫn cảm quinclorac Mục tiêu của nghiên cứu
Đo lường mức độ biểu hiện của mRNA từ CAS gene trong quần thể cỏ lồng vực đã được sàng lọc và cây lúa để hiểu về cơ chế kháng bằng CAS enzyme của quần thể kháng và mẫn cảm
H20, 5,0 µL Roche Probes Master Mix (11636103001) (Roche), 0,4
µM Forward Primer 0,4 µM Reverse Primer, 0,2 µM Probe và 2,0 µL dung dịch 1:2 diluted cDNA Khay Roche 384 giếng được dùng cho phản ứng qPCR bằng máy Roche Light Cycler 480II Quy trình PCR được tiến hành như Bảng 3.2
Bảng 3.2 Chuỗi phản ứng PCR