Nghiên cứu bệnh héo vàng chuối (fusarium oxysporum f sp cubense) ở hà nội

Một số đặc điểm của bào tử phân lập từ nấm gây bệnh héo vàng nuôi cấy trên các môi trường .... 18 mẫu bệnh héo vàng trên các nhóm chuối tây, chuối lá và chuối tiêu đã được sưu tầm, phân

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VI T Ệ

NAM

ĐỖ THỊ VĨNH HẰNG

(Fusarium oxysporum f sp cubense) Ở HÀ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quảnghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từngdùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã đượccám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Đỗ Thị Vĩnh Hằng

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc TS Nguyễn Đức Huy, Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và TS Trần Ngọc Hùng, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu rau quả đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên K57, K58 cùng làm việc trong phòng thí nghiệm đã hỗ trợ tôi theo dõi các thí nghiệm và chăm sóc vườn cây trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Đỗ Thị Vĩnh Hằng

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng .vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn .ix

Thesis abstract .x

Phần1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Phần 2 Tổng quan nghiên cứu 3

2.1 Tổng quan về cây chuối 3

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại 3

2.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối 6

2.2 Tổng quan về bệnh héo vàng fusarium chuối 10

2.2.1 Bệnh nấm Fusarium oxysporum trên các cây trồng nói chung 10

2.2.2 Lịch sử nghiên cứu bệnh héo vàng Fusarium trên cây chuối 11

2.2.3 Thiệt hại do nấm bệnh héo vàng Fusarium trên cây chuối 13

2.2.4 Các phương pháp phân loại quần thể nấm

14 2.2.5 Phân loại nấm Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc) 16

2.2.6 Triệu chứng biệu hiện bệnh 18

2.2.7 Tính gây bệnh của nấm Foc 19

2.2.8 Chu kỳ bệnh 20

2.2.9 Các con đường lan truyền bệnh .

21 2.2.10 Các yếu tố bên ngoài ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh

21 2.2.11 Phòng trừ nấm Fusarium gây bệnh héo trên chuối 22

Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 24

3.1 Đối tượng 24

4 3.2 Vật liệu 24

3.2.1 Các mẫu bệnh 24

3.2.2 Mẫu giống chuối đánh giá tính gây bệnh 24

3.2.3 Các hóa chất và thiết bị được sử dụng trong các thí nghiệm 24

3.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

3.4 Nội dung nghiên cứu 27

3.5 Các phương pháp nghiên cứu 27

3.5.1 Phương pháp điều tra bệnh ngoài đồng ruộng 27

3.5.2 Phương pháp thu mẫu bệnh và phân lập nấm 27

3.5.3 Phương pháp xác định đặc điểm phân loại và hình thái nấm 28

3.5.4 Phương pháp phân loại nấm bằng cách xác định sự có mặt của chất thơm khi nuôi cấy nấm trong môi trường cơm 28

3.5.5 Xác định chủng nấm Foc bảng chỉ thị phân tử 28

3.5.6 Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của VSV 29

3.5.7 Phương pháp lây bệnh nhân tạo 30

3.5.8 Phương pháp xử lý số liệu 31

Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 32

4.1 Kết quả điều tra, thu thập và phân lập tác nhân gây bệnh héo vàng chuối tại Hà Nội 32

4.1.1 Tình hình bệnh héo vàng chuối tại một số vùng ở Hà Nội 32

4.2 Kết quả phân tích nấm Foc trên môi trường cơm 35

4.3 Kết quả phân tích nấm Foc trên môi trường K2 (komada) điều chỉnh 37

4.4 Xác định nấm Foc qua lây bệnh nhân tạo 39

4.5 Giám định nấm Foc-4 bằng kỹ thuật PCR 41

4.6 Đặc điểm phân loại và hình thái tản nấm 42

4.6.1 Đặc điểm hình thái tản nấm Foc trên môi trường PDA 42

4.6.2 Đặc điểm phân loại 43

4.7 Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm Foc 44

4.7.1 Sinh trưởng và phát triển của nấm Foc gây bệnh héo vàng chuối trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo 44

4.7.3 Ảnh hưởng của độ pH đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Foc gây bệnh héo vàng trên cây chuối 47

4.8 Kết quả khảo sát hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma sp đối với hai mẫu nấm PT1 (Foc-1) và MC1 (Foc-4) trong phòng thí nghiệm 48

4.9 Đánh giá tính gây độc của nấm Foc chủng 4 (mẫu MC1) và thử nghiệm

khả năng phòng trừ mẫu nấm này trên 08 giống chuối tiêu bằng chế

phẩm Trichoderma sp trong môi trường chậu vại 50

4.9.1 Đánh giá tính gây độc của nấm Foc chủng 4 (mẫu MC1) trên 08 mẫu giống chuối 50

4.9.2 Thử nghiệm khả năng phòng trừ nấm Foc chủng 4 (mẫu MC1) trên 08 giống chuối tiêu bằng chế phẩm chứa nấm Trichoderma sp trong điều kiện chậu vại 52

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 56

5.1 Kết luận 56

5.2 Kiến nghị 57

Tài Liệu Tham Khảo 58

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

CLA Carnation Leaf piece Agar medium

CS Cộng sự

ĐC Đối chứng

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

Foc Fusarium oxysporum f.sp cubense

K2 Komada modified media

PCR Polymerase Chain Reaction

PDA Potato Dextrose Agar

SNA Spezieller Nährstoffarmer agar VCGs Vegetative compatibility groups

WA Water agar

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Chỉ tiêu xác định sự khác biệt giữa Musa acuminata colla và Musa

balbisiana 5

Bảng 2.2 Sản lượng một số nước chuối thế giới năm 2013 7

Bảng 2.3 Tình hình xuất khẩu chuối trên thế giới năm 2013 8

Bảng 2.4 Diện tích và sản lượng các loại cây ăn quả năm 2013 9

Bảng 2.5 Diện tích, sản lượng và năng suất chuối ở Hà Nội 10

Bảng 4.1 Tỷ lệ bệnh héo vàng chuối tại một số vùng ở Hà Nội 32

Bảng 4.2 Kết quả thu thập và phân lập tác nhân gây bệnh héo vàng chuối (Fusarium oxysporum f.sp cubense) tại Hà Nội 34

Bảng 4.3 Kết quả xác định, phân lập nấm Foc trên môi trường cơm sau 15 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng (25 - 27oC) 36

Bảng 4.4 Đặc điểm hình thái tản nấm Foc trên môi trường K2 điều chỉnh 38

Bảng 4.5 Kết quả lây bệnh nhân tạo nấm Foc trên cây chuối tây và tiêu hồng 39

Bảng 4.6 Kết quả phân lập lại mẫu thân cây chuối tây và chuối tiêu bị bệnh héo vàng do lây bệnh nhân tạo 40

Bảng 4.7 Đặc điểm hình thái tản nấm Foc trên môi trường PDA 42

Bảng 4.8 Một số đặc điểm của bào tử phân lập từ nấm gây bệnh héo vàng nuôi cấy trên các môi trường 44

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của một số môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Foc 44

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của các ngưỡng nhiệt độ đến phát triển của các mẫu phân lập nấm Foc tại Hà Nội 46

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của các mẫu phân lập nấm Foc tại Hà Nội 47

Bảng 4.12 Hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma sp với mẫu nấm MC1 49

Bảng 4.13 Hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma sp với mẫu nấm MC1 49

Bảng 4.14 Đánh giá tính gây bệnh của nấm Fusarium oxysporum f sp cubense chủng 4 trên 08 mẫu giống chuối tiêu 51

Bảng 4.15 Phân tích thống kê hiệu lực phòng trừ nấm Foc-4 gây bệnh héo vàng chuối bằng chế phẩm Trichoderma sp trên một số mẫu giống chuối trong nhà lưới 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Tình hình sản xuất chuối giai đoạn 2000-2013 9

Hình 2.2 Các dạng bào tử của nấm Fusarium oxyporum 18

Hình 4.1 Một số địa điểm điều tra và thu thập mẫu bệnh héo vàng chuối Fussarium ở Hà Nội 33

Hình 4.2 Chuối tiêu vàng lá tại Minh Châu - Ba Vì 34

Hình 4.3 Triệu chứng cây chuối bị héo vàng được sử dụng để phân lập nấm gây bệnh 35

Hình 4.4 Phân lập tác nhân gây bệnh héo vàng chuối 35

Hình 4.5 Nuôi cấy nấm Foc trên môi trường cơm 37

Hình 4.6 Đặc điểm của tản nấm Foc trên môi trường K2 điều chỉnh 38

Hình 4.7 Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo trên một số mẫu giống chuối 40

Hình 4.8 Đánh giá triệu chứng cây bị bệnh héo vàng sau khi lây bệnh 5 tháng 41

Hình 4.9 Ảnh điện di xác định chủng Foc-4 (463bp) 41

Hình 4.10 Các dạng bào tử của nấm Foc 43

Hình 4.11 Thử nghiệm hiệu lực ức chế của nấm Trichoderma sp đối với nấm Foc trên PDA 50

Hình 4.12 Thử nghiệm phòng trừ nấm Foc-4 gây bệnh héo vàng trên chuối tiêu bằng chế phẩm nấm Trichoderma sp 54

Xác định các chủng nấm Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc) gây bệnh héo

vàng chuối ở Hà Nội và đánh giá tính gây bệnh của chúng trên một số mẫu giống chuối.

Phương pháp nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành điều tra, thu thập các mẫu bệnh ở năm xã thuộc khu vực Hà Nội 18 mẫu bệnh héo vàng trên các nhóm chuối tây, chuối lá

và chuối tiêu đã được sưu tầm, phân lập, phân loại, nghiên cứu đặc điểm sinh học bằng các môi trường: WA, PDA, SNA, CLA, cơm, K2; lây bệnh nhân tạo và phản ứng PCR Thử nghiệm phòng trừ các chủng nấm này trong phòng thí nghiệm và trong nhà lưới

bằng nấm đối kháng Trichoderma sp.

Kết quả chính và kết luận

Bệnh héo vàng chuối do nấm Fusarium oxysporum f.sp cubense xuất hiện trong

cả 5 địa điểm được điều tra Các cây chuối bị bệnh có biểu hiện lá héo vàng (các lá dưới thường vàng trước rồi lan dần lên các lá trên), nứt thân giả, củ xuất hiện màu nâu đỏ, bó mạch xuất hiện mạch màu nâu đỏ Đã xác định được 2 chủng nấm gây bệnh trên các vùng điều tra là chủng 1 và chủng 4 thông qua việc quan sát các đặc điểm đặc trưng trên các môi trường PDA, SNA, CLA, cơm, K2, giám định bằng PCR và lây bệnh nhân tạo Qua quá trình nghiên cứu cũng cho thấy K2 là môi trường đơn giản, nhanh để chẩn

đoán các chủng nấm gây bệnh và phân biệt các loài Fusarium khác nhau Các chủng

nấm này phát triển tốt trên môi trường PDA trong điều kiện pH từ 6 – 9, nhiệt độ 25 –

30oC Thử nghiệm phòng trừ các chủng nấm này bằng chế phẩm nấm đối kháng

Trichoderma sp trong phòng thí nghiệm cho thấy hiệu lực tương đối tốt Tuy nhiên kết

quả phòng trừ bằng chế phẩm này trong nhà lưới chưa cho hiệu lực rõ rệt.

1 0

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Do Thi Vinh Hang

Thesis title: Studies on Panama disease of banana (Fusarium oxysporum f sp.

cubense)

in Hanoi

Major: Plant Protection Code: 60 62 01 12

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture

(VNUA)

Research Objectives

To identify races of Fusarium oxysporum f sp cubense in Hanoi caused Pannama disease (Fusarium wilt) of banana in Hanoi and pathogenicity tets of races using

diferent current banana verieties.

Materials and Methods

Field surveys of Fusarium wilt of banana was done in five different districts in Hanoi Eighteen samples showing Fusarium wilt like symptoms were collected from ‘chuoi tay’,

‘chuoi la’ and ‘chuoi tieu’ The pathogen was isolated and characterzied using media

WA, PDA, SNA, CLA, K2 modified and PCR using specific primers Pathogenicity

test was done using 8 different banana varieties Trichoderma sp was used as

antagonistic fungi to control pathogen of Fusarium wilt.

Main findings and conclusions

Field surveys showed that Fusarium wilt (Panama disease) is the most serious diseases

of banana in Hanoi The disease incidence ranged from 8,33% to 73,17% in 2016 Three varieties of banana named ‘chuoi tay’, ‘chuoi tieu’ and ‘chuoi la mat’ were infected by Fusarium In this study, 18 samples showed Fusarium wilt like symptoms were collected from five different districts in Hanoi The pathogen was isolated using PDA and other culture media Based on morphology characteristics on PDA, K2 modified and PCR using specific primers The pathogen of Fusarium wilt was identified as

Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) including race 1 and race 4 The results of studies on biological characteristics showed that Foc grew and developed well on PDA

medium, temperate range of 25-30oC and pH6-9 Mycilium of Foc was 90 mm after seven-eight days of inoculation Pathogenicity test indicated that Foc-1 infected only

‘chuoi tay’ whereas Foc-4 infected both ‘chuoi tay’ and ‘chuoi tieu’ In vitro assays using culture test demonstrated that antagonistic fungi, Trichoderma sp., had inhibitory ability against growth of both Foc-1 and Foc-4 However, inhibitory ability of Trichoderma against Foc-4 was unclear in greenhouse experiment.

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Chuối là tên gọi các loài cây thuộc chi Musa có thân thảo lớn và là cây

mang lại nguồn thu chủ yếu cho phần đông cư dân tại các vùng ẩm trên thế giới

Đại đa số các giống chuối trồng thuộc thể tam bội, loài Eumusa, họ Musaceae.

Việt Nam nằm trong khu vực khởi nguyên cây chuối, do vậy chúng ta có mộtnguồn tài nguyên di truyền cây chuối rất phong phú bao gồm giống chuối trồng,chuối bán hoang dại và chuối hoang dại (Nguyễn Đăng Khôi, 1997) Ở nước ta,chuối là cây ăn quả quan trọng, đứng hàng đầu về diện tích và sản lượng Đã từlâu, chuối được trồng khắp từ Bắc vào Nam và là nguồn hydrat cacbon, đường vàvitamin quan trọng trong đời sống hàng ngày; là mặt hàng có giá trị kinh tế đốivới thị trường trong nước cũng như trên thế giới

Tại Quyết định phê duyệt quy hoạch phát triển rau quả và hoa cây cảnh đếnnăm 2010, tầm nhìn 2020 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, chuốiđược xác định là loại cây ăn quả xuất khẩu chủ lực của nước ta Theo quy hoạch,đến năm 2020, tổng sản phẩm chuối quả xuất khẩu tương đương dứa đạt 100ngàn tấn và kim ngạch xuất khẩu chỉ đứng sau dứa và thanh long đạt 35 triệuUSD (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2007)

Tuy nhiên sản xuất chuối ở nước ta gặp nhiều trở ngại do các bệnh gây hại

đặc biệt là bệnh héo vàng do nấm Fusarium (hay còn gọi là bệnh héo vàng Panama, bệnh héo rũ) do nấm Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc) gây ra.

Bệnh thường gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây nhưng mạnh nhất

là giai đoạn cây trưởng thành, ra hoa, tạo quả làm cho cây bị héo vàng rồi chết.Theo FAO, dịch bệnh này đang đặt ra một mối đe dọa nghiêm trọng đến sản xuất

và xuất khẩu chuối ở nhiều nước trên thế giới, tác động xấu đến chuỗi giá trị vàsinh kế của người nông dân

Ở Việt Nam, bệnh này phát sinh ở hầu hết các địa phương trồng chuối trongphạm vi cả nước, người trồng chuối còn ít hiểu biết về bệnh và bệnh đang có xuhướng lan rộng Nấm gây bệnh này được chia thành 4 chủng dựa trên việc gâybệnh trên các giống, loài chuối khác nhau Chủng 1 và chủng 2 gây hại các giống

chuối Lady Finger, Gross Michel và đã gây ra những thiệt hại nặng nề cho ngành

công nghiệp chuối xuất khẩu ở Trung và Nam Mỹ các năm nửa đầu thế kỷ 20

Sau đó, để hạn chế tác hại của nấm, người ta đã thay giống Gross Michel bằng

các giống thuộc nhóm Cavendish (chuối tiêu) kháng với chủng 1 và chủng 2.

Nhờ đó, ngành công nghiệp chuối xuất khẩu được phục hồi ở các nước này Tuynhiên, gần đây đã xuất hiện chủng 4 gây hại ở hầu hết các giống chuối kể cả các

giống thuộc nhóm Cavendish, nhóm chuối chính được trồng để xuất khẩu trên thế giới Chủng 4 đã từng phá hủy 23.000ha chuối Cavendish ở Đài Loan những năm 70 của thế kỷ hai mươi (Su et al., 1977) và các đồn điền trồng chuối ở các

nước: Philippine, Indonesia, Malaysia, Australia, Nam Phi, Canary Islands

(Bentley et al., 1998).

Ở Việt Nam nhiều nghiên cứu giai đoạn trước năm 2013 đều xác định bệnh

héo vàng chỉ hại trên chuối tây và do nấm Foc chủng 1 (Nguyễn Văn Khiêm,

2000) Song điều đáng quan ngại là trong những năm gần đây bệnh héo vàng trênchuối tiêu do chủng 4 đang lan rộng ở các nước trồng chuối trên thế giới và trongkhu vực trong đó có các tỉnh phía Nam Trung Quốc do đó nguy cơ lây bệnh ởnước ta là rất cao

Hà Nội là vùng đất được kiến tạo bởi hệ thống sông Hồng có các điều kiện

tự nhiên (khí hậu, thổ nhưỡng, nguồn nước ) rất phù hợp cho cây chuối pháttriển do đó nhiều vùng trồng chuối hàng hóa được quy hoạch tại khu vực bãi dọctheo sông Hồng Đây cũng là vùng dịch bệnh héo vàng trên chuối diễn biến phứctạp, nhiều hộ nông dân gặp khó khăn trong việc quản lý và phòng trừ bệnh này

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu bệnh héo vàng chuối (Fusarium oxysporum f sp cubense) ở Hà Nội.

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục đích

Xác định chủng nấm Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc) gây bệnh

héo vàng chuối ở Hà Nội và đánh giá tính gây bệnh của các chủng nấm này trênmột số mẫu giống chuối

1.2.2 Yêu cầu

- Điều tra hiện trạng (tỷ lệ) bệnh héo vàng gây hại trên cây chuối ở Hà Nội

- Thu thập mẫu bệnh, phân lập và xác định chủng nấm Foc gây bệnh héo

vàng trên một số giống chuối ở khu vực Hà Nội

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh học của nấm Foc.

- Đánh giá tính gây bệnh của các chủng nấm trên một số mẫu giống chuối

- Thử nghiệm hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma sp đối với nấm

Foc trong phòng thí nghiệm và trong nhà lưới.

nhóm giống chuối Trong đó nhóm Cavendish mang kiểu gen AAA với rất nhiều

giống chuối tiêu thương mại đang được trồng rộng rãi ở nhiều quốc gia và vùnglãnh thổ Các nghiên cứu về chọn tạo giống và phát triển sản xuất chuối chủ yếuđược thực hiện đối với nhóm này (Simmond and Shepherd, 1955)

Cho đến nay vẫn còn có ý kiến trái ngược nhau về nguồn gốc của cây

chuối Tuy nhiên, theo Stover and Simmonds (1987); Valmayor et al (2002),

nguồn gốc phát sinh của cây chuối là một vùng rộng lớn bao gồm Ấn Độ, cácnước vùng Đông Nam châu Á và khu vực Thái Bình Dương Ngày nay cây chuối

đã được phát triển ở hầu khắp các vùng nhiệt đới ẩm trên thế giới Người ta đãtìm thấy sự đa dạng về nguồn gen cây chuối không chỉ ở nơi phát sinh nguồn gốc

mà còn ở khu vực Nam Mỹ, Đông Phi và Tây Phi

2.1.1.2 Phân loại

Theo Simmond and Shepherd (1955), cây chuối nằm trong bộ gừng

Zingiberales, họ Musaceae, chi Musa Chi Musa theo truyền thống được phân

chia thành 5 phân chi là Ingentimusa, Australimusa, Callimusa,

Enmusa và Rhodochlamys nhưng chúng được cô gọn lại thành 3 vào năm 2002.

Trước đây các loài với nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 20 được chia ra trong 2

phân chi Australimusa và Callimusa, còn các loài với 2n = 22 được chia tách trong các phân chi Musa và Rhodochlamys Ở thời điểm hiện tại thì phân chi

Ingentimusa với 2n = 14 vẫn còn nhiều bí ẩn khác biệt.

Ở họ Musaceae có 2 chi Ensete và Musa Chúng rất giống nhau ở bộ lá và

dạng cây song có một số đặc điểm lại rất khác nhau:

Chi Ensete có bộ lá giống lá chuối nên một thời gian dài người ta xếp chúng vào họ Musaceae Đây là loại cây thân thảo chỉ sinh sản một lần, thân ngầm

không bao giờ đẻ nhánh Hoa và lá bắc dính liền nhau vào cuống buồng, chúngsinh sản hữu tính Không giống nào trong chi này có quả ăn tươi được vì quả củachúng chỉ có một lớp vỏ mỏng bên trong chứa đầy hạt có đường kính từ 1 – 1,2

cm Chi này có giống Ensete Vetricosum thường trồng ở Đông Phi Bẹ của chúng

dùng làm rau ăn hoặc lấy chất bột trong bẹ ủ lên men làm bánh ăn

Chi Musa có 4 phân chi là Austrilimusa, Callimusa, Eumusa và

Rohdochilamy Trong các phân chi, Australimusa là phân chi cổ nhất, các cây M testilis và M abaca chỉ sử dụng làm dây buộc, chúng chỉ có ý nghĩa về khía cạnh

nguồn gốc của chuối, không có ý nghĩa về kinh tế Calimusa chỉ có một loài dùng làm cảnh do lá bắc màu đỏ tươi Musa coccinea Rhodochlamys tuy có NST cơ

sở là 11 nhưng có đặc điểm là bông đứng và rất ít hoa trong mỗi lá bắc (từ 1 – 5

hoa) Cây chuối cảnh đỏ Musa ornata có lá bắc màu hồng tím nhạt, hoa màu vàng tươi, loại này giống Calirmusa chỉ trồng để làm cảnh (Rowee and Rsales, 1993).

Ngoài ra Simonds and Shepherd (1955), còn tìm thấy ở New Guinea có 2

loại mới không xếp được vào chi nào vì NST cơ sở x = 7 Musa Ingcussimn và x

= 9 Musa baccariin simn.

Trong các phân chi trên, Eumusa là phân chi đáng chú ý nhất không chỉ vì

nó lớn nhất, phong phú về giống nhất mà còn về giá trị kinh tế của nó đặc biệt

trong lĩnh vực ăn tươi và làm lương thực Buồng quả của Eumusa ít nhiều cụp

xuống có thể ngang hoặc hơi ngang hay buông thõng xuống Mỗi nải số quả

nhiều và được xếp thành hai hàng Trong Eumusa các giống chuối dại không

hoặc ít khi có ích nhưng lại có giá trị trong lĩnh vực nghiên cứu về phân loại Cácgiống chuối ăn được, theo Cheesman and Larter (1935); Simmonds and Shepherd

(1955), thì chúng có nguồn gốc từ 2 loài quan trọng là M acuminata colla (ký hiệu A) và M balbisiana colla (ký hiệu B), trải qua nhiều quá trình biến đổi

chúng đã trở thành loại không hạt và ăn được

Việc tăng nhanh các tên khoa học do số lượng giống ngày càng nhiều đãgây nhiều lẫn lộn trong phân loại Trong khi chờ đợi có thêm những hiểu biếtmới nhất là quan hệ gần gũi của các dòng họ chuối, Cheesman and Larter (1935)cho rằng tốt nhất là dùng các tên thông thường của địa phương cùng với sự mô tả

tỉ mỉ các giống loài chuối

Năm 1955, Simmonds và Shepherd dựa vào nghiên cứu tiêu bản sống trongtập đoàn chuối lớn ở Trường đại học tổng hợp miền Đông Ấn Độ đã thấy được

những tồn tại của hệ thống phân loại cổ điển Bằng các nghiên cứu tế bào học haiông đã lý giải được nguồn gốc của chuối trồng và đề xuất một hệ thống phân loại

mới Các loài chuối ăn được đều xuất phát từ hai loài chuối dại có hạt M.

acuminata colla (ký hiệu là A) và M balbisiana colla (ký hiệu là B) Hai loài M acuminata colla và M balbisiana colla là hai loài quan trọng nhất trong chi Musa Hai loài này có xuất xứ từ Đông Nam châu Á Trải qua nhiều quá trình di

truyền chúng đã tạo ra loài chuối không hạt, ăn được Hiện nay lý thuyết nàyđược hầu hết các tác giả công nhận

Để xác định mức độ pha trộn, Simmonds and Shepherd (1955) đã đưa ra 15

chỉ tiêu cơ bản có sự khác biệt rõ ràng giữa M acuminata colla và M balbisiana.

Bảng 2.1 Chỉ tiêu xác định sự khác biệt giữa

Musa acuminata colla và Musa balbisiana

TT Đặc điểm Musa acuminata Musa balbisiana

1 Màu sắc thân giả Nhiều vệt nâu đen Ít hoặc không có

2 Cuống lá Mép thẳng, trải rộng có

cánh, không ôm thân giả

Mép tròn kín, không có cánh, phía dưới ôm thân giả

3 Cuống buồng Nhiều lông Không có lông (nhẵn)

4 Cuống quả Ngắn Dài

5 Noãn 2 hàng thẳng 4 hàng lộn xộn

6 Vai lá bắc Cao (X/Y < 0,28) Thấp (X/Y > 0,3)

7 Tập tính lá bắc Cuộn ngược Không cuộn ngược

8 Hình thái lá bắc Bóp nhọn từ vai Bình thường đều

9 Đỉnh lá bắc Nhọn Tù

10 Màu sắc lá bắc Ngoài đỏ, đỏ tối

Trong đỏ thẫm

Ngoài đỏ đặc biệt Trong đỏ sáng

11 Sự chuyển màu của

lá bắc

Nhạt đều đến gốc Không thay đổi

12 Sẹo lá bắc Lồi Phẳng, ít lồi

13 Cánh hoa đực tự do Gấp nhiều nếp Ít hoặc không gấp nếp

14 Màu hoa đực Trắng mượt Ánh đỏ khác nhau

15 Màu đầu nhụy Da cam, vàng đậm Màu kem, đỏ nhạt

Nguồn: Simmonds and Shepherd (1955)

Thang điểm cho mỗi chỉ tiêu biến động trong khoảng 1 – 5 trong đó điểm 1

dành cho chỉ tiêu nào nghiêng nhiều nhất về M acuminata colla và điểm 5 cho chỉ tiêu nghiêng nhiều nhất về M balbisiana colla Những chỉ tiêu thể hiện trung

gian thì tùy theo mức độ tham gia của (A) hoặc (B) mà cho 2, 3 hoặc 4 điểm vànhư vậy các loài chuối trồng sẽ có tổng số điểm dao động từ 15 đến 75 điểm.Trên cơ sở tổng số điểm của mỗi dòng, giống có được Simmonds và Shepherd đãchia toàn bộ chuối trồng ra 6 nhóm: AA, AAA, AAB, AB, ABB, ABBB

Nhóm AA/AAA tổng số điểm 15 – 23 điểm, nhóm AAB tổng số điểm 25 –

45 điểm, nhóm AB: 46 – 54 điểm, nhóm ABB: 55 – 64 điểm, nhóm ABBB: 67điểm Hệ thống phân loại này mang tính thuyết phục mạnh mẽ và dần dần thaythế hoàn toàn cho hệ thống phân loại trước đó Cho đến nay mặc dù nhiềuphương pháp phân loại bổ sung khác song phương pháp này vẫn là phương pháp

có vai trò quan trọng không thể thiếu được Hiện nay ở hầu hết các ngân hànggen chuối lớn nhất thế giới phương pháp phân loại này được sử dụng rộng rãi đểđánh giá nguồn tài nguyên di truyền cây chuối

Silayoi và Chomchalow (1987), khi phân loại nguồn gốc cây chuối của TháiLan đã thấy được sự chưa hoàn thiện của hệ thống phân loại theo phương phápcho điểm của Simmonds và Shepherd Mặc dù thừa nhận tính ưu việt của phươngpháp này nhưng hai ông cũng đã sửa đổi lại và xếp nhóm các loại chuối thànhcác nhóm sau: AA/AAA, AAB, ABB, ABBB, BB/BBB Nhóm AA/AAA tổng sốđiểm 15 – 25 điểm, nhóm AAB tổng số điểm 26 – 46 điểm, nhóm ABB: 59 – 63điểm, nhóm ABBB: 67 – 69 điểm, nhóm BB/BBB: 70 – 75 điểm Silayoi vàChomchalow (1987) đã sử dụng hệ thống phân loại theo thang điểm có sửa đổinày để phân loại chuối và cho thấy nó là công cụ hữu hiệu hơn

2.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối

2.1.2.1 Sản xuất và tiêu thụ chuối trên thế

giới

Theo Tổ chức Nông lương thế giới (FAO), sản lượng chuối trên thế giớinăm 2013 khoảng 105,3 triệu tấn (bảng 2.2) Trong đó dẫn đầu là Ấn Độ 27,5triệu tấn, tiếp đến là Trung Quốc 12,3 triệu tấn, Philippin 8,6 triệu tấn, Brazil 6,8triệu tấn, Ecuador 5,9 triệu tấn, Việt Nam xếp thứ 15 về sản lượng với trên 1,9triệu tấn

Bảng 2.2 Sản lượng một số nước chuối thế giới năm 2013

Bảng 2.3 Tình hình xuất khẩu chuối trên thế giới năm 2013

2.1.2.2 Sản xuất chuối ở Việt Nam

Các loại cây ăn quả có diện tích và sản lượng lớn của Việt Nam bao gồmchuối, dứa, cam, xoài, bưởi, nhãn và vải Trong đó, chuối là cây ăn quả có quy

mô sản xuất lớn nhất Năm 2013, sản xuất chuối đạt tổng diện tích 112.433 ha vàtạo ra sản lượng 1.982.523 tấn, cao hơn so với các loại cây ăn quả khác (bảng 2.4,hình 2.1)

Bảng 2.4 Diện tích và sản lượng các loại cây ăn quả năm 2013

Tình hình sản xuất chuối giai đoạn 2000-2013

Hình 2.1 cho thấy: Từ năm 2000 – 2003 chưa có sự tương đồng về diện tíchtrồng chuối và sản lượng Tuy nhiên từ năm 2004 đến nay diễn biến sản lượngchuối tương tự như diễn biến diện tích, diện tích trồng ngày càng được mở rộng

và sản lượng cũng ngày càng tăng Tính đến năm 2013 sản lượng cao nhất đạt1.982.532 tấn và diện tích được mở rộng là 1.124.335ha

Diện tch (ha) Sản lượng (tấn)

Hình 2.1 Tình hình sản xuất chuối giai đoạn 2000-2013

Nguồn: FAOSTAT3, Số liệu thống kê (2013)

Theo Hoàng Bằng An và cs (2010), phần lớn diện tích chuối ở nước tatrồng phân tán, không thành vùng tập trung Với đặc điểm là cây ăn quả ngắnngày, nhiều công dụng và ít tốn diện tích nên chuối được trồng như một cây tậndụng đất trong các vườn cây ăn quả của các hộ gia đình Hiện tại, một số tỉnh ởmiền Trung như Thanh Hoá, Nghệ An, Khánh Hoà và ở miền Nam như ĐồngNai, Sóc Trăng và Cà Mau có diện tích chuối từ 3.000 - 8.000 ha Trong khi đócác tỉnh trồng nhiều chuối ở miền Bắc như Hải Phòng, Nam Định và Phú Thọ códiện tích chuối chưa đạt 3.000 ha

2.1.2.3 Sản xuất chuối ở Hà Nội

Theo kết quả điều tra diện tích, sản lượng, năng suất cây lâu năm trên địabàn Hà Nội năm 2010 – 1013 của Tổng cục thống kê trong đó có cây chuối chothấy có sự gia tăng sản lượng tuy nhiên sự gia tăng này chưa tương xứng với diệntích được mở rộng do đó năng suất qua các năm thống kê giảm (bảng 2.5)

Bảng 2.5 Diện tích, sản lượng và năng suất chuối ở Hà Nội C

N ă

2

2.2 TỔNG QUAN VỀ BỆNH HÉO VÀNG FUSARIUM CHUỐI

2.2.1 Bệnh nấm Fusarium oxysporum trên các cây trồng nói chung

Trong các loài nấm gây hại thì nấm Fusarium oxysporum là một trong những nhóm nấm nguy hiểm nhất (Smith et al., 1988) Đây là nhóm nấm có thể

tồn tại lâu dài trong đất cũng như trong tàn dư cây trồng từ vụ này sang vụ khác.Chúng có thể tồn tại dưới dạng sợi nấm, các dạng bào tử lớn, bào tử nhỏ và bào

tử hậu (Agrios, 1997)

Nấm F oxysporum có phạm vi ký chủ rất rộng lớn và tồn tại nhiều dạng khác nhau trong đất Mặt khác, thành phần và sự phân bố của nấm F oxysporum

trong đất có liên quan chặt chẽ với sự xuất hiện và mức độ gây hại trên cây ởmỗi vùng sinh thái khác nhau

Các bệnh héo Fusarium do các dạng loài của F oxysporum gây ra Mỗi dạng loài thường chỉ có thể gây hại trên một loài ký chủ Ví dụ: F oxysporum f.

sp lycopersici héo trên cây cà chua, F oxysporum f sp dianthi héo trên cây cẩm chướng, héo Fusarium trên chuối do F oxysporum f.sp cubense, F oxysporum f.sp zingiberi trên gừng F.oxyporum f.sp pisi trên đậu Hà Lan, F.oxyporum f.sp niveum trên dưa hấu (Stover, 1962; Waite, 1963).

2.2.2 Lịch sử nghiên cứu bệnh héo vàng Fusarium trên cây chuối

* Lịch sử nghiên cứu trên thế giới

Theo Bancroft (1876), lần đầu tiên trên thế giới bệnh héo vàng Fusarium ở chuối được mô tả trên giống chuối Sugar tại nông trường Eagle, Brisbane,

Autralia vào năm 1874 Tiếp đó vào những năm đầu của thế kỷ 20 bệnh được mô

tả gây hại ở các giống Gross Michel tại các vùng trồng chuối xuất khẩu tại Nam

Mỹ và Trung Mỹ Năm 1910, lần đầu tiên tiến sỹ Erwin Smith đã phân lập được

tác nhân gây bệnh từ mô cây bị bệnh tại CuBa và đặt tên là Fusarium cubense E.F Smith (Smith, 1910) Tuy nhiên đến năm 1913 các đặc điểm chi tiết về bệnh

và tác nhân gây bệnh mới được mô tả trong một cuốn sách của Ashby (1913).Năm 1919, Brandes đã có những nghiên cứu đầu tiên để xác định quần thể nấm

và nhận biết một số đặc điểm hình thái trên một số môi trường nuôi cấy Ông đãphân chia nấm từ các mẫu thu thập ở Panama, Costa Rica, Jamaica và CuBathành 2 nhóm: tạo chất thơm và không tạo chất thơm Năm 1932, Canizo và

Sardina đã thông báo bệnh Panama trên các giống chuối nhóm Cavendish tại

Canary Islands Sau đó năm 1940 Snyder và Hansen đã đề nghị đổi tên tác nhân

gây bệnh thành Fusarium oxysporum Schlecht f.sp cubense (E.F Smith)

Snyd.& Hans Tên tác nhân nấm này được sử dụng rộng rãi đến ngày nay

Năm 1947, Mayee đã mô tả về độ nhậy cảm của các giống chuối với bệnh ở

Australia Theo tác giả, giống Lady Finger kém nhậy cảm với bệnh hơn so với giống Sugar và Gross Michel Năm 1953 cũng tại Australia, Purss đã cho thấy bệnh héo vàng Fusarium làm héo các cây chuối William thuộc nhóm Cavendish Tác giả tách tác nhân gây bệnh từ giống William để lây nhiễm thì thấy tác nhân này có khả năng gây bệnh cả ở trên William và Lady Finger Tuy nhiên, mẫu

nấm tách ra từ Lady Finger không có khả năng gây bệnh trên William Năm 1967

ở Đài Loan các giống chuối Cavendish cũng được phát hiện thấy nhiễm bệnh héo

vàng, bệnh đã hủy khoảng 23.000ha chuối ở nước này vào những năm sau đó

(Su et al., 1977) Mayer (1983) đã tiến hành phân lập quần thể nấm gây bệnh và

đã chỉ ra một chủng mới (chủng 4) gây hại trên nhóm Cavendish.

Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả thì chủng 1 và chủng 2xuất hiện trước tiên Người ta đã tiến hành phân lập và phân tích các mẫu nẫmgây bệnh héo vàng chuối từ nhiều nước trên thế giới bằng nhiều phương phápkhác nhau kết quả cho thấy quần thể nấm gây bệnh được chia thành 4 chủng

(Bentley et al., 1998):

- Chủng 1 và 2 gây bệnh ở các giống Gross Michel (AAA), Silk (AAB),

Lady Finger(AAB), Pisang awak (ABB), Bluggoe (ABB) và các nhóm có quan hệ

gần gũi khác

- Chủng 3 gây bệnh ở các loài thuộc chi Helicolia.

- Chủng 4 xuất hiện muộn hơn chủng 1 và chủng 2, chủng này có khả

năng gây bệnh rất lớn ở mọi nhóm giống chuối (trên các giống chuối thuộc nhóm

Cavendish và các giống chuối mẫn cảm với chủng 1 và chủng 2).

Người ta giả thuyết rằng chủng 4 là kết quả đột biến của chủng 1 và chủng

2 trong các điều kiện nóng, lạnh thay đổi đột ngột (Buddenhagen, 1990)

* Lịch sử nghiên cứu ở Việt Nam

Những nghiên cứu về bệnh héo vàng Fusarium trên chuối ở Việt Nam được

tiến hành bởi các tác giả trong và ngoài nước Vakili đã tiến hành khảo sát bệnh

này lần đầu ở miền Nam Việt Nam vào những năm 1967 – 1968 (Vakili et al.,

1968) và lần thứ hai ở cả miền Bắc và miền Trung vào năm 1995 Kết quả điềutra cho thấy bệnh này có mặt trên phạm vi cả nước, tính riêng miền Nam có tới70% diện tích bị nhiễm trong đó nhiều vùng thiệt hại tới hơn 85% năng suất

Năm 1995, Pegg et al thông báo giống chuối Tây và Tây tía (ABB) là những giống mẫn cảm với nấm Foc chủng 1 Năm 1998, Bentley et al công bố kết quả

thu thập 21 mẫu bệnh ở cả miền Bắc, miền Trung và miền Nam bằng phân tíchADN trên chuối Tây và chuối Ngốp cũng bị bệnh, các mẫu nấm này cũng đượcnhận định thuộc chủng 1

Các nghiên cứu về bệnh héo vàng Fusarium của các tác giả trong nước

cũng đã được công bố như: Năm 1967 – 1968, các đợt khảo sát được tiến hành

bởi Viện Bảo vệ thực vật, các tác giả cho thấy bệnh héo vàng gây hại chuối tây ởcác tỉnh như Long An, Bến Tre, Cần Thơ Trong tài liệu “Căn bản cải thiện trồngchuối ở Việt Nam”, Tôn Thất Trình cũng thông báo bệnh xuất hiện lẻ tẻ, gây hại

ở chuối Tây, Già Hương, Sứ và Gross Michel tại một số vùng trồng chuối miền

Nam Việt Nam (Tôn Thất Trình, 1973) Bên cạnh đó qua nghiên cứu tình hìnhbệnh hại chuối trên các giống thuộc tập đoàn quỹ gen tại Trung tâm nghiên cứu

cây ăn quả Phú Hộ cũng cho thấy bệnh héo vàng Fusarium trên các giống chuối

Mật bồ kết, chuối Ngự, chuối Hột, Mật miền Nam, Bom… với tỉ lệ bệnh phổbiến là 25% Cũng năm 1997, Chu Bá Phúc và CS sử dụng phương pháp phântích tương hợp sinh dưỡng trên 12 mẫu bệnh thu thập được ở miền Bắc cho thấynấm gây bệnh thuộc chủng 1 Mai Văn Trị (1997), cũng đã phân tích 08 mẫubệnh thu thập từ chuối Xiêm (chuối tây) ở miền Nam bằng phương pháp tương tựcũng chỉ ra nấm gây bệnh thuộc chủng 1 Nguyễn Văn Khiêm (2000) đã phântích 42 mẫu thu thập từ 13 huyện ở 7 tỉnh khác nhau bằng phương pháp tươnghợp sinh dưỡng cũng kết luận nấm gây bệnh héo vàng nước ta thuộc chủng 1,

chưa phát hiện thấy giống Cavendish bị nhiễm bệnh Như vậy các kết quả nghiên cứu trước về bệnh héo vàng Fusarium ở Việt Nam cho rằng chủng 1 hại nhóm

giống chuối tây trên khắp cả nước, chưa xuất hiện chủng 4

2.2.3 Thiệt hại do nấm bệnh héo vàng Fusarium trên cây chuối

* Thiệt hại trên thế giới

Bệnh héo vàng Fusarium trên cây chuối lây lan rất rộng ở khắp các vùng

trồng chuối như châu Á, châu Phi, Úc, Nam Mỹ và Trung Mỹ Bệnh gây ranhững thiệt hại nặng nề cho ngành công nghiệp xuất khẩu chuối ở Nam Mỹ vàTrung Mỹ, phá hủy khoảng 40.000ha chuối trong những năm đầu nửa thế kỷ 20

(Stover, 1962) Chủng 4 đã từng phá hủy 23.000ha chuối Cavendish ở Đài Loan những năm 70 của thế kỷ hai mươi (Su et al., 1977) và các đồn điền trồng chuối

khác ở các nước như Philippine, Indonesia, Malaysia, Australia, Nam Phi,

Canary Islands (Bentley et al., 1998) Ở Kiepersol và Nam KwaZulu-Natal

(KZN) - Nam Phi, thiệt hại 30% diện tích trong những năm 1991 – 2000(Viljoen, 2002)

Những năm đầu của thế kỷ 20, chủng 1 và chủng 2 gây ra những thiệt hạinặng nề cho sản xuất chuối đặc biệt là ngành công nghiệp xuất khẩu chuối ở Nam

Mỹ và Trung Mỹ Để khắc phục thiệt hại trên, trong những năm 60 ngành côngnghiệp của những nước này được phục hồi bằng cách sử dụng các giống chuối

tiêu thuộc nhóm Cavendish có khả năng kháng với chủng 1 và 2 Như vậy chuối xuất khẩu trên thế giới chủ yếu thuộc nhóm Cavendish Tuy vậy ngành công

nghiệp này hiện nay đang bị đe dọa bởi chủng 4 nghiêm trọng vì chủng này gây

hại trên các giống chuối tiêu thuộc nhóm Cavendish và những nhóm chuối mẫn cảm với cả chủng 1 và chủng 2 (Plucknette et al., 1987) Vì vậy, các nghiên cứu

về bệnh héo vàng Fusarium được sự quan tâm của nhiều quốc gia và các tổ chức

quốc tế Trên cơ sở kiến thức thu được về bệnh các nhà nghiên cứu hy vọng tìm

ra biện pháp hiệu quả nhằm hạn chế sự lan rộng của bệnh trên phạm vi thế giới

* Thiệt hại ở Việt Nam

Mặc dù chưa gây thành dịch lớn song bệnh héo vàng Fusarium vẫn được

coi là một trong số bệnh đáng chú ý nhất gây hại chuối ở Việt Nam do bệnh cóphạm vi phân bố rộng và khả năng gây hại lớn Năm 1968, Vakili đã nhận xét vềbệnh sau khi điều tra, khảo sát bệnh ở Việt Nam rằng có tới 70 % diện tích trồng

chuối tây ở niềm Nam Việt Nam bị bệnh héo vàng Fusarium, trong đó có nhều

vùng bị mất tới hơn 85% năng suất Cho đến nay chưa có nhiều thống kê về thiệthại do bệnh này trên chuối

2.2.4 Các phương pháp phân loại quần thể nấm

Nấm Foc là tác nhân gây bệnh ở chuối, có độ biến dị rất lớn trong quần thể (Bentley et al., 1995) Cho đến nay đã có một số kỹ thuật sử dụng để xác

định cấu trúc quần thể nấm gây bệnh héo vàng chuối Các kỹ thuật bao gồm:

Kỹ thuật lây bệnh nhân tạo để đánh giá khả năng gây độc của nấm; Xác định sự

có mặt của các chất tạo mùi và màu sắc đặc trưng trên một số môi trường nuôicấy nấm; Tương hợp sinh dưỡng; Phân tích enzym pectin và các phương phápphân tích AND

Phương pháp tạo chất thơm

Phương pháp này được mô tả lần đầu tiên bởi Brandes (1919) Tác giả nuôicấy nấm trong môi trường cơm và các môi trường lỏng khác nhau để phân tíchcác mẫu bệnh thu thập từ Panama, Costarica, Jamaica và Cuba Sau đó vào năm

1962, Stover cũng đã nuôi cấy nấm trong môi trường cơm và môi trường có tinhbột để phân tích các mẫu bệnh (Stover, 1986) Cả hai tác giả này đã phân chia

nấm Foc thành hai nhóm: Tạo chất thơm và không tạo chất thơm Các chất thơm

được tạo ra có mặt ở phía trên bình nuôi cấy nấm, được xác định bằng sắc ký khí

Tiếp đó, Moore et al (1991) và Pegg et al (1995) đã sử dụng kỹ thuật này để

phân loại quần thể nấm ở Australia và một số nước ở châu Á Họ nhận thấy có

mối liên quan chặt giữa các nhóm nấm tạo chất thơm tương hợp sinh dưỡng vàkhả năng gây bệnh trong các mẫu bệnh đã phân tích Chủng 1 và 2 không tạochất thơm, không tạo đỉnh hấp thụ nào khi phân tích bằng sắc ký khí Chủng 4tạo ra các chất thơm khi nuôi cấy nấm trên môi trường cơm và tạo ra một vàiđỉnh hấp thụ khi phân tích bằng máy sắc ký khí.

Kỹ thuật tương hợp sinh dưỡng (VCGs)

Kỹ thuật này dựa trên mối quan hệ di truyền trong quần thể nấm Foc Người ta nhận thấy nấm Foc luôn tồn tại ở giai đoạn vô tính Sự tương hợp sinh

dưỡng được điều khiển bởi các gen tương hợp hay bất tương hợp sinh dưỡng.Các nhóm nấm càng có quan hệ họ hàng gần nhau thì sự tương đồng về các gentương hợp càng lớn do đó khi sợi nấm của mẫu cần xác định tiếp hợp với sợinấm của mẫu thử (tester) đã biết sẽ hình thành nên dị hợp nhân Do có khả năngphục hồi các đột biến của dị hợp nhân mà chúng sau khi được tạo ra có khảnăng sinh trưởng mạnh mẽ trong môi trường tạo thành hệ sợi khí sinh trên bềmặt môi trường Trong khi đó các nhóm nấm có quan hệ họ hàng xa nhau thì sựtương đồng về các gen tương hợp càng ít Bất tương hợp về các gen xảy ra, do

đó khi sợi nấm của mẫu cần xác định tiếp hợp với sợi nấm của mẫu thử (tester)

đã biết sẽ không hình thành nên dị hợp nhân hoặc dị hợp nhân được hình thànhnhưng chúng sẽ bị chết Kết quả, chúng không có khả năng sinh trưởng trong

môi trường tối thiểu vì không có khả năng phục hồi các đột biến (Correnll et

al., 1987).

Kỹ thuật này lần đầu tiên được thông báo bởi Cove (1976) Cho đến nay,các tác giả đã tạo ra được ít nhất 20 mẫu thử chuẩn đại diện cho các mẫu nấm

Foc ở các vùng khác nhau trên thế giới Chúng hiện đang được sử dụng ở nhiều

phòng thí nghiệm nghiên cứu về bệnh héo vàng Fusarium trên chuối ở nhiều

nước Đây là kỹ thuật phân tích đơn giản, dễ sử dụng, có độ chính xác cao tuynhiên nó đòi hỏi nhiều thời gian khi phân tích mẫu Một mẫu phân tích cần thờigian là 5 tuần

Phương pháp phân tích ADN

Có nhiều nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng phương pháp phân tích AND

để giám định nấm Foc và nhiều kỹ thuật khác nhau đã được ứng dụng để phân tích sự đa dạng của nấm Foc Cụ thể: Sorrensen (1993) nghiên cứu ở Australia

đã sử dụng kỹ thuật RAPD - PCR để chỉ ra rằng những nhóm tương hợp sinh

dưỡng cùng một chủng nấm có mối quan hệ gần gũi với nhau; Cũng ở Australia,

năm 2000, Gerlach et al đã sử dụng kỹ thuật DNA fingerprinting để phân tích

mức độ đa dạng của 94 mẫu phân lập bao gồm chủng 1, chủng 2, chủng 3 và

chủng 4 và cũng cho kết quả tương tự; Năm 2011, Li et al đã sử dụng kỹ thuật

phân tích AFLP phân tích 55 mẫu phân lập ở Đài Loan, Hải Nam và Giang Đôngcủa Trung Quốc, kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa chủng 4 ở ĐàiLoan và chủng 4 ở phía Nam Trung Quốc Năm 2012, Thangavelu đã phân tích

quần thể nấm Foc ở Ấn Độ bằng kỹ thuật ISSR và kết luận chủng gây bệnh trên giống Grand Naine (Cavendish-AAA ) khác với chủng nấm gây bệnh trên giống Poovan (Mysore-AAB) Lin et al (2013) đã sử dụng kỹ thuật real-time PCR để

chẩn đoán… Như vậy trên thế giới nhiều kỹ thuật khác nhau đã được sử dụng để

chẩn đoán nấm Foc gây bệnh héo vàng trên chuối tuy nhiên những kỹ thuật này

vẫn còn ít được sử dụng ở Việt Nam

Kỹ thuật lây bệnh nhân tạo

Đây là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để kiểm tra khả năng gây độc củanấm và xác định tính mẫn cảm của giống Cơ sở của phương pháp này là dựa vàokhả năng gây bệnh của các chủng nấm khác nhau đối với các dòng, giống và các

nhóm chuối khác nhau Chủng 1 và 2 gây bệnh ở Gross Michel (AAA), các

giống chuối có hệ gen AAB và các giống chuối có hệ gen ABB Chủng 4 gây

bệnh ở các giống chuối tiêu thuộc nhóm Cavendish (AAA) và các giống mẫn

cảm với chủng 1 và chủng 2 Căn cứ vào khả năng gây bệnh của nấm người ta cóthể phân chia ra các nhóm, chủng gây bệnh Lây bệnh nhân tạo có thể được tiếnhành trong in vitro, trong bầu đất ở nhà kính hoặc trên đồng ruộng (Pegg vàMoore, 1995)

2.2.5 Phân loại nấm Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc)

Nấm Fusarium oxysporum f.sp cubense gây bệnh héo vàng thuộc ngành

Ascomycetes (nấm túi), lớp Deuteromycetes (nấm bất toàn), bộ Moniliales, họ

Tuberculariaceae Booth, (1971) đã chú ý vào bản chất tế bào phân sinh mà từ đósinh ra bào tử nhỏ, là một trong những chỉ tiêu đầu tiên để phân loại nấm Trên

cơ sở đó ông cho rằng nấm F oxysporum có số lượng 90 loài Gần đây Burgess

và Summerell (1993) đã đưa ra cơ sở phân loại nấm F oxysporum gồm 7 chỉ tiêu

như sau:

1) Hình thành bào tử lớn.

2) Hình thành bào tử nhỏ

3) Hình dạng và kiểu bào tử nhỏ

4) Kích thước của bào tử nhỏ

5) Sự có mặt hay không có mặt của bào tử hậu trên môi trường PGA.6) Đường kính tản nấm trên môi trường PGA

7) Hình thái tản nấm

2.2.5.1 Đặc điểm hình thái

nấm

Theo Ashby (1913), đặc điểm hình thái đặc trưng của nấm Foc trên một số

môi trường như sau:

- Trên môi trường thạch chứa asparagine, hệ sợi nấm khí sinh có màu trắngtuyết và phát triển dạng hình sao

- Trên môi trường chuối sợi nấm khí sinh dầy đặc có màu trắng sau đó cónhiều hạch màu xanh tối

- Trên môi trường cơm hệ sợi nấm khí sinh tạo ra màu đỏ hoặc tím hoa cà

- Trên môi trường chứa khoai tây lưu giữ lâu ngày gốc cuống bào tử sinh ra

có màu vàng sau đó là màu xanh tối

2.2.5.2 Đặc điểm phân

loại

Hệ sợi nấm mang các bào tử đính phân nhánh hoặc tạo thành cụm bào tửđính Các bào từ đính được xuất hiện vào giai đoạn muộn trên bề mặt lá, cuống lácủa cây nhiễm bệnh Gốc cụm cuống bào tử đính xuất hiện qua sự mở của lỗ khíkhổng lá hoặc mặt trên của cuống lá hay các điểm phân tách từ mô mềm trênthân giả Các cụm bào tử này có đường kính 26 – 30 µm, xuất hiện đơn lẻ vàthành từng đám chứ không liên kết với nhau nhờ một loại cơ chất nào Các bào tửđính thường phân thành 2 – 3 nhánh từ tế bào gốc Đường kính tế bào gốckhoảng 70 µm Đường kính lớn nhất của cuống bào tử khoảng 4µm Các bào tửnhỏ sinh ra trong hệ sợi có hình ovan, một số kéo dài có kích thước 5-7 x 2,5-3µm Các bào tử hình liềm có từ 2 - 6 vách ngăn và có kích thước 22-36 x 4-5µm Các bào tử có vách dày được tạo ra ở giai đoạn muộn của chu kỳ bệnh ởtrong cây Các bào tử vách dày hình ovan có kích thước khoảng 9 x7µm, hoặchình cầu có đường kính khoảng 7-7,5µm (George, 1989)

Nấm Fusarium oxyporum có 3 kiểu bào tử vô tính bao gồm: Bào tử lớn

(Macroconidia), bào tử nhỏ (Microconidia), bào tử hậu (Chlamydospores)

a) b) c)

Nguồn: h tt p : // w ww p r o m u s a o r g / F u s a r i u m + o x y s po r u m + f + s p + c u b e n s e

Hình 2.2 Các dạng bào tử của nấm Fusarium oxyporum

a) bào tử nhỏ (Microconidia), b) bào tử lớn (Macroconidia) và c) bào tử hậu (Chlamydospores).

- Bào tử nhỏ đơn nhân, đôi khi có 2 vách ngăn, hình oval, một số kéo dài,kích thước 5 - 7 x 2.5 - 3µm

- Bào tử lớn nhiều nhân, có dạng hình liềm, có 2 – 6 vách ngăn, kích thước

22 – 36 x 4 - 5µm

- Bào tử hậu có vách dày được tạo ra trong cây vào giai đoạn muộn của chu

kỳ bệnh Chúng có thể phát triển đơn hoặc thành chuỗi, các bào tử hậuhình oval có kích thước 7 - 9µm hoặc hình cầu đường kính khoảng 7 –7,5µm

Bào tử hậu rất bền và tồn tại trong thời gian dài, khi gặp các điều kiện thuậnlợi chúng tách ra và mọc các ống mầm

2.2.6 Triệu chứng biệu hiện bệnh

Bệnh héo vàng gây ra bởi nấm Foc có thể xảy ra ở bất cứ giai đoạn sinh

trưởng nào của cây Tùy theo mức độ gây hại mà triệu chứng bệnh biểu hiệnkhác nhau

2.2.6.1 Triệu chứng biểu hiện bên ngoài

Triệu chứng biểu hiện bên ngoài được ghi nhận đầu tiên ở các lá phía dướicủa cây, có màu vàng nhạt ở xung quanh mép lá, sau đó màu vàng lan dần vàophía gân chính của lá Các lá già dần dần bị héo toàn bộ, gẫy gục, rủ xuống xungquanh thân giả Tiếp đó, các lá non có màu vàng nhạt ở xung quanh mép và có xuhướng thẳng đứng rồi có màu vàng úa, kích thước nhỏ lại cả về chiều rộng vàchiều dài Các lá non có thể trổ không thoát Các lá non cũng bị vàng và héovàng xuống thân giả sau một thời gian ngắn Không có quả nếu bệnh xuất hiện

trước khi ra buồng khoảng 2 tháng Nếu bệnh xuất hiện muộn hơn, buồng quả cóthể xuất hiện nhưng số nải và số quả giảm, quả bị chín ép Nứt dọc thân giả cóthể được quan sát thấy ở phần trên mặt đất của thân giả Đặc điểm quan trọng đặctrưng được nhận thấy là xuất hiện mạch màu nâu đỏ ở thân củ, thân giả và ở cả

bẹ lá trong các cây bị bệnh (George, 1989; Moore et al., 1992; Ploetz, 1995 và

Wardlaw, 1961)

2.2.6.2 Triệu chứng biệu hiện bên trong

Ở các cây bình thường, khi cắt thân củ và thân giả có màu trắng trong khi

đó các cây bị bệnh xuất hiện màu đỏ nâu ở hệ mạch dẫn ở thân giả, thân củ và cả

rễ Màu đỏ cũng có thể quan sát thấy ở bẹ lá và cuống buồng của các cây bị bệnhnặng Tuy nhiên không xuất hiện màu nâu đỏ trong quả ở các cây bị bệnh như

bệnh héo vàng gây ra bởi vi khuẩn (George, 1989; Moore et al., 1995; Ploetz,

1995 và Wardlaw, 1961) Một số nguyên nhân gây ra bệnh héo vàng trên cây Ởcác cây bị bệnh, thành tế bào mô mềm của lá và các cơ quan khác mất đi tínhtrương nước Trong các ống mạch xylem của thân giả, thân củ và rễ cây bị bệnh

có mặt của sợi nấm và các loại bào tử Sự có mặt này cùng với các sản phẩm oxyhóa của cây sinh ra bởi nấm như polysacarit, các chất gel và gôm làm cho hệmạch của cây bị tắc nghẽn Mặt khác, sản phẩm của nấm có tác dụng kích thíchphân chia quá mức các tế bào mô mềm quanh bó mạch xylem làm cho thành tếbào mô mềm hơn và yếu đi Đồng thời, các ống mạch xylem được hình thành ít

đi Kết quả là nước không được dẫn lên phía trên cây do mạch bị tắc nghẽn, dovậy lá cây bị héo và gẫy gục Hiện tượng gây vàng lá bởi bệnh có thể do nấmsinh ra các chất độc Các chất này đi vào mạch dẫn và lên phía trên cây theomạch xylem làm giảm tổng hợp chlorophil dọc theo gân lá, làm giảm quang hợp,gây rối loạn khả năng thấm của màng tế bào lá và làm mất khả năng kiểm tra traođổi nước do đó lá bị héo và chết (George, 1989; Wardlaw, 1961)

2.2.7 Tính gây bệnh của nấm Foc

Foc gây bệnh trên các loài chuối và chi Helicolia Nấm Foc được chia

thành 4 chủng dựa trên cơ sở gây nhiễm với các giống cây chủ trên đồng ruộng:

- Chủng 1: Gây bệnh ở giống Gross Michel (AAA) và nhóm giống chuối tây: silk (AAB), Pome (AAB), Lady Finger (AAB).

- Chủng 2: Gây bệnh ở Bluggoe (ABB) và các giống chuối có quan hệ họ

hàng gần gũi với chúng

- Chủng 3: Gây bệnh ở các loài trong chi Helicolia (có quan hệ gần gũi với

chi Musa) và chỉ gây nhiễm nhẹ ở chuối

- Chủng 4: Gây bệnh hại các giống chuối tiêu thuộc nhóm Cavendish

(AAA) và tất cả các giống mẫn cảm với chủng 1 và 2

- Kết quả phân tích AND của các mẫu nấm bệnh thu thập ở nhiều nước trên

thế giới cho thấy chủng 1 và 2 gây bệnh ở các giống Gros Michel (AAA),

silk (AAB), Pome (AAB), Lady Finger (AAB), Bluggoe (ABB), Pisang awak (ABB) và các nhóm chuối khác có quan hệ gần gũi lập thành một

nhánh Chủng 4 gây bệnh trên tất cả các giống mẫn cảm với chủng 1, 2 và

các giống thuộc nhóm Cavendish (AAA) có cấu trúc khác xa với chủng 1

và 2 lập thành một nhánh khác Chủng 3 gây bệnh ở các loài thuộc chi

Helicolia có thành phần AND khác xa hai nhánh trên (Bentley, 1998).

Khả năng gây độc của một chủng nấm trên các giống ở các vùng khác nhau

là khác nhau Chẳng hạn, giống IC2 kháng với chủng 1 ở Trinidad nhưng lại mẫn cảm với chủng 1 ở Honduras hay giống Cavendish 73-53 kháng với chủng 4 ở Đài Loan nhưng lại không kháng ở Australia (Moore et al., 1992).

Người ta cũng nhận thấy khả năng kháng của các giống chuối có hệ genkhác nhau là khác nhau trong một môi trường sinh thái Thậm chí có cùng hệ gen

nhưng khả năng kháng cũng khác nhau (Smith et al., 1992).

2.2.8 Chu kỳ bệnh

Chu kỳ bệnh được bắt đầu bằng bào tử có vách dày ở trong đất gặp các điềukiện thuận lợi nảy mầm và đâm xuyên vào rễ cây chủ qua các chỗ tổn thương Sau

đó sợi nấm sinh trưởng, lan tới hệ xylem và tiến dần lên phía thân củ rồi thân giả

Có 3 loại bào tử được hình thành trong cây Các bào tử nhỏ được hình thànhtrong xylem và tiếp tục lan rộng trong hệ thống mạch cây chủ Ở giai đoạn tiếptheo, các bào tử nhỏ tiếp tục được hình thành trong mô mềm bao bó mạch vànhững mô khác của cây chủ Các bào tử lớn cũng có thể được hình thành trên lá

và bẹ lá

Cả hai loại bào tử này theo dòng nước trong hệ xylem đi lên phía trên cây

và sinh trưởng ở đó Các loại bào tử này có thể lan xa hơn nhờ gió và nước Tuynhiên, chúng có thời gian sống ngắn ngoài tế bào cây chủ Bào tử có vách dàyđược tạo ra ngay trên hệ sợi hoặc bào tử đính ở trong mô cây chủ vào giai đoạncuối của chu kỳ bệnh Sau khi cây chết, bào tử có vách dày tồn tại nhiều năm

trong đất hoặc trong các cây trung gian khác Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúnglại nảy mầm xâm nhập vào rễ cây chủ qua các chỗ tổn thương để bắt đầu một chu

kỳ mới (George, 1989)

2.2.9 Các con đường lan truyền bệnh

Nấm Foc là loại nấm cư trú trong đất Các bào tử có vách dày có thể sống ở

trong đất, trong xác cây bị bệnh, trong rễ cây chủ trung gian tới 30 năm Chúng

có thể lan truyền từ vùng này sang vùng khác theo các cách sau:

- Lan truyền bằng sự di chuyển của thân củ, cây con giống, đất bị nhiễmbệnh và các phương tiện vận chuyển như xe tải, xẻng, cuốc… Đây là conđường lan truyền chủ yếu

- Gió và nước cũng là tác nhân lan truyền bệnh phát tán các loại bào tử đi

xa tới nơi chưa có mầm bệnh Tuy nhiên do thời gian tồn tại của các bào

tử này ở ngoài không khí ngắn cho nên lan truyền bằng con đường nàykhông đóng vai trò quan trọng (Wardlaw, 1961)

2.2.10 Các yếu tố bên ngoài ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh

2.2.10.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Đây là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh Người

ta nhận thấy rằng sự phát triển của bệnh đạt tối ưu khi nhiệt độ đạt tối ưu cho sựsinh trưởng của cây Thông thường nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của bệnh

là 25 - 35oC Khi nhiệt độ trên hoặc dưới ngưỡng này, sự phát triển của bệnhchậm lại Trong thời gian mùa đông và ở những vùng có độ cao trên 700m nhưJamaica người ta nhận thấy bệnh phát triển rất chậm Ngược lại ở những vùngnhiệt đới sức tấn công của bệnh cao hơn các vùng khác (Wardlaw, 1961)

2.2.10.2 Ảnh hưởng của các nguyên tố dinh dưỡng

Ở Canary Islands người ta nhận thấy hàm lượng Zn thấp, tỉ lệ Ca: Mg và K:

Mg cao thì khả năng tấn công của bệnh cao hơn Điều đó được giải thích rằnghàm lượng Zn thấp có liên quan đến giảm hình thành tyloza, trong khi tỉ lệ Ca:

Mg và K: Mg có liên quan đến hình thành pectin của thành tế bào cây chủ Nhưvậy, các yếu tố dinh dưỡng cũng có ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh(Wardlaw, 1961)

2.2.10.3 Ảnh hưởng của đất

Khả năng sinh trưởng và sống sót của nấm Foc ở đất cát nhẹ, axit cao hơn

so với vùng đất sét hoặc đất kiềm có hàm lượng Ca cao (Wardlaw, 1961)

Các điều kiện như độ ẩm đất cao, đất kém thoát nước, đất nghèo dinhdưỡng tạo điều kiện cho bệnh phát triển mạnh (Tôn Thất Trình, 1973)

2.2.10.4 Ảnh hưởng của auxin

Theo Wardlaw (1961), axit idol-axetic và indolcacetonitril có tác dụng kìm

hãm sự phát triển của nấm Foc.

2.2.11 Phòng trừ nấm Fusarium gây bệnh héo trên chuối

Hiện nay chưa có phương pháp phòng trừ nào thực sự hiệu quả với bệnh

héo vàng chuối do nấm Fusarium gây ra trên chuối Các biện pháp như hóa học,

luân canh cây trồng, bổ sung các chất hữu cơ hay để cho đất nghỉ đều không cóhiệu quả (Ploetz và Pegg, 1997) Nấm, bào tử hậu sinh ra có thể tồn tại trong đấtnhiều năm mà không cần sự có mặt của cây ký chủ (Stover, 1962) Trong nửađầu thế kỷ 20, ngành công nghiệp chuối ở Nam Mỹ và Trung Mỹ bị phá hoạinặng nề bởi nấm gây bệnh chủng 1 và chủng 2 trên các giống chuối thuộc nhóm

Gross Michel sau đó tình hình được khắc phục bằng cách thay thế các giống

chuối mẫn cảm này bằng các giống chuối thuộc nhóm Cavendish Tuy nhiên hiện

nay các giống chuối thuộc nhóm này cũng đang bị tấn công bởi nấm gây bệnhhéo vàng chủng 4 (Plucknette, 1987) Chủng 4 hiện là mối đe dọa lớn mới nhấtcho nền sản xuất và thương mại chuối Sự xuất hiện hoặc lây lan đến các khu vựcsản xuất chuối lớn của châu Mỹ Latin, vùng Caribe hoặc Tây Phi gây ra thiệt hạilớn về năng suất là có thể Người ta ước tính rằng khoảng 80% sản lượng toàncầu đang bị đe dọa bởi chủng 4 (Ploetz, 2005) Nếu không kiểm soát nó khôngnhững chỉ tác động tới ngành xuất khẩu mà còn ảnh hưởng đến sinh kế và anninh lương thực của hàng triệu người trên thế giới Như vậy việc tìm ra giốngkháng, xác định và giám sát tác nhân gây bệnh là rất quan trọng

Hiện nay phương án sử dụng giống kháng được cho là có hiệu quả và đangđược tiếp tục tìm kiếm Các phương pháp chọn lọc thông qua biến dị Soma haytạo giống đột biến cũng đang sử dụng để tạo ra kiểu gen kháng(h

tt p : / / www ca b i o rg /i s c/ d ata s h e et/ 24 6 21 , 2016)

Việc sử dụng nấm có ích để phòng trừ bệnh hại đã được nghiên cứu và ápdụng nhiều trên thế giới Kết quả nghiên cứu cho thấy các enzyme thủy phânđóng vai trò trong ức chế sự phát triển của nấm bệnh Những enyme thủy phân

của nấm Trichoderma spp như endo-chitinase, N-acetylhexosaminidae và 1,3-glucanase có độc tính mạnh với nấm bệnh Nấm đối kháng Trichoderma spp.

là một trong những biện pháp sinh học quan trọng trong phòng trừ bệnh nấm đất

(Harman et al., 2004) Như vậy cùng với việc nghiên cứu ra giống kháng bệnh,

việc sử dụng các dòng nấm đối kháng cũng mở ra một hướng phòng trừ mới đốivới bệnh héo vàng trên chuối

Song song với các biện pháp phòng trừ một số yếu tố liên quan đến sinhtrưởng của cây và tác nhân gây bệnh cũng cần được lưu ý như: điều kiện thoátnước, môi trường đất (pH, các nguyên tố vi lượng …), loại đất Tăng cường kiểmdịch, hạn chế sự lây lan của bệnh sang những khu vực chưa bị nấm bệnh ảnhhưởng; sử dụng cây giống bằng nuôi cấy mô tế bào, trồng chuối trên đất trước đóchưa trồng chuối cũng có thể hạn chế được bệnh trong một thời gian đáng kể(h

tt p : / / www ca b i org /i s c/ d ata s h e et/ 24 6 21 ,2016)

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG

- Bệnh héo vàng chuối tại khu vực Hà Nội;

- Nấm Fusarium oxysporum f.sp cubense.

3.2 VẬT LIỆU

3.2.1 Các mẫu bệnh

Các mẫu bệnh điển hình được thu thập từ thân giả, củ và cuống lá của cáccây chuối bị nhiễm bệnh héo vàng ở khu vực Hà Nội

3.2.2 Mẫu giống chuối đánh giá tính gây bệnh

- Mẫu 1, 2, 3, 4, 5 được tuyển chọn từ các cây chuối tiêu hồng ưu tú tại XãMinh Châu – Ba vì – Hà Nội;

- Mẫu 6: Chuối tiêu hồng thu thập tại Ba vì – Hà nội (BV);

- Mẫu 7: Giống chuối tiêu William (DL);

- Mẫu 8: Chuối tiêu hồng thu thập tại Nhân hòa -Lý Nhân- Hà nam (LN);

- Mẫu 9: Giống chuối tây

Các cây chuối Tây và chuối Tiêu được nhân giống bằng nuôi cấy mô Saukhi ra vườn ươm 1 tháng đem lây bệnh

3.2.3 Các hóa chất và thiết bị được sử dụng trong các thí nghiệm

Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm Foc: CLA, PDA, SNA, WA, K2 và

môi trường cơm

Môi trường WA (Water agar)

70oC rồi đổ ra các đĩa petri sau đó đặt mẩu lá cẩm chướng lên bề mặt thạch.

Môi trường PGA (Potato Glucose Agar)

để nguội 55 - 60oC trước khi rót vào đĩa petri đã được khử trùng

Môi trường cơm

Cho 30g gạo vào 90ml nước cất, khử trùng trong bình tam giác 250ml ở

121oC trong 30’sau đó bình môi trường được để nguội và khêu nấm cấy

Môi trường K2 modified (Komada modified media)

Thành phần cho 900 mL nước cất bao gồm:

Chuẩn độ pH đến 3.8 với 10% axit phosphoric

Ở nhiệt độ 50C, bổ sung 100 mL dịch lọc bao gồm:

3.3 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

- Học viện Nông Nghiệp Việt Nam

- Viện Nghiên cứu rau quả - Gia Lâm, Hà Nội

Thời gian nghiên cứu từ 25/06/2015 đến 09/09/2016

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Đánh giá bệnh héo vàng Fusarium hại chuối tại một số vùng trồng chuối

của Hà Nội;

- Thu thập quần thể nấm Foc gây bệnh héo vàng trên chuối tại Hà Nội;

- Xác định các đặc điểm hình thái, sinh học và phân loại các mẫu nấm Foc

thu thập được;

- Đánh giá tính gây độc của nấm Foc trên các giống chuối khác nhau bằng

lây bệnh nhân tạo trong nhà lưới;

- Thử nghiệm biện pháp phòng trừ bằng nấm đối kháng Trichoderma sp.

trong phòng thí nghiệm và trong nhà lưới

3.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp điều tra bệnh ngoài đồng ruộng

Điều tra, thu thập mẫu bệnh: Điều tra theo phương pháp của Viện BVTV(Quyển số 1)

Đối với ruộng nhỏ (dưới 500m2) thì đếm tất cả số cây biểu hiện bệnhtrong ruộng

Đối với ruộng lớn điều tra theo phương pháp 10 điểm chéo góc, mỗi điểmđiều tra 10 cây

Chỉ tiêu theo dõi:

Số cây bị bệnh

TLB (%) = - - - - - - x 100%

Tổng số cây điều tra

3.5.2 Phương pháp thu mẫu bệnh và phân lập nấm

Mẫu bệnh được thu thập từ thân giả, củ và cuống lá của các cây có biểuhiện triệu chứng bệnh Phân lập các mẫu này được tiến hành theo mô tả của

Moore et al (1995): Dùng dao và panh vô trùng tách các sợi mạch màu nâu đỏ ra

khỏi thân giả Thấm khô chúng bằng giấy vô trùng sau đó dùng dao cắt các sợinày thành các đoạn nhỏ 0,5cm rồi cấy vào đĩa petri chứa môi trường PDA có bổ

sung streptomycin (1ml dung dịch 1% streptomycin bổ sung vào 200ml môitrường) Để tạo các mẫu nuôi cấy đơn bào từ thuần nhất, một miếng thạch nơinấm sinh trưởng (kích thước 0,5cm x 1cm) của mẫu nấm nuôi cấy sau 3 - 4 ngàyđược lắc trong bình thủy tinh nhỏ chứa 10ml nước cất vô trùng trong vài phút.Sau đó các bào tử đơn được cấy chuyển lên môi trường thạch, sau 24 – 30 giờnuôi cấy các đơn bào tử nảy mầm được tách ra dưới kính hiển vi soi nổi và nuôicấy trong các môi trường để nghiên cứu đặc điểm hình thái, các đặc điểm phânloại và phân tích các mẫu nấm thành các nhóm khác nhau

3.5.3 Phương pháp xác định đặc điểm phân loại và hình thái nấm

Các đặc điểm hình thái khuẩn lạc được quan sát bằng mắt trên môi trườngCLA, SNA, PDA, Komada (K2) và môi trường cơm được nuôi cấy ở nhiệt độ

30oC Kích thước của khuẩn lạc nấm được đo bằng thước sau 8 – 10 ngày nuôicấy Các đặc điểm phân loại (bào tử lớn, bào tử nhỏ, sợi nấm ) được quan sátdưới kính hiển vi

3.5.4 Phương pháp phân loại nấm bằng cách xác định sự có mặt của chất thơm khi nuôi cấy nấm trong môi trường cơm

Phương pháp được tiến hành và xác định theo mô tả của Moore et al.

(1995) Các đặc điểm màu sắc của môi trường, sự có mặt của chất thơm được xácđịnh sau 2 tuần nuôi cấy các mẫu nấm trên môi trường cơm Các mẫu nấm tạo ramàu sắc đỏ hoặc tím đậm và không tạo chất thơm trong môi trường nuôi cấy sẽthuộc về chủng 1, 2 Ngược lại, những nhóm nấm ra mầu sắc tím nhạt hoặc đỏnhạt và tạo chất thơm trong môi trường nuôi cấy sẽ thuộc về chủng 4

3.5.5 Xác định chủng nấm Foc bằng chỉ thị phân tử

Đơn bào tử nấm Foc được cấy trên môi trường PGA ở nhiệt độ 25 - 27oCtrong 5 ngày Thu sợi nấm vào ống 2ml sau đó ly trích DNA bằng kit (FungiDNA Isolation Kit, Norgen bioteck corp) và bảo quản ở 20oC

Phản ứng PCR để xác định chủng nấm được sử dụng mồi Foc TR4 F/FocTR4 - R(5’-CAC GTT TAA GGT GCC ATG AGA G-3’; 5’-

-CGC ACG CCA GGA CTG CCT CGT GA-3’), theo chu trình nhiệt sau: