hướng dẫn sử dụng máy sắc ký lỏng HPLC CM 5000

1. Chạy đường nềnTrước khi chạy mẫu ta phải thực hiện chạy đường nền cho Detector (chỉnh Zero)Các bước chạy đườngnền :1. Chọn Control > Preview Runkhi đó đường nền sẽ chạy2. Khi đường nền chạy hết thời gian ma ta đặt cho tham số Run time thì sẽ tự động ngừng. Nếu thấy đườngnền chưa ổn định thì ta phải chạy lại cho tới khi đường nền ổn định.3. Nếu thấy đường nền ổn định trước thời gian Run time thì ta có thể ngừng chạy bằng cách chon Control> Stop Run.Chú ý:Thông thường từ khi bắt đầu chạy đến khi đường nền ổn định cũng phải cỡ 30 phút (nếu hệ thống sạch).Còn hệ thống mà bẩn có thể lâu hơn.Nên rung siêu âm pha động trước khi chạy.Nước cất phải được lọc qua màng lọc 0.45um

BƯỚC 1: KHỞI ĐÔNG HỆ THỐNG Giả sử hệ thống HPLC đã được lắp đặt xong và phần mền EZchrom Elite đã được cài đặt hoàn thành Trước khi khởi động hệ thống phải chuẩn bị đầy đủ các Mobile phase , mẫu chuẩn chú ý thứ tự các Mobile phase đối với các kênh

1 Trình tự khởi động hệ thống HPLC

- Lắp cột vào giá đỡ (nếu có tháo cột cất khi tắt hệ thông )

- Mở van xả ở bơm dung môi, xả dung môi nếu kênh muốn sử dụng mới không hòa tan dung môi cũ…

- Mở điện nguồn

- Lần lượt mở các Module CM5110, CM5210, CM5310, CM5420, PC , Print

2 Khởi động phần nềm EZchrom Elite

- Kích đúp (Double –click) trên biểu tượng EZchrom Elite trên màn hình máy tính

- Xuất hiện cửa sổ ban đầu như sau:

- Kích đúp vào biểu tượng có tên mặc định là Instrument hoặc tên do ta đặt VD: DAD system

- Lúc này đã khởi động xong phần nềm EZchrom Elite và sẽ có một cửa sổ mới để ta có thể cài đặt thông

số và chạy mẫu…

BƯỚC 2: RỬA CÁC ĐƯỜNG ỐNG NẾU CÓ BỌT KHÍ

Trong các đường ống có xuất hiện bọt khi trong các trường hợp khi ta chạy mẫu lẫn đầu tiên hoặc khi

ta thực hiện thay đổi pha đông

1 Các bước thực hiện rửa các ống (Purge) nếu trong ống có bọt khí

- Vặn van Drain ngược chiều kim đồng hồ 1800

1.1 Cách 1: Chọn Method > Instrument Set Up

- Xuất hiện cửa sổ Instrument Set up như sau :

- Xuất hiện cửa sổ Instrument Set up như sau :

- Chọn thông số tốc độ dòng để thực hiện rửa kênh A (100%) Flow rate 0.4ml/min để thực hiện rửa kênh A

- Sau đó nhấn nút Purge trên CM 51110 pump để thực hiện rửa kênh A

Để thực hiên rửa kênh B, C, D ta thực hiên tượng tự như trên

Cách khác 2 và 3: Thường sử dụng với hệ High pressure gradient Vì với hệ áp suất cao ta không trực tiếp bấm Purge trên bơm ngay được

1.2 Cách 2: Ta có thể thực hiện rửa các kênh trực tiếp trên các phím cửa bơm:

- Bấm phím “0 = Manual”  Nhập giá trị bất kỳ cho tốc độ dòng dưới mục “Flow” rồi bấm “Enter” 

“Enter” Sau đó ta bấm “Pump” nếu bơm chưa chạy rồi bấm “PURGE” lúc đó bơm sẽ chạy loại khí với tốc độ tối đa (9.999ml/phút)

1.3 Cách 3: bấm Purge trong cửa sổ “Instrument status”:

Từ cửa sổ chạy mẫu chính ta bấm “Control”  chọn “Instrument status” sau đó chọn mục “Pump” rồi chọn

“Purge” Sau khi bấm Purge sẽ xuất hiện hộp thoại nhỏ cho phép ta chọn Purge bơm A hay bơm B

Chú ý: Phải vặn van thải ra trước khi bấm Purge

BƯỚC 3: TẠO MỘT PHƯƠNG PHÁP MỚI

Để thực hiện một phép phân tích cụ thể, ta phải tạo một phương pháp phù hợp cho phép phân tích đó

I) Trình tự tạo một phương pháp mới

1.1 Chọn File > Method > New khi đo trên màn hình màu xanh trên cùng cửa sổ xuất hiện tên mặc định

là Method : untitle.met

1.2 Đối với các phương pháp mới này ta đặt các tham số sau:

1.3 Đặt các tham số của thiết bị

1.4 Chon Method > Instrument Set up , khi đó xuất hiện cửa sổ

1.5 Nhập các tham số cần thiết cho các thiết bị

Click vào mục new trong bảng method để khởi tạo phương pháp phân tích mới

Trong mục này ta sẽ tiến hành cài đặt các thông số cho từ modul của HPLC

1.5.1 Pump:

- Pressure limit: áp suất giới hạn của hệ thống

 Min: áp suất nhỏ nhất của bơm Thường để mặc định là 0

 Max: áp suất lớn nhất của bơm Thường để là 40

 Thường chọn là LFM

- Turn off a shutdown: nếu chọn mục này bơm sẽ tự tắt sau khi khai báo tắt hệ thống trong bảng chạy mẫu theo lô

.1.5.2 Cài đặ thông số cho bộ tiêm mẫu tự động

- Sampling: thông số cho xy lanh rút mẫu

 ASP syringe Speed: tốc độ hút mẫu của syringe

 DSP syringe speed: tốc độ bơm mẫu của syringe

 Needle down speed: tốc độ chuyển động của kim tiêm mẫu

 Syringe volume: Thể tích xy lanh (70, 175, 700)

 Air volume: Thể tích khí lấy vào Trong All volume giá trị này = 0

- Rinse port wash: Rửa bộ phận rửa kim

Wash time (s): thời gian rửa tính bằng giây

- Needle wash: rửa kim tiêm mẫu

 Wash solvent: dung môi rửa kim Có thể chọn dung môi 1 hoặc dung môi 1 và 2

 Wash time solvent 1 (s): thời gian rửa cho dung môi 1

 Wash time solvent 2 (s): thời gian rửa cho dung môi 2

 Needle wash before injection: chế độ rửa kim trước khi tiêm Nếu chọn ô này, sau khi hút mẫu xong kim sẽ tự động được rửa trước khi tiêm

- Pluger wash:

 Pluger wash after sequence finish: rửa pluger sau khi kết thúc quá trình chạy

theo lô Dung môi rửa là dung môi 2

 Wash time (s): thời gian rửa plunger

- Wash solvent: dung môi rửa

 Solvent 1 name: tên dung môi rửa 1

 Solvent 2 name: tên dung môi rửa 2

- Injection: tiêm mẫu

- Injection method: phương pháp tiêm mẫu Bao gồm 3 chế độ tiêm mẫu: Cut, All, Loop

- Lead volume (ml): thể tích đầu Phần này là thể tích bỏ đi ở đoạn đầu của phương pháp tiêm Cut

- Rear volume (ml): thể tích sau Phần này là thể tích bỏ đi ở đoạn sau của phương pháp tiêm Cut

- Feed volume (ml): thể tích dung môi 1 được lấy vào loop

- Waste volume (ml): thể tích mẫu bỏ đi ở hai đầu vòng loop

- Time injection with pump (PASS): thời gian tiêm mẫu với bơm Chế độ đồng bộ hóa giữa thời gian tiêm mẫu với vị trí quay của trục piston Chế độ này tích hợp trong hệ gradient áp suất thấp Chế độ Pass làm tăng độ ổn đinh của thời gian lưu khi tiêm mẫu

- Sense Missing vial: Chế độ báo lỗi vial khi tiêm mẫu Chế độ này cho phép báo lỗi khi kim tiêm mẫu không phát hiện được vial trong khay mẫu

1.5.3 Cài đặt các thông số cho Lò cột

- Temperature: nhiệt độ

Max Temperature for column 0C: nhiệt độ giới hạn của lò cột (20 – 95 0C)

- Wait before Injection: Chờ trước khi tiêm tiêm

 Wait with Tolerance (±0C): nhiệt độ dao động của lò cột

 Wait time (min): thời gian chờ ổn định

- Temperature control: điều khiển lò cột

- Control off at shutdown: nếu chọn mục này bơm sẽ tự tắt sau khi khai báo tắt hệ thống trong bảng chạy mẫu theo lô

Time table: bảng cài đặt nhiệt độ lò (Temp) cột theo thời gian chạy (Time)

1.5.4 Cài đặt các thông số cho đầu dò DAD hoặc UV- VIS Detector :

- Cài đặt thông số cho đầu dò UV – Vis

 Time: thời gian lấy tín hiệu của đầu dò

 Stop time (min): thời gian muốn lấy tín hiệu từ đầu dò

 Response time (s): thời gian đáp ứng khi chọn giá trị càng nhỏ tốc độ lấy tín hiệu càng nhanh

- Sampling period (ms): khoảng thời gian lấy tín hiệu khoảng thời gian càng ngắn lượng tín hiệu lấy càng lớn

- Absorbance: độ hấp thu

 Offset (AU): vị trí điểm 0 của tín hiệu

 Polarity: trạng thái lấy tín hiệu Bao gồm cực dương (Positive) và cực âm tín hiệu (Negative)

 Range: chiều cao lấy tín hiệu cực đại Bao gồm 2 (thường hay sử dụng là 2)

và 4

- Auto zero before injection: nếu chọn mục này tín hiệu sẽ được chuyển về điểm

0 trước khi bắt đầu ghi tín hiệu

- Lamp: đèn

 Mode: chế độ chọn đèn Gồm 3 chế độ: D2, Wi, D2 và Wi

 Lamp of at shutdown: nếu chọn mục này bơm sẽ tự tắt sau khi khai báo tắt

hệ thống trong bảng chạy mẫu theo lô

- Wavelength: bước sóng Chọn bước sóng cần để lấy tín hiệu Bao gồm 2 chế độ: Single Wavelength và Due Wavelength

 Single Wavelength: trong bảng cài đặt gồm 3 mục

 Time (min): cài đặt khoảng thời gian lấy tín hiệu cho từng bước sóng

 Wavelength (nm): cài đặt bước sóng cần lấy tín hiệu

1.5.5 Các thông số khác trong cửa sổ “Aux Traces”

- khi ta muốn thể hiện các thông số này trên màn hình ta có thể kích vào ô ở mục “Acquire” Thường thì không cần thiết

1.5.6 Cửa sổ Trigger

- Nếu chọn “none” sẽ không tim mẫu

- Nếu chọn “Internal” sẽ phải bấm “OK” sau khi tiêm mẫu

Do vậy nên chọn “External” ở mục này

- Kiểm tra lại một lần nữa các thông số của phương pháp

II) Trình tự lưu phương pháp

Nếu chọn External để

tự động chạy sau khi bơm mẫu

2.1 Chọn File > Method > Save as Khi đó xuất hiện cửa sổ sau

2.2 Chọn thư mục lưu phương pháp là Method

2.3 Đặt tên cho phương pháp

2.4 Sau khi đặt xong, nhấn nút Save để lưu phương pháp

Chú ý : Phương pháp nên lưu trong thư mục Method

Phương pháp và data có thể lưu ở bất kỳ folder nào trong ổ cứng máy tính Nhưng nên đặt tên và đường dẫn như thế nào để dễ tìm kiếm nhất

Phương pháp mà ta tạo lúc này chưa thực sự hoàn chỉnh Sau khi chạy các mẫu chuẩn ta phải thực hiện các thao tác trên sắc đồ nhận được như đặt tên các peak, chỉnh sửa cho peak, tạo đường chuẩn, tạo báo cáo Khi

đó phương pháp mới thực sự hoàn chỉnh và các đặc tính này sẽ ảnh hưởng trực tiếp lên file data đang phân tích hay bất cứ file nào được mở trong nó

III) Mở phương pháp đã có sẵn

Khi đã có sẵn phương pháp phù hợp với mẫu mà ta muốn phân tích (thường thì phương pháp mà ta đã tạo cho mẫu này ở lần chạy trước) khi đó ta chỉ cần mở phương pháp này để chạy mà ta không cần tạo phương pháp mới

- Các bước thực hiện mở một phương pháp mới như sau:

3.1 Chọn File > Method > Open Khi đó xuất hiện cửa sổ Method File open

3.2 Chọn thư mục lưu phương pháp Method > chọn tên phương pháp > nhấn open

Chú ý : Khi đó trên thanh tiền đề xuất hiện tên phương pháp ta mới mở

Tất cả các đặc tính cửa phương pháp này sẽ ảnh hưởng đến phép phân tích hoặc data hiện hành

Đường dẫn lưu trong Method

Đặt tên cho phương pháp

BƯỚC 4 : ĐO và HIỆU CHỈNH SẮC ĐỒ

1 Chạy đường nền

Trước khi chạy mẫu ta phải thực hiện chạy đường nền cho Detector (chỉnh Zero)

Các bước chạy đường nền :

1 Chọn Control > Preview Run khi đó đường nền sẽ chạy

2 Khi đường nền chạy hết thời gian ma ta đặt cho tham số Run time thì sẽ tự động ngừng Nếu thấy đường nền chưa ổn định thì ta phải chạy lại cho tới khi đường nền ổn định

3 Nếu thấy đường nền ổn định trước thời gian Run time thì ta có thể ngừng chạy bằng cách chon Control

> Stop Run

Chú ý:

- Thông thường từ khi bắt đầu chạy đến khi đường nền ổn định cũng phải cỡ 30 phút (nếu hệ thống sạch) Còn hệ thống mà bẩn có thể lâu hơn

- Nên rung siêu âm pha động trước khi chạy

- Nước cất phải được lọc qua màng lọc 0.45um

2 Chạy mẫu chuẩn, mẫu thử:

Sau khi đường nền ổn định, ta thực hiện chạy mẫu chuẩn và mẫu thử

Có 2 chế độ chạy mẫu chuẩn: Chạy mẫu theo chế độ Single Run và Sequence Run

- Single Run: Chế độ Single Run thường dùng để chạy mẫu chuẩn để thực hiện các thao tác xác định peak, đặt tên cho peak Sau đó lưu phương pháp (Lúc này chỉ cần chọn File >Method > Save)

- Sequence Run: Chế độ này dùng để chạy các mẫu chuẩn có nồng độ khác nhau để xây dựng đường chuẩn có nhiều mức (đi qua hai điểm trở lên và không nhất thiết phải đi qua gốc tạo độ)

- Để thực hiện hiệu chỉnh sắc đồ ta chạy mẫu chuẩn ở chế độ Single Run

2.1 Các bước chạy ở chế dộ Single Run:

+ Chọn Single Run khi đó cửa sổ Single Run Acquistion xuất hiện

+ Nhập các tham số theo yêu cầu vào cửa sổ sau

1 Sample ID : Nhập tên mẫu ta muốn chạy

2 Method : Nhập tên phương pháp (kể cả đường dẫn) mà ta muốn chạy mẫu này, tên phương pháp sẽ tự động chèn vào ô này, ta có thể nhấn biểu tượng Open kế bên để nhập tên

3 Data path: Nhập tên File Phải có đường dẫn, ta có thể dùng biểu tượng open kế bên để chọn đường dẫn và thư mục để lưu file này vào

4 Data File: Tên file mà ta cần lưu vào Nên chọn tên dễ nhớ dễ tìm và liên quan đến tên mẫu đo

5.Vial: Vị trí đặt mẫu (đối với hệ sử dụng bơm mẫu tự đông Auto Sampler )

6 Injection volume: Thể tích mỗi lần bơm mẫu (đối với hệ sử dụng bơm mẫu tự đông Auto Sampler )

7 Các mục khác: Có thể bỏ qua, hoặc để mặc định

- Sau khi điền đầy đủ các tham số thích hợp vào cửa sổ trên Nhấn nút Start để bắt đầu chạy

Lúc này màn hình sẽ xuất hiện sắc đò như sau:

Chú ý: Trên thanh tiêu đề màu xanh xuất hiện tên phương pháp và file dữ liệu

Lúc này ở phía dưới cửa sổ xuất hiện dòng chữ "Waiting for finishing run" thì bắt đầu bơm mẫu

+ Bơm mẫu Nếu có bộ bơm mẫu tự động thì máy sẽ tự động bơm và chạy theo quy trình đã cài đặt Bước này chủ yếu hiệu chỉnh sắc đồ, do đó ta có thể dùng một trong các nẫu chuẩn mà ta chuẩn bị chạy để bơm Khi đó ta thực hiện thao tác hiệu chỉnh trên sắc đồ nhận được

+ Khi sử dụng bơm mẫu bằng tay thì thực hiện theo các bước sau :

Vị trí lọ mẫu trong khay

Và thể tích mẫu cần bơm

- Rửa Syringe bơm mẫu bằng pha động khoảng 5 lần

- Lau kim Syringe

- Rửa lại Syringe bằng chính dung dịch mẫu khoảng 5 lần

Chú ý : khi rửa bằng dung dịch mẫu phải cẩn thận, hút dung dịch mẫu vào trong syringe rồi bơm ra ngoài không được bơm vào lọ dung dịch mẫu

- Hút mẫu vào Syringe chú ý tránh bọt khí và bơm thể tích gấp khoảng 3 đến 4 lần thể tích của sample loop

- Lau Syringe một lần nữa

- Đưa kim Syringe vào Rheodyne ( Rheodyne ở vị trí Inject )

- Chuyển vị trí Rheodyne đến vị trí Load

- Bơm mẫu nhớ để lại khoảng 5 đến 10ul ở xilanh, không nên bơm hết

- Chuyển Rheodyne về vị trí Inject

- Rút Syringe ra khỏi Rheodyne

Lúc này phần mền sẽ tự động kích Start để bắt đùa ghi sắc đồ (do khi cài đặt Trigger: External )

+ Hiệu chỉnh sắc đồ:

Sau khi quá trình sắc ký kết thúc, ta thực hiện một số thao tác chỉnh sửa để nhận được sắc đò như ý muốn

Ví dụ như xuất hiện trên sắc đồ tên các peak (Name), thời gian lưu (Ret time) cửa các peak cần thiết

+ Các bước thực hiện hiệu chỉnh sắc đồ :

Ta có thể thực hiện chỉnh sửa các sắc đồ từ các biểu tượng ở phía dưới cửa sổ:

hoặc bằng cách nhấn chuột phải trên nền sắc đồ xuất hiện menu trên nền sắc đồ, chọn Graphical

programming > xuất hiện các lệnh chỉnh sửa

* Thông thường ta thực hiện các thao tác chỉnh sửa sau:

Chú ý : khi chọn các lệnh chỉnh sửa thì ở thanh trạng thái phía dưới cửa sổ xuất hiện các nhắc nhở Chú

ý làm theo các nhắc nhở này

Ngày sau khi chọn điểm cuối thì xuất hiện cửa sổ Define Peaks :

- Giá trị thờ gian Start time và Stop time được ghi tự động đúng bằng giá trị khi ta chọn điểm đầu và điểm cuối trên sắc đồ

- Ở hộp Units ta chọn đơn vị nồng độ thích hợp (% ,µg/ml, ppm, ppb )

- Chọn Replace existing peaks in table để có thể thay đổi các peak có trước trong bảng peak

- Kiểm tra lại các tham số cho thích hợp nhấn OK

- Để thấy sự thay đổi trên sắc đồ chọn Analysis > Analyze

Dung Define Peaks

chọn điểm

đùa tại đay

Chọn điểm cuối tại đây

Chọn đơn vị nồng độ Giá trị mặc định

2 Ngoài ra còn hay sử dụng các lệnh như: Minimum area, Integration off, manual baseline…Ta có thể di chuột đến các biểu tượng để biết tên lệnh

Hoặc ta có thể dùng lệnh từ Method > Integration Events khi đó đẵ xuất hiện bảng sau:

- Từ bảng này ta thực hiện một số chỉnh sửa (thường là slope, width, lock on, lock off, minimum Are) cho peak xong ta đóng bảng này lại

- Để thấy sự thay đổi trên sắc đồ ta chọn Analysis > Analyze

3 Hoàn thành bảng peak

- Chọn Method > Peaks/groups hoặc dấu trên biểu tượng khi xuất hiện bảng peaks :

- Kiểm tra và nhập cá thư mục cần thiết vào bảng trên

- Đặt tên peak (chú ý tên peak phải đúng thời gian lưu của nó so sánh giá trị cột Ret.time với thời gian lưu trên sắc đồ)

- Muốn xóa các peak không cần thiết nhấp chuột vào biểu tượng cột rồi nhấn phím Delete trên bàn phím Xong nhấn chuột phải chọn Number Peak ID's để sắp xếp lại các thứ tự

- Giá trị cột Ret.time và cột Window tự động ghi vào khi sử dụng lệnh Define Peaks Khi chạy mẫu , nếu các mẫu được phát hiện trong khoảng thời gian Ret.time ± Window, thì peak gần giá trị Ret.time nhất sẽ được xác định như là chất có trong mẫu chuẩn

- Cột Fit type có thể chọn linear…

- Cột Zero khi ta chọn thì đường chuẩn đi qua gốc tạo độ thông thường thì không chọn cột này

- Các cột Level ta nhập nông độ các chất có trong mẫu chuẩn , ta nhập theo thứ tự từ thấp đến cao Chú ý thật kỹ khi nhập thứ tự nồng độ cho các peak vì nó liên quan tới việc xây dựng đường chuẩn Với mẫu thử thì không cần nhập giá trị nồng độ

* Chú ý : Muốn thêm hay xóa các cột levels , ta double- click vào hàng cột 10levels hoặc nhấn chuột phải vào hàng 10levels nhấn vào Edit khi đó xuất hiện các hộp thọai để xác định số cột level Xong nhấn phím Enter từ bàn phím để có số cột level mong muốn

- Kiểm tra lại các tham số trên bảng peak cho thích hợp rồi đóng bảng peak lại (nhấn nút close (x) ở góc trái trên bảng peak)

- Muốn xuất hiện tên thời gian lưu trên sắc đò ta nhấn chuột phải trên sắc đồ >

xuất hiện menu lệnh > chọn Annotions như hình bên

Khi đó xuất hiện cửa sổ Trace Annotation Properties như trang sau :

Thì ta chọn  Retention time, Area, name… OK

- Từ cửa sổ này ta có thể chọn hay không chọn các thông số để xuất hiện trên sắc đồ

- Xong nhấn Apply to All > OK

- Để thấy sự thay đổi trên sắc đồ ta chọn Analysis > Analyze

BƯỚC 5: TẠO ĐƯỜNG CHUẨN

- Để tạo đường chuẩn ta phải chạy mẫu chuẩn Tùy theo từng lọai phân tích mà ta chạy một hay nhiều mẫu chuẩn ứng với đường chuẩn chạy qua một hay nhiêu điểm

- Trình tự các bước tạo đường chuẩn :

Nhưng chú ý phải chọn đùng kênh phân tích ở đây Với DAD phải chọn đúng bước sóng

Trước khi chạy mẫu ta phải chạy mẫu chuẩn trước để xây dựng đường chuẩn, thông thường ta thường chạy ít nhất 3 mẫu chuẩn với nồng độ khác nhau để tạo được các đường chuẩn ít nhất qua 3 điểm

- Có 2 phương pháp tạo đường chuẩn: Tạo đường chuẩn bằng cách chạy Sequence Run, Tạo đường chuẩn bằng cách chạy Single run

5.1 Phương pháp 1: Tạo đường chuẩn bằng cách chạy Sequence Run:

- Các bước tạo đường chuẩn bằng cách chạy Sequence Run :

1 Chuẩn bị các mẫu chuẩn (VD: ba mẫu với 3 nồng độ khác nhau )

2 Tạo một Sequence mới bằng cách chọn : File > Sequence > Sequence Wizard xuất hiện cửa sổ Sequence Wizard - UnKnowns :

3 Nhập các tham số thích hợp vào cửa sổ trên :

- Sample ID : Nhập tên của mẫu chuẩn ta chuẩn bị chạy, chú ý đặt tên mẫu theo dạng samplename(01) vì khi chạy mẫu chuẩn số thứ tự sẽ tự động tăng theo số lần chạy mẫu (samplename(01) ,samplename(02) ,samplename(03) )

- Method : Kiểm tra xem có phải phương pháp hiện hành hay không, thông thường Ezchrom Elite sẽ mặc định phương pháp hiện hành

- Data Path: Đường dẫn đến thư mục cần lưu file dữ liệu thông thường Ezchrom Elite sẽ mặc định data hiện hành

- Data File : Đặt tên cho file dữ liệu Chú ý ta phải đặt tên theo dạng Data name 001 khi đó số thứ tự sẽ tự động tăng theo số lần chạy (Data name 001 ,Data name 002 Data name 003 )

- Repetition per run: số lần chạy mẫu lặp lại, thông thường với chất chuẩn chỉ cần chạy lặp lại 1 lần

- Kiểm tra lại các tham số thích hợp, nhấn Finish xuất hiện bảng Sequence

Nhập số lần bơm mẫu

4 Hoàn thành bảng Sequence:

- Trước hết kiểm tra 2 cột Sample ID và cột Filename tên sample và tên data có số thứ tự có tự động tăng lên không Nếu không thấy tăng ta có thể sửa trực tiếp trên bảng hoặc tạo một Sequence mới và đặt lại tên cho đúng

- Cột Run type:

+ Đối với lần chạy đầu tiên (Run # :1), ta nhấp chuột trên nút mũi tên, khi đó xuất hiện hộp Sample Run Type (s) như sau:

+ Chọn 2 ô Clear All Calibration và begin Calibration > OK

+ Đối với lần chạy cuối tương tự ta cũng nhấp chuột vào nút mũi tên để xuất hiện hộp thoại Sample Run Type (s) khi đó ta nhấn vào ô End Calibration > OK

+ Đối với lần chạy giữa lần đâu tiên và lần chạy cuối cùng khi ra nhập số mức ở cột Level theo thứ tự 1,2,3 thì sẽ tự động ghi vào mặc định là Calibration Với mẫu thử thì tự động được hiểu là Unkown

+ Nhập nồng độ ở cột Level : ta nhập theo thứ tự 1,2,3 tương ứng với các lần chạy 1,2,3 Khi đó thì ứng với lần chạy đầu tiên với mẫu chuẩn có nồng độ nhỏ nhất Tăng dần cho đến khi lần chạy cuối cùng thì

tương ứng với lần chạy có mẫu chuẩn cao nhất Chú ý kỹ phần này để nhập mức nồng độ cho đúng ở bảng Peaks/Grounps và bơm mẫu chuẩn chạy cho đúng (nồng độ từ nhỏ nhất đến nồng độ cao nhất) + Sau khi chọn Run Type cho lần chạy đàu tiền và lần chạy cuối cùng và nhập số mức cột Level ta được bảng sau:

+ Cột Method: chọn cho đúng tên phương pháp hiện hành Nếu không phải phương pháp hiện hành nhấn nút mũi tên để mở phương pháp hiện hành

+ Kiểm tra các tham số trong bảng sequence thích hợp tiến hành lưu phương pháp

5 Lưu Sequence:

Chọn File > Sequence > Save as > xuất hiện hộp thoại Save sequence file as:

Chọn thư mục đẻ lưu Sequence (VD: C:\ Ezchrom\ Sequence)

File name: đặt tên cho Sequence (VD: Mysequence.seq)

Nhấn nút Save để lưu Sequence

Để mở một file Sequence đã tạo sẵn ta chỉ cần bấm chọn File > Sequence > Open xuất hiện cửa sổ hộp thoại Open Sequence File