Khả sát sơ bộ thành phần hóa học va đáh gia một sô hoạ tính sinh học trong tơ nấ linh chi đen amauroderma subresinosum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TƠ NẤM LINH CHI ĐEN AMAURODERMA SUBRESINOSUM Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀNG DŨNG Sinh viên thực MSSV: 1151110113 : TRẦN LÊ VIỆT HÀ Lớp: 11DSH04 TP Hồ Chí Minh, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TƠ NẤM LINH CHI ĐEN AMAURODERMA SUBRESINOSUM Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀNG DŨNG Sinh viên thực MSSV: 1151110113 : TRẦN LÊ VIỆT HÀ Lớp: 11DSH04 TP Hồ Chí Minh, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng thực dựa sở thực nghiệm phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh Các số liệu, kết đồ án trung thực chưa công bố công trình khác TP HCM, ngày 20 tháng 8, năm 2015 Trần Lê Việt Hà LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án cách tốt đẹp, em nhận nhiều giúp đỡ từ quý thầy cơ, gia đình bạn bè Em xin gửi lời cảm ơn lời chúc sức khỏe đến ban lãnh đạo trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh thầy khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường truyền đạt cho em kiến thức chuyên ngành suốt trình học tập trường, giúp cho em nắm vững lý thuyết thực hành Em xin chân thành cảm ơn T.S Nguyễn Hồng Dũng tận tình hướng dẫn giúp đỡ em trình thực đồ án lúc viết báo cáo, để hơm em hồn thành báo cáo tốt Và em xin gửi lời cảm ơn đến anh chị bạn làm việc phòng Vi sinh thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành cơng việc cách tốt Con vơ cảm ơn ba mẹ, gia đình bên cạnh ủng hộ, động viên suốt trình học tập Cám ơn bạn bè, tập thể lớp 11DSH04 hỗ trợ, chia sẻ việc học tập thời gian năm Đại học MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MƠ ĐẦU 1 Tính cấp thiết của đề tài Tình hình nghiên cứu Mục đích nghiên cứu Nhiệm vu nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Các kết qua đạt được của đề tài Kết cấu đô án tốt nghiệp Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm linh chi 1.1.1 Khái quát chung 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Điều kiện sống nấm linh chi 1.1.4 Sơ lược hoạt chất sinh học có nấm Linh chi 1.1.5 Tác dụng trị liệu nấm Linh chi 13 1.2 Nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) 16 1.2.1 Vị trí phân loại 16 1.2.2 Đặc điểm hình thái 17 1.2.3 Các nghiên cứu nấm Linh chi đen 19 i Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Thời gian va địa điểm nghiên cứu 20 i 2.2 Đối tượng nghiên cứu 20 2.3 Vật liệu nghiên cứu 20 2.3.1 Thiết bị 20 2.3.2 Hóa chất 20 2.3.3 Môi trường sử dụng 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu 21 2.4.1 Theo dõi tăng sinh khối tơ nấm linh chi môi trường lỏng 21 2.4.2 Phân tích sơ thành phần hóa học nấm Linh chi đen A subresinosum 21 2.4.3 Khảo sát hoạt tính tơ nấm linh chi chiết với phân đoạn dung môi khác 25 2.4.4 Xác định thành phần có phân đoạn dịch chiết thu kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 29 2.5 Phương pháp xử lý sô liệu 30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN 31 3.1 Thu nhận sinh khối của tơ nấm linh chi môi trường lỏng 31 3.2 Phân tích sơ phần hóa học nấm Linh chi A subresinosum 33 3.2.1 Định tính anthraglycosid 33 3.2.2 Định tính flavonoid 33 3.2.3 Định tính acid béo 34 3.2.4 Định tính alkaloid 35 3.2.5 Định tính tinh dầu 36 3.2.6 Định tính carotenoid 36 3.2.7 Định tính phytosterol 36 3.2.8 Định tính steroid 37 3.2.9 Định tính tanin 38 3.2.10 Định tính đường khử 38 ii 3.2.11 Định tính antocyanosid 39 3.2.12 Định tính saponin 40 ii 3.2.13 Định tính acid uronic 41 3.2.14 Định tính acid hữu 41 3.3 Khảo sát hoạt tính cao chiết Methanol tổng của tơ nấm Linh chi đen 44 3.3.1 Khả kháng khuẩn tơ nấm linh chi cao Methanol 44 3.3.2 Khả kháng oxy hóa cao chiết Methanol tổng 45 3.4 Khảo sát hoạt tính các phân đoạn cao của tơ nấm Linh chi A.subresinosum 47 3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết tơ nấm linh chi 47 3.4.2 Khả kháng oxy hóa loại cao chiết 49 3.5 Kết qua phân tích thành phần có cao chiết tơ nấm A subresinosum bằng ky thuật sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 55 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DMSO : Dimethylsunfoxide DPPH hydrazyl : 2,2 diphenyl-1-pycryl- HPLC chromatography IC50 50%) LB : High-performance liquid : The half maximal Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế : Luria Bertani MeOH : Methanol OD : Optical Density PDA : Potato Dextrose Agar PD-broth : Potato Dextrose Broth UV : Ultra Violet Bảng 3.10 Kết khảo sát khả bắt gốc tự cao Nước thu N ô ̀ n 0 O D ,0 ,0 ,0 ,0 0, , O D ,0 ,0 ,0 ,0 0, , O D ,0 ,0 ,0 ,0 0, , T % % r u b sai 0 ,0 ,4 ,0 ,2 ,0 ,1 ,0 1, 0, 0, , , Hình 3.25 Biểu đồ thể khả bắt gốc tự DPPH cao nước thu Kết cho thấy phân đoạn thu có khả bắt gốc tự DPPH theo nồng độ tăng dần Và nồng độ ức chế 50% phân đoạn 1,115; 0,336; 0.521; 1,218 mg/ml cho cao Hexan, Chloroform, Ethyl acetate nước Qua giá trị IC50 phân đoạn IC50 cao tổng MeOH cho thấy phân đoạn chiết với Chloroform, Ethyl acetate có khả bắt gốc tự tốt cao tổng với giá trị IC50 0,336 0,521 mg/ml Phân đoạn Hexane có giá trị tương đương với phân đoạn cao tổng Methanol phân đoạn nước có giá trị IC50 cao 1.4 IC 50 (mg/ml) 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 MeOH Hexan Cloroform Ethyl acetate H2O Các phân đoạn Hình 3.26 Giá trị IC50 phân đoạn cao chiết 3.5 Kết qua phân tích thành phần có cao chiết tơ nấm A subresinosum bằng ky thuật sắc ký lỏng hiêu cao (HPLC) Để xác định thành phần hoạt chất có phân đoạn cao, kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao thực Sắc ký đồ cao Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, nước thề hình 3.27, 3.28, 3.29 3.30 Hình 3.27 Sắc ký đồ dung dịch cao Hexane đo bước sóng 254 nm Theo quan sát sắc ký đồ thu được, có peak đặc trưng, tương ứng với chất có cao Hexane Peak thời gian lưu 24 phút, peak vào khoảng phút 31 Peak thứ thời gian lưu 35 phút Hình 3.28 Sắc ký đồ dung dịch cao Chloroform đo bước sóng 254 nm Trong cao Chloroform, phân tích chất đặc trưng, thời gian lưu chất phút thứ 24 Hình 3.29 Sắc ký đồ dung dịch cao Ethyl acetate đo bước sóng 254 nm Quan sát sắc ký đồ cao Ethyl acetate, có peak đồng nghĩa với việc có chất đặc trưng vài tạp chất khác Thời gian lưu chất 14 21 phút Hình 3.30 Sắc ký đồ dung dịch cao Nước đo bước sóng 254 nm Đối với phân đoạn cao nước, chất có thời gian gian lưu ngắn phân tách cột C18 nên việc phân tách cột C18 không hiệu Các chất đường khử, polysaccharide,… Phân đoạn tiến hành phân tách hệ thống sắc ký khác sử dụng cột carbohydrate, cột amine Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Thời gian ni cấy thích hợp để thu nhận sinh khối tơ nấm linh chi 18 ngày điều kiện nhiệt độ 30oC Trong thành phần tơ nấm linh chi, nuôi cấy điều kiện nhiệt độ 30oC có hoạt chất: antraglycosid, acid béo, tinh dầu, phytosterol, tanin, đường khử, saponin, acid uronic, acid hữu cơ,… Cao Methanol đánh giá có khả kháng khuẩn tốt với loại vi khuẩn S.aureus, B.subtilis, E.coli, P.aeruginosa nồng độ 20 mg/ml Đồng thời cao Methanol có khả kháng oxy hóa tốt với IC50 1,094 mg/ml Các phân đoạn cao chiết Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, nước tơ nấm có khả kháng khuẩn yếu cao tổng Methanol, khả kháng oxy hóa cao Chloroform cao Ethyl acetate tốt cao tổng, cao Hexane tương đương, cao nước khả kháng oxy hóa yếu Phân tích phân đoạn chiết, thu cao Hexane có hợp chất, cao Chloroform có chất, cao Ethyl acetate có chất cao nước chưa xác định 4.2 Kiến nghị Xác định nồng độ ức chế tối thiểu cao Methanol chủng vi khuẩn Dùng hệ thống sắc ký khác để xác định thành phần phân đoạn cao nước Thu nhận xác định hoạt chất có phân đoạn cao phân tách HPLC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tai liệu Tiếng Việt Arichi D.S and Hagashi D.T (2003) Linh chi nguyên chất bệnh thời (Đoàn Sáng dịch) Nhà xuất Y học, Hà Nội, Việt Nam Đỗ Tất Lợi (2006) Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y Học, Hà Nội Đoàn Sáng (2003) Linh chi nguyên chất bệnh thời Nhà xuất Y học, Hà Nội, Việt Nam Đoàn Suy Nghĩ (2008), Nghiên cứu tác dụng bảo vệ nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) cấu trúc mơ tinh hồn chuột nhắt trắng dòng SWISS bị chiếu xạ liều cao Tạp chí khoa học, Đại học Huế, số 49 Lê Quỳnh Loan (2014), Thử nghiệm nuôi cấy khảo sát thành phần hoạt chất số chủng nấm họ Linh chi Ganodermataceae thu nhận tự nhiên, Luận văn Thạc sĩ, ĐH KHTN TP.HCM, Tp Hồ Chí Minh Lê Xuân Thám (1996) Nấm Linh chi – tài nguyên dược liệu quí Việt Nam Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Lê Xuân Thám (2013) Phát triển sản xuất nấm sở điều tra xây dựng bảo tàng nấm Vườn quốc gia Cát Tiên Báo cáo Khoa Học – Sở Khoa học Công nghệ Đồng Nai Lê Xuân Thám (1996) Nghiên cứu đặc điểm sinh học đặc điển hấp thu khoáng nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr).Karst Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Việt Nam Nguyễn Hữu Đống Đinh Xuân Linh (2000) Nấm ăn nấm dược liệu công dụng công nghệ nuôi trồng Nhà xuất Hà Nội, Hà Nội 10 Nguyễn Hữu Đống, Nguyễn Thị Sơn Zani Federico (2002) Cơ sở khoa học công nghệ nuôi trồng Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 11 Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, ĐH Quốc gia TP.HCM, Thành phố Hồ Chí Minh 12 Nguyễn Lân Dũng (2001) Công nghệ nuôi trồng nấm, tập Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 13 Nguyễn Minh Khang (2005), Khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum, Corner) phát vùng núi Chứa Chan – Việt Nam, Luận văn kỹ sư, ĐH Nông Lâm TP.HCM, Tp Hồ Chí Minh 14 Nguyễn Phước Nhuận (2001) Giáo trình sinh hố học, phần 1, Nhà xuất Đại học Quốc Gia TPHCM, T.p Hồ Chí Minh 15 Nguyễn Thị Mai Anh, Đào Văn Phan, Phạm Thị Vân Anh (2005), Bước đầu nghiên cứu tác dụng nấm linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) qua số số lipid máu chuột cống Tạp chí nghiên cứu Y Học 38 (5) 16 Trần Hùng (2004) Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dược TP.HCM 17 Trần Văn Mão (2004) Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội 18 Viện Dược liệu – Bộ Y Tế (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ Dược thảo, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội , tr 28-35, 279-292, 367 Tai liệu Tiếng Anh 19 Chairul, T.T., Hayashi, Y., Nishizawa, M., Tokuda, H., Chairul, S.M., Hayashi, Y.(1991) Applanoxidic acids A, B, C and D, biologically active tetracyclic triterpenes from Ganoderma applanatum Phytochemistry 30, 4105– 4109 20 Hamide Ceniuva Performance Liquid and tuncel Ozden Chromatographic (2002) Simultaneous Determination of High paracetamol, phenylephrin HCl and chlorpheniramine maleate in pharmaceutical dosage forms Journal of Chrmatografic Sience, ISSN 0021-9665 Volume 40, Number 2, pp 97-100 21 Masao Hattori (2006), Protective effects of an acidic polysaccharide isolated from fruiting bodies of Ganoderma lucidum against murine hepatic injury induced by Propionibacterium acnes and lipopolysaccharide, J Nat Med 22 Shwu-Bin Lin, Chyi-Hann Li, Shiuh-Sheng Lee, Lou-Sing Kan (2003) Triterpene-enriched extracts from ganoderma lucidum inhibit growth of hepatoma cells via suppressing protein kinase c, activatin mitogen-activated protein kinases and g2-phase cell cycle arrest Life Sciences 72 (2003) 2381 – 2390 23 Steyaert R.L (1972) Species of Ganoderma and related genera mainly of the boyor and leiden herbaria National de Beigique, Burxelle 24 Yihuai Gao, Guoliang Chen, Jin Lan, He Gao and Shufeng Zhou (2001) Extractoin of Ganoderma polysaccharides at relatively low temperature Froc Int Symposium Ganoderma Sci, Auckland 25 YihuaiGao, Jin Lan and Zhifang Liu, Extraction and determination of Ganoderma polysaccharides Int Med Complement Med Vol 1, Supplement 1,0000 26 Zhaoji – Ding (1980) The Ganodermataceae in chine Berlin Shiffigart Tai liệu từ Internet 27 https://sv.wikipedia.org/wiki/Ganoderma_subresinosum 28 http://www.Mushroom InformationGanoHIV.mht 29 http://khoahoc247.com/index.php/2014/01/tim-hieu-ve-linh-chi-p2/ PHỤ LỤC Phu lục A: Hình ảnh thí nghiêm Tơ nấm Linh chi đen nuôi môi trường PDA Sinh khối nấm Linh chi đen môi trường lỏng sau 15 nuôi cấy Thực hiện phản ứng DPPH đĩa 96 giếng (I) mg/ml ; 1mg/ml; (II) mg/ml; (III) (IV) 0,5 mg/ml; (V) 0,25 mg/ml; (VI) 0,125 mg/ml Máy HPLC Phu lục B: Các bảng phân tích ANOVA Theo dõi tăng sinh khối tơ nấm Linh chi đen môi trường lỏng Summary Statistics Cou N3 3nt N6 N9 N12 N15 N18 Tot 18 al Ave Sta Coe Min Ma Ran Stn rag 0.01 nda 3.64 ff 0.26 imu 0.28 xim 0.02 ge 0.41 d 0.27 633 0.01 006 2.94 286 0.63 7 0.03 -407 0.65 0.66 166 0.10 921 5.63 906 1.71 0.2 0.53 1.80 1.91 0.62 267 0.05 158 2.65 549 1.87 3 0.09 1.17 053 1.90 1.96 42.11 047 0.06 114 3.10 2.05 22.18 20.13 089 0.47 557 2.55 779 2.1 2.21 0.11 -396 2.15 0.05 533 0.76 500 51.3 195 0.26 2.21 1.94 -0.03 1.48 333 144 334 1.29 ANOVA Table Sou rce Bet Wit hin Tot Su Df m 9.81 0.04 12 132 17 9.85 Me F- Pan 1.96 Rati 569 Val 0.00 0.00 344 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Cou Me Ho an X mog N3 3nt 0.27 633 X N6 0.65 N9 166 1.80 X 267 X N12 1.90 X N15 2.11 X N18 2.15 533 Khả kháng khuẩn tơ nấm linh chi cao Methanol khảo sát phương pháp khuếch tán giếng thạch Summary Statistics Cou Ave S Coe Min Ma Ran nt rag t ff imu xim ge B 17.0 1.0 5.88 16.0 18.0 2.0 subt 20.3 0.57 2.83 235 20.0 21.0 1.0 E P 19.6 0.57 2.93 19.0 20.0 1.0 aeru S 667 17.0 735 1.73 568 10.1 16.0 19.0 3.0 Tot 12 18.5 1.83 9.91 16.0 21.0 5.0 al 402 363Table ANOVA Sou rce Bet Wit hin Tot Su Df m 27.6 9.33 333 11 37.0 S t 0.0 1.22 1.22 0.52 Me F- Pan 7.90 Rati 0.00 Val 9.22 1.16 667 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Cou Me Ho B 17.0 X subt 17.0 X S P 19.6 X aeru E 667 20.3 X Phu lục C: Thanh phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn ▪ Môi trường tăng sinh vi khuẩn: LB Nước cất : 100 ml Pepton :1g NaCl :1g Yeast extract : 0,5 g ▪ Môi trường đĩa thạch kháng khuẩn: LBagar Nước cất : 100 ml Pepton :1g NaCl :1g Yeast extract : 0,5 g Agar :2g ... hoạt tính A subresinosum chưa nghiên cứu thấu đáo Chính thế, chúng tơi tiến hành thực nghiên cứu “Khảo sát sơ phần hóa học va đánh giá sô hoạt tính sinh học tơ nấm Linh chi đen Amauroderma subresinosum ... Xích chi (Linh chi đỏ gọi Hồng chi) ▪ Hắc chi (Linh chi đen gọi Huyền chi) ▪ Thanh chi (Linh chi xanh gọi Long chi) ▪ Bạch chi (Linh chi trắng gọi Ngọc chi) ▪ Hồng chi (Linh chi vàng gọi Kim chi) ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TƠ NẤM LINH CHI ĐEN AMAURODERMA SUBRESINOSUM