chuẩn hóa bệnh dịch tả lợn bằng hóa miễn dịch tế bào

Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập rèn luyện Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, dạy dỗ, bảo tận tình thầy cô, đặc biệt thầy cô khoa Thú Y giúp tơi có kiến thức nghề nghiệp, tư cách, đạo đức người làm kỹ thuật, bác sĩ thú y Đến tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Để hồn thành khóa luận này, ngồi nỗ lực thân, nhận giúp đỡ, hưỡng dẫn tận tình thầy giáo khoa Thú Y Qua xin gửi lời cảm ơn tới: Ban giám hiệu Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, Ban chủ nhiệm khoa Thú Y thấy cô giáo trang bị cho kiến thức vô quý báu suốt thời gian học tập rèn luyện học viện Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS Bùi Trần Anh Đào giảng viên môn Bệnh Lý, người trực tiếp hưỡng dẫn thức đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị phòng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh - khoa thú y –B 213- 214 Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam, cảm ơn gia đình , bạn bè người động viên, giúp đỡ suốt q trình học tập thực tập Tơi mong góp ý, bảo thầy cô giáo bạn bè để nghiên cứu tơi hồn thiện có hiệu Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày 30 tháng năm 2016 Sinh viên Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 Trần Thị Vân Anh DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DTL: Dịch Tả Lợn CSF: Classical Swine Fever VCSF: Virus Classical Swine Fever KN: Kháng Nguyên KT: Kháng Thể RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction ARN: Axit RiboNucleic PK15 : Pig Kidney 15 ICC: Immunocytochemistry PBS: Phosphate – Buffered – Saline Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 PHẦN I : MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh dịch tả lợn ( Classical Swine Fever/CSF) bệnh truyền nhiễm lây lan mạnh virut gây lồi lợn Bệnh có tốc độ lây lan nhanh, xảy lứa tuổi lợn, gia súc non tỷ lệ chết lên tới 100% Ở lợn nái mang thai tạo cảm nhiễm qua thai, gây chết phôi, sẩy thai…cho nên, tổ chức dịch tễ giới xếp bệnh thuộc bảng A, bảng danh mục bệnh nguy hiểm Nông Nghiệp Phát triển nông thôn xây dựng chương trình phòng chống bước đến khống chế toán Ở Việt Nam, bệnh phát vào năm 1923 gây nhiều đợt dịch nghiêm trọng Hiện nay, nhiều biện pháp kỹ thuật áp dụng để phòng bệnh Nhưng nhiều nguyên nhân khác nhau: điều kiện thời tiết khí hậu, chất lượng vacxin, kỹ thuật tiêm phòng….làm cho bệnh dịch tả lợn xảy lẻ tẻ, thành ổ dịch lớn Do diễn biến phức tạp bệnh nên yêu cầu việc chẩn đốn nhanh xác bệnh dịch tả lợn chỗ cần thiết Đã có nhiều thành tựu khoa học kỹ thuật đóng góp vào việc tìm hiểu bệnh dịch tả lợn phương pháp phòng bệnh Tuy nhiên nay, bệnh dịch tả lợn tiếp tục coi bệnh nguy hiểm gây thiệt hại cho ngành chăn ni lợn Xuất phát từ tình hình trên, nhằm cải tạo nâng cao việc chẩn đoán bệnh Dịch Tả Lợn nên phương pháp chẩn đoán bệnh yêu cầu cấp thiết để phòng chống bệnh, giảm tổn thất chăn nuôi, giữ cho đàn lợn mặc bệnh tỷ lệ thấp Có nhiều phương pháp chẩn đốn bệnh nghiêm cứu, tơi trình bày : “ Một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu bệnh Dịch Tả Lợn (CSF-Classical Swine Fever)” Ứng dụng kỹ thuật hóa miễn dịch tế bào chẩn đốn bệnh “ Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 I.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Thực đề tài nhằm mục đích:  Nghiêm cứu biến đổi bệnh lý ( triệu chứng lâm sàng, tổn thương đại thể, tổn thương vi thể) số quan, tổ chức lợn mắc bệnh dịch tả  Xây dựng quy trình chẩn đốn bệnh bệnh phương pháp hóa miễn dịch tế bào  Áp dụng kỹ thuật chẩn đoán giới vào nước ta PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 2.1 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 2.1.1 Tình hình dịch bệnh giới Dịch tả lợn (DTL) bệnh nguy hiểm loài lợn Bệnh có từ lâu đời nguồn gốc xuất bệnh chưa thống  Có nguồn cho bệnh DTL xảy lần Tennese vào khoảng năm 1810 (Hanson,1957), sau bệnh xuất pháp năm 1822, Đức năm 1893 bang Ohio-Mỹ vào năm 1830 sau lan nước Mỹ vùng Cornbert vùng chăn nuôi lợn nhiều  Tuy nhiên, quan điểm cho bệnh DTL lần xuất Anh năm 1862 (Fuchs, 1968) sau lan sang nước Châu Âu khác Vì việc xác định nguồn gốc bệnh DTL chưa xác minh xác Bệnh DTL tồn nhiều nước giới, thiệt hại kinh tế DTL gây lớn Năm 1997 nước: Đức, Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, có triệu lợn bị tiêu hủy (Rassow, 1997) Ở Hà Lan tính đến 31/12/1997 có 424 ổ dịch/năm ( Mesplede A E Albina, F Madec, 1998) Cộng hòa liên bàng Đức từ tháng 11/1982 – 9/1984 có 1457 ổ dịch xảy ra, với 395000 lợn bị xử lý Bệnh DTL xảy liên tục từ năm 1993-5/1999 đất nước này, làm tổng số lợn tiêu hủy lên tới 11 triệu con( Henry Too, 2002) Ở Châu Âu, từ thập kỷ 60-70 kỉ XX, người ta thực tiêm phòng chặt chẽ, sau ngừng tiêm phòng để phát lợn mang trùng thông qua theo dõi huyết lợn Sau 16 năm nỗ lực bệnh DTL xóa bỏ số quốc gia lợn: Anh, Bắc Ai Len coi bệnh từ năm 1965, năm 1986 bệnh lại xảy Anh phải tiêu hủy 7781 lợn 26 ổ dịch tiêu tốn 450101 bảng (William D.R cs, 1998) Chương trình tiêu hủy bệnh Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 DTL bắt buộc quốc gia EU, nhiên bệnh lác đác xảy Năm 1994 dịch xảy Bỉ buộc quốc gia phải tiêu hủy 90000 lợn từ 52 ổ dịch (Koenen F cs, 1996) Theo OIE (1998) năm 1984 Mexico có 179 ổ dịch, Malaysia có ổ dịch, Hàn Quốc có 45 ổ dịch Năm 1997, nước EU phải chịu thiệt hại DTL bùng phát: Đức, Italia, Tây Ban Nha, Bỉ, Hà Lan; tính đến 31/12/1997 Hà Lan có 424 ổ dịch xuất năm ( Mesplede A, 1999) Ở Châu Á, có lẽ bệnh DTL ghi nhận Malaysia năm 1895.Nhật Bản không xảy dịch, ngày bệnh DTL xem phổ biến có tính chất địa phương hầu hết quốc gia Châu Á ( Henry Too, 2002) Các nước Australia, Canada, Newzeland, Ireland, Thụy Sỹ nước thuộc bán đảo Scandinavia coi khơng có bệnh dịch tả lợn ( Van Oichot J.I, 1992) 1.2 Tình hình dịch bệnh Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh DTL Houdenner phát vào năm 1923-1924 gây nhiều đợt dịch ( Đào Trọng Đạt cs, 1989) Đến nay, bệnh DTL “ bốn bệnh đỏ” gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn nước ta ( Lê Minh Chí, 1988) Năm 1960, bệnh DTL xảy Nghệ An, Phú Thọ việc vận chuyển lợn bệnh từ tỉnh vào Năm 1968 năm có số ổ dịch xảy nhiều miền Bắc, theo thống kê có tới 481 ổ dịch ( Lê Độ, 1981) Năm 1973, bệnh DTL xảy 11 trại lợn xung quanh thành phố Hố Chí Minh Năm 1974 dịch xảy 11 tỉnh phía Bắc làm thiệt hại vạn lợn, 15 tỉnh Nam Bộ có dịch, gây chết 145078 lợn ( Đào Trọng Đạt, 1989) Tại tỉnh Trung Bộ dịch xảy mạnh vào năm, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 1976-1978 có 17 ổ dịch, năm 1977 có 36 ổ dịch, năm 1978 có 18 ổ dịch ( Báo cáo dịch tễ năm 1978 Cục thú y) Từ năm 1980, việc tiêm phòng triển khai đồng nên ổ dịch lợn không xảy bệnh tồn diễn biến ngày phức tạp, có nhiều thay đổi triệu chứng lâm sàng, bệnh tích độ tuổi mẫn cảm Theo điều tra dịch tễ học từ 1995-1997 tỉnh Ninh Thuận, Khánh Hòa, Phú n, Bình Đình, Quảng Nam, Quảng Ngãi có lợn mắc bệnh số lượng không nhiều dịch xảy lẻ tẻ thường xuyên có khắp nơi tỉnh ( Nguyễn Thị Phương Duyên, 1999) Theo báo cáo tháng 10/2006 quan thú y vùng IV, tỉnh Nam Trung Bộ Tây Nguyên: tháng 5/2005 Khánh Hòa với 24 xã huyện có dịch, số lợn bị hủy 161 con, tháng 10/2006 Quảng Ngãi có 16 xã có dịch , số chết 169 Tại Quảng Nam có xã có dịch, số lợn chết 277 Gia Lai có xã có dịch, số lợn chết 521 Tại báo cáo số 01/TTV-BC ngày 15/01/2007 báo cáo số 11/TYV-BC, ngày 15/02/2007 quan thú y vùng IV: Quảng Ngãi Bình Định có 20 xã có dịch, số lợn chết 196 Theo báo cáo số 234/BC-CTY, ngày 31/12/1997 Cục thú y, tháng 12/1997 tồn quốc có 56 xã 31 tỉnh có dịch, với 3088 lợn bị tiêu hủy, tháng năm 1998 có 2512 bị bệnh gần tháng 5/2005 có 123 xã 46 huyện thuộc 17 tỉnh có dịch Tại báo cáo số 1860/TY-DT, ngày 25/12/2006 Cục thú y tồn quốc có 16 huyện tỉnh có dịch tả lợn với 36 ổ dịch, số lợn chết ổ dịch 1518 Như vậy, bệnh DTL nước ta không xảy ổ dịch lớn gây thiện hại năm 1960-1970 mối đe dọa cho ngành chăn nuôi lợn Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 2.2 VIRUS DỊCH TẢ LỢN 2.2.1 Nguồn gốc virus Dịch Tả Lợn Theo Salmon Smith (1885), bệnh gây loại vi khuẩn, hai ông đặt tên Bacillus cholera suis ( tức Salmonella suis) Nhưng đến năm 1903, Schweinitz Dorset xác định tác nhân gây bệnh DTL lồi virus vi khuẩn Bacillus cholerae suis đóng vai trò phụ ( Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) Năm 1947 Holmes đặt tên cho virus gây bệnh DTL Tortor virus Trước đây, người ta coi virus gây bệnh DTL thành viên họ Togavirideae, giống Pestivirus với virus gây bệnh tiêu chảy bò( Bovine Viral Diarhea Virus – BVDV) virus gây bệnh Border cừu ( Border Diseease Virus – BDV) Nhưng gây đây, qua nghiêm cứu cấu trúc phân tử Pestivirrus cho thấy gen chúng (genome) tương ứng với virus thuộc họ Flaviviridae ( Nguyên Văn Ty, 1975) nên giống Pestivirus xếp vào họ Flaviviridae 2.2.2 Hình thái cấu trúc virus Virus DTL thuộc loại ARN virus, có vỏ bọc Lipoprotein Quan sát kính hiển vi điện tử, virus có dạng cấu trúc hình cầu với nucleocapside đối xứng hình khối bao bọc lớp màng ngồi Virion có đường kính 40-50 nm, đường kính khối nucleocapside 29 nm bao bọc sợi ARN virus Bề mặt virion có gai lồi 6-8 nm, thành phần có tính chất bảo vệ hạt virus Bộ gen virus chuỗi đơn ARN có độ dài 12KB ( Nguyễn Như Thanh cs, 1997) Virus có glycoprotein E155 E146 KD bề mặt nucleocapside protein 36KD Hệ số sa lắng 140s – 180s Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 Hình : Cấu trúc virus DTL (Nguyễn Ngọc Hải, 2009) 2.2.3 Phân loại virus Năm 1939, Geiger kệt luận: khơng có khác tính kháng nguyên ( KN) để xếp chủng virus DTL vào nhiều type virus khác ( Nguyễn Vĩnh Phước, 1970) Nhưng từ năm 1950, số tác giả phát hiện tượng biến chủng virus DTL nhận thấy độc lực virus biến chủng thấp độc lực virus ban đầu ( Trần Đình Từ, 1990) Theo Van Oirschot ( 1985), chủng virus DTL chia làm hai nhóm:  Nhóm I: Gồm chủng virus cường độc Alfort, chủng C, chủng Thiveval  Nhóm II: Gồm chủng 331 nhiều chủng khác phân lập từ lợn mắc bệnh mạn tính Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 Mới nghiên cứu dịch tễ học phân turwcho thấy virus DTL có nhóm ( Ken Inui Nguyễn Tiến Dũng, 2003):  Nhóm I: hầu hết chủng phân lập từ trước thập kỉ 70 Châu Âu Mỹ  Nhóm II: chủng phân lập gần Châu Âu Châu Á  Nhóm III: Chỉ có Châu Á, trừ số chủng phân lập Anh năm 1966 Ở Việt Nam, nhóm I tồn đến năm 1991 Bệnh DTL nhóm II gây Theo Nguyễn Tiến Dũng ( 2002): số lượng chủng virus DTL phân lập thuộc nhóm tăng lên từ năm 1997 Trước đây, người ta cho kháng nguyên (KN) virus DTL đồng Ngày nay, với kỹ thuật kháng thể đơn dòng (MCAS), người ta phân biệt virus DTL thành số nhóm kháng nguyên ( Ewards.S,1998) Như vậy, tự nhiên tồn chủng virus có độc lực khác Những chủng có độc lực cao thường gâu bệnh thể cấp tính với tỉ lệ chết cao, chủng có độc lực trung bình gây bệnh thể cấp tính mạn tính Các chủng có độc lực thấp thường gây chết bào thai lợn sơ sinh Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Hình 4: Liệt chân sau Hình 6: xuất huyết chân thân Trần Thị Vân Anh- 2016 Hình : mắt sung , có nhử mắt Hình 7: Xuất huyết tai 4.2 CÁC TỔN THƯƠNG ĐẠI THỂ Ở LỢN MẮC BỆNH DỊCH TẢ Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 Bên cạnh việc quan sát triệu chứng, để giúp phần chẩn đốn xác bệnh, tiến hành mổ khám mẫu lợn ghi lại bệnh tích đại thể Qua nghiên cứu cho thấy: tổn thương như: xuất huyết hạch lympho, xuất huyết hạch màng treo ruột, , tích nước xoang ngực, xoang bao , xuất huyết điểm thận, nhồi huyết lách…Kết ca mổ khám chúng tơi trình bày bảng 4.2 Bảng 4.2 Kết khảo sát tổn thương đại thể lợn nghi mắc dịch tả TỔN THƯƠNG STT BỆNH LÝ Xuất huyết hạch màng treo ruột xuất huyết hạch Lympho tích nước xoang bụng, SỐ LỢN SỐ LỢN NGHIÊN CỨU DƯƠNG TÍNH TỶ LỆ (CON) (CON) 15 15 100% 15 15 100% 15 12 80% sung huyết dày ruột 15 53.33% xuất huyết điểm thận 15 15 100% nhồi huyết lách 15 11 73.33% xuất huyết ngoại tâm mạc 15 53.33% 10 11 12 13 phế quản phế viêm thùy phế viêm xuất huyết ruột non xuất huyết dày xuất huyết ruột già loét ruột già 15 15 15 15 15 15 10 12 5 66.67% 53.33% 80% 33.33% 33.33% 6.67% Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 14 xuất huyết van hồi manh tràng 15 26.67% 15 xuất huyết hạch Amydale 15 20% xuất huyết quan 15 nội tạng khác xuất huyết điểm bốn 17 15 12 chân xuất huyết điểm 18 15 vùng da khác Qua kết ta thấy lợn bị bệnh dịch tả có biểu xuất huyết 16 20% 80% 33.33% hầu hết quan: hạch lâm ba, thận, dày, ruột non, ruột già, da… Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Trần Thị Tố Liên Đào Trọng Đạt (1985 – 1989), lợn bị nghi mắc bệnh dịch tả có tổn thương đại thể nhồi huyết lách, xuất huyết hình đinh ghim thận, hạch lympho sung, xuất huyết giống đá hoa vân Theo Nguyễn Tiến Dũng (1990) Van Oirschot (1991), tổn thương nhồi huyết lách tổn thương định chẩn đoán bênh DTL tỷ lệ 2565% Trong nghiên cứu kennydy Palmer (2006) Tỷ lệ nhồi huyết lách tùy theo độc lực virus gây bệnh dao động từ – 87% Trong nghiên cứu tổn thương đại thể nhồi huyết lách chiếm tỷ lệ 73.33% Như vậy, độc lực virus gây bệnh cho lợn nghiên cứu chủng virus có độc lực cao Theo chúng tơi, ngun nhân dẫn đến tổn thương sung huyết, xuất huyết, nhồi huyết, tích nước xoang virus nhân lên nhiều tế bào nội mô mạch quản từ gây tổn thương thành mạch dẫn đến bệnh tích đặc trưng DTL như: sung huyết dày-ruột, xuất huyết nhiều quan, nhồi Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 huyết lách Cơ quan thích hợp cho virus nhân lên tỷ lệ xuất bệnh tích cao: hạch, lách… quan đích thứ cấp mà thích hợp cho virus nhân lên biểu với tỷ lệ thấp ruột già (33.33%) Xuất huyết hạch lympho, hạch màng treo ruột với tỷ lệ 100% hạch lâm ba vị trí mà virus lưu trú, nhân lên, công phá hủy quan Sau xâm nhập, virus nhân lên hạch lâm ba theo tuần hoàn máu đến quan, có quan hơ hấp, đặc biệt phổi Tại chúng nhân lên gây viêm phổi: phế quản phế viêm (66.67%), thùy phế viêm (53.33%) Virus gây hoại tử nang lâm ba riêng biệt từ hình thành mụn lt miệng hạch amygdale Đặc biệt ruột già, gây hoại tử , virus làm đơng sợi huyết tạo nên nốt loét hình cúc áo MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ CỦA LỢN MẮC BỆNH DỊCH TẢ Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Hình 8: Hạch hàm xuất huyết 2016 Trần Thị Vân Anh- Hình 9: Hạch bẹn nơng xuất huyết Hình 10 :Xuất huyết điểm vỏ thận(bên trái) bể thận(bên phải) Hình 11:Sưng, xuất huyết hạch MTR Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Hình 12: xuất huyết sụn quản Hình 14: Khí quản xuất huyết Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam Trần Thị Vân Anh- 2016 Hình 13: xuất huyết điểm niêm mạc dày Hình 15: Lách nhồi huyết Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 4.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG RT-PCR ĐỂ CHẨN ĐỐN CHÍNH XÁC LỢN MẮC BỆNH DỊCH TẢ Các mẫu lợn sau quan sát , ghi chép triệu chứng lâm sàng, tiến hành mổ khám lựa chọn mẫu bệnh phẩm điển hình bệnh CSF, sau chẩn đốn đặc hiệu kỹ thuật RT-PCR Trong nghiên cứu , ưu tiên chọn hạch Lympho Sau mổ khám tiến hành nghiền mẫu chày cối vô trùng, sau cho vào ống Eppendorf 1,5ml (1 ống dùng phương pháp RT-PCR, ống dùng phương pháp hóa miễn dịch tế bào) Các mẫu dùng Kit Promega để tách lấy RNA RNA bệnh phẩm sau thu chạy PCR để giám định có mặt virus CSF bệnh phẩm hay không Sản phẩm sau khuếch đại điện di chụp ảnh gel Kết phản ứng RT-PCR xác định CSFV trình bày bảng 4.3 hình 15 Kết điện di kiểm tra sản phẩm cho thấy tất 15 nghi mắc CSF cho kết dương tính với CSF Sản phẩm điện di cho vạch DNA tương ứng 200bp theo thiết kế mồi Hình ảnh kiểm tra sản phẩm RT-PCR sau thực với mồi Dưới kết điện di phản ứng RT-PCR Hà Nội ( Hình 4), kết cho thấy mẫu lợn nghi mắc CSF (kí hiệu: C1, C2, C3, C4, C5) dương tính với CSF Tương tự , chúng tơi có kết chẩn đốn bệnh phương pháp RT-PCR Bắc Ninh, Hưng Yên Kết chẩn đốn virus CSF phương pháp RT-PCR trình bày bảng Bảng 4.3 Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 Hình 16 : Kết điện di mẫu lợn Bắc Ninh Mồi xuôi CSF : 5’- CCTGAGGACCAAACACATGTTG - 3’ Mồi ngược CSF : 5’- TGGTGGAAGTTGGTTGTGTCTG – 3’         Giếng 1: Thang chuẩn M ( 100bp) Giếng : Con số nghi mắc CSF Giếng : Con số nghi mắc CSF Giếng : Con số nghi mắc CSF Giếng 5: Con số nghi mắc CSF Giếng 6: số nghi mắc CSF Giếng : Đối chứng âm (ĐC -) Giếng : Đối chứng dương (ĐC +) So với thang chuẩn DNA ( 100bp ladder) giếng đối chứng dương( +) cho vạch DNA tương ứng 200bp ( theo thiết kế mồi, giếng đối chứng âm, đối chứng dương cho kết dự kiến : đối chứng âm không cho vạch hay sản phẩm PCR-DNA, đối chứng dương cho vạch Các đối chứng dương đối chứng âm tron g thí nghiệm cho kết phản ứng đáng tin cậy Bảng 4.3 : kết chẩn đốn virus CSF phương pháp RT-PCR Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- SỐ CON DƯƠNG TÍNH (CON) 2016 STT MẪU LỢN SỐ LỢN NGHI MẮC ( CON) Hà Nội 5 100% Bắc Ninh 5 100% Hưng Yên 5 100% Tổng 15 15 100% TỶ LỆ (%) 4.4: KẾT QUẢ PHÂN LẬP VIRUS CSF Dựa kết RT-PCR dương tính, tiến hành chọn mẫu hạch Lympho để chuẩn bị cho gây nhiễm virus môi trường tế bào PK15 Các mẫu hạch lympho nghiền lưu tủ -80, chờ dã đơng tự nhiên, ly tâm 1500 vòng/phút vòng phút, sau thu lớp dịch phía chứa virus Tiến hành lọc huyễn dịch bên màng lọc Fillter có kích thước lỗ lọc 0,45µl Phân lập virus CSF thực tế bào PK15 mô tả trước với sửa đổi.Tế bào PK15 ni cấy trì mơi trường thiết yếu tối thiểu ( DMEM) có bổ sung 10% FCS, mM l-glutamine, 0,05 mg / ml gentamicin, 10 UI/ ml penicillin, 10 mg / ml streptomycin, 0,25 mg / ml amphotericin Tế bào PK15 ni cấy bình T25 Hàng ngày theo dõi phát triển tế bào PK15 kính hiển vi soi Khi tế bào PK15 mọc 80% tiến hành gây nhiễm vào khay 24 giếng/ giếng cho 1ml mơi trường DMEM+tế bào PK15 50µl dịch virus.Các tế bào gây nhiễm ủ 37°C với 5%CO2 Hàng ngày theo dõi bệnh tích tế bào kính hiển vi soi Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 Kết cho thấy sau 72 (3 ngày) khơng xuất bệnh tích tế bào CPE Các vius đông lạnh dã đông lần , phần dịch thu để gây nhiễm vào tế bào PK15 cho đời phân lập thứ hai (F2) Tương tự tiến hành gây nhiễm đời F3, F4, F5 Ở đời F5 sau gây nhiễm 48-60h tiến hành cố định virus làm hóa miễn dịch tế bào Hình 16 : Tế bào PK15 chưa gây nhiễm Hình 17: Tế bào PK15 gây nhiễm CSFV 4.5 KẾT QUẢ HÓA MIỄN DỊCH TẾ BÀO Sau gây nhiễm CSFV đời thứ nuôi tế bào 48-60 giờ, tiến hành cố định virus Methanol lạnh làm hóa miễn dịch tế bào mang soi xem kết kết dương tínhthì có đám hạt bắt màu vàng nâu, âm tính: khơng quan sát thấy lên màu Hình 18, hình 19 Kết cho thấy tất 15 mẫu có diện virus, có đám hạt màu vàng nâu Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Hình 18: Tế bào khơng có CSFV( âm tính) Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam Trần Thị Vân Anh- 2016 Hình 19: Có CSFV tế bào ( dương tính) Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu lợn mắc bệnh dịch tả rút kết luận sau: Lợn mắc bệnh dịch tả có số triệu chứng lâm sàng điển hình như: lợn sốt cao, có nhử mắt, thở khó, táo bón, xuất huyết điểm bốn chân sảy thai lợn nái chửa Ngồi có số triệu chứng khác như: ủ rũ, ăn, bỏ ăn, xuất huyết vùng da khác, ỉa chảy, tím tai, tím da, rét run, lợn dồn đống Nếu bệnh nặng có biểu thần kinh, liệt hai chân sau Các tổn thương đại thể: xuất huyết hạch màng treo ruột, xuất huyết hạch lympho với tỷ lệ cao ( 100%) Xuất huyết điểm thận, nhồi huyết lách, sung huyết dày – ruột, xuất huyết điểm bốn chân bệnh tích đại thể đặc trưng cho bệnh DTL Các tổn thương đại thể khác như:tích nước xoang bụng, loét ruột già Các tổn thương vi thể bao gồm: sung huyết, xuất huyết, loét, hoại tử tế bào quan như: ruột non, ruột già, phổi, thận, lách, hạch lympho… Kết hóa miễn dịch tế bào cho thấy 15 mẫu lợn chẩn đốn dương tính kỹ thuật RT-PCR xuất virus CSF, quan sát rõ kính hiển vi soi ngược 5.2 ĐỀ NGHỊ Tiếp tục ứng dụng RT-PCR với loại mẫu bệnh phẩm khác huyết thanh, phân … để chẩn đoán phát virus CSF sớm từ đưa biện pháp điều trị bệnh đạt hiệu cao giảm thiệt hại cho người chăn nuôi Tiếp tục nghiên phương pháp Hóa miễn dịch tế bào chẩn đoán bệnh CSF nghiên cứu tập trung chủ yếu virus CSF tế bào PK15 Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 Áp dụng phương pháp chẩn đốn bệnh CSF kỹ thuật hóa miễn dịch tế bào phòng thí nghiệm bệnh lý phương pháp đơn giản, rẻ tiền xác TÀI LIỆU THAM KHẢO Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: Bùi Quang Anh(2001), nghiên cứu dịch tễ học bệnh dịch tả lợn biện pháp phòng chống số tỉnh thuộc vùng Bắc Trung Bộ, Luận án Tiến sỹ Nông Nghiệp, Viện Thú Y Quốc Gia, Hà Nội Nguyễn Tiến Dũng (2002), “lớp tập huấn hội thảo phương pháp khống chế chẩn đoán bệnh DTL Việt Nam”, Hội thảo tập huấn Chẩn đoán bệnh dịch tả lợn, ngày 7-11/10/2002, Viện Thú Y Quốc Gia, Hà Nội Nguyễn Tiến Dũng (2005), “Kit chẩn đoán bệnh dịch tả lợn”, Báo cáo tổng kết KHKT Đề tài KC.04.16.02 Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2011) , Giáo trình Bệnh Truyền nhiễm thú y, NXB Đại học Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Ngọc Hải (10/2009), “ Protein tái tổ hợp virus dịch tả heo” Đào Trọng Đạt, Trần Tố Liên, “Tình hình dịch tễ bệnh dịch tả lợn Việt Nam vấn đề phòng chống”, Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật Thú Y 1979-1984, tr 5-10 Mesplede A., E.Albina, F Madec (1998), Dịch tả lợn cổ điển vấn đề thời sự: tình hình bệnh đáng sợ này, ( Nguyễn Tấn Dũng dịch).Hội thú y Việt Nam, Hà Nội Trần Đình Từ (1990), Bệnh dịch tả lợn, tài liệu giảng dạy, trung tâm nghiên cứu Thú Y- Công ty thuốc thú y TW II B TÀI LIỆU TIẾNG ANH Lorette C.Javois “ Immunocytochemical Methods and Protocols” Chander V, Nandi S, Ravishankar C, Upmanyu V, Verma R Classical swine fever in pigs: recent developments and future perspectives Anim Health Res Rev 2014;15(1):87-101 Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp K56TYB Trần Thị Vân Anh- 2016 Hog Cholera, “ Swine Fever, European Swine Fever, Peste du Porc, Colera Porcina, Virusschweinepest”.2015 http://www.genetex.com: Protocol: Immunocytochemistry (ICC) http://www.ihcworld.com/immunocytochemistry.htm: Immunocytochemistry Methods, Techniques and Protocols Overview of Antibody Use in Immunocytochemistry Su-Yau Mao, Lorette C Javois, and Ute M Kent Van Oirschot (1992), Hog cholera in disease of swine, 5th Edition Iowan, pp 224-230 Van Oirschot, Terstra C.(1997) A congenital persistent swine fever infection Clinical and virological observation, Vet Micro, 2pp 121-132 Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Khoa thú y ... lâm sàng chủ yếu lợn mắc bệnh dịch tả - Các tổn thương đại thể lợn mắc bệnh dịch tả - Các tổn thương vi thể quan: thận, ruột, lách, hạch lympho… lợn mắc bệnh dịch tả nuôi cấy tế bào - Thử nghiệm... chất tế bào không gây bệnh tích tế bào Thế hệ virus giải phóng khỏi tế bào khoảng 5-6h sau gây nhiễm Theo Saatkamp H.W ( 1998), môi trường tế bào virus lây lan sang tế bào bên cạnh từ tế bào mẹ... Một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu bệnh Dịch Tả Lợn (CSF-Classical Swine Fever)” Ứng dụng kỹ thuật hóa miễn dịch tế bào chẩn đốn bệnh “ Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam Khoa thú y Khóa Luận Tốt Nghiệp