ket qua nghien cuu tao thuoc tri mun tu la cay dam but

TÊN DỰ ÁN: NGHIÊN CỨU TẠO THUỐC TRỊ MỤN TỪ LÁ CÂY DÂM BỤT (Hibiscus rose sinensis L.) MỤC LỤC Tiêu đề Trang I Tổng quan vấn đề nghiên cứu 1 Lý chọn dự án Giới hạn, phạm vi nghiên cứu II GIẢ THUYẾT KHOA HỌC VÀ MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Tổng quan tài liệu Mục đích nghiên cứu III NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tương nghiên cứu Nội dung nghiên cứu 3 Phương pháp nghiên cứu IV.SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU V KẾT LUẬN 11 VI ĐỀ XUẤT 11 VII TÀI LIỆU THAM KHẢO 11 LỜI CẢM ƠN Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu TH, THCS, THPT Nguyễn Văn Trỗi, quý thầy cô giáo truyền đạt kiến thức cho chúng em tất bạn học sinh giúp đỡ, động viên nhóm q trình thực dự án, đặc biệt cảm ơn thầy Bùi Xuân Lượng tận tình dẫn cho chúng em thực dự án Cám ơn TS Trần Thị Lệ Minh trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Môi Trường ĐH Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Trung tâm Sâm Dược liệu Tp Hồ Chí Minh hết lịng giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho nhóm hoàn thành dự án I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Lý chọn đề tài Mụn mối bận tâm thường trực lứa tuổi dậy thì, đặc biệt với bạn học sinh THCS, THPT Trong giai đoạn dậy thì, tác động hormon sinh dục, tuyến mồ hôi tiết nhờn da sản sinh nhiều chất nhờn, ứ đọng lại da với tế bào da chết làm bít tắc lỗ chân lơng bề mặt da, từ tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển gây mụn Mụn không viêm biểu mụn đầu trắng mụn đầu đen, gọi chung nhân trứng cá, xuất nhiều mặt, lưng ngực Mụn làm cho bạn học sinh khó chịu, giảm tự tin tập trung ảnh hưởng đến kết học tập Staphylococcus aureus vi khuẩn gây nhiều bệnh nhiễm trùng khác Triệu chứng điển hình nhiễm tụ cầu da bệnh chốc lở hình thành ổ áp-xe chứa đầy mủ, sưng đau tấy đỏ thường kèm theo chảy mủ Lá dâm bụt từ lâu dân gian sử dụng để trị mụn Đã có số nghiên cứu cao chiết từ dâm bụt đến khả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus nghiên cứu tác giả Seyyednejad, 2010 hay tác giả Lương Thị Mỹ Ngân, 2016 Tuy nhiên nghiên cứu chưa nghiên cứu độ an toàn cao dâm bụt chưa nghiên cứu ứng dụng việc tạo thuốc trị mụn đặc biệt cho bạn học sinh Vì nhóm nghiên thực đề tài “Nghiên cứu tạo cao trị mụn từ dâm bụt Hibiscus rose sinensis L.” Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát khả kháng khuẩn cao chiết dâm bụt chủng vi khuẩn Staphylococcuc aureus Nghiên cứu độ an toàn cao trị mụn từ cao chiết dâm bụt chuột Giới hạn, phạm vi nghiên cứu Dự án thực thời gian ngắn, điều kiện chưa đầy đủ, kinh phí hạn hẹp nên đề tài giới hạn vấn đề sau: + Cao dâm bụt thu nhận đến giai đoạn cao tổng ethalnol methanol + Các thí nghiệm sử dụng loại dung môi ethanol methanol nồng độ 980 + Chỉ đánh giá hiệu in vitro thuốc, chưa thực thử nghiệm lâm sàng người II GIẢ THUYẾT KHOA HỌC VÀ MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Tổng quan tài liệu 1.1 Cây dâm bụt Râm bụt Tên khác Tên thường gọi: Râm bụt, Bụp, Bông bụp, Dâm bụt, Hồng bụt, Phù tang, Mộc cẩn, Co ngần (dân tộc Thái), Bioóc ngàn (Tày), Phầy quấy phiằng (Dao) Tên khoa học: Hibiscus rosa sinensis L Họ khoa học: Thuộc họ Bông - Malvaceae Cây Râm bụt Cây nhỡ, cao 4-6m Lá hình bầu dục, nhọn đầu, trịn gốc, mép có to; kèm hình nhọn Hoa nách lá, lớn, 6-7 mảnh đài nhỏ (tiểu đài) hình sợi; đài hợp màu lục dài gấp 2-3 lần đài nhỏ; tràng cánh hoa màu đỏ; nhị nhiều, tập hợp trụ đài; bầu hình trụ hay hình nón Quả nang trịn, chứa nhiều hạt Hình Cây dâm bụt Phân bố: Cây Dâm Bụt loại ưa nắng sống phát triển khí hậu nhiệt đới gió mùa, trồng làm trồng làm hàng rào, làm cảnh phổ biến nhiều nơi Thành phần hóa học: Hoa chứa thiamin, riboflavin, niacin acid ascorbic Hoa vò nát chữa sắc tố anthocyanin cyanin diglucosid Trong hoa có có chất nhầy (https://vi.wikipedia.org/wiki/D%C3%A2m_b%E1%BB%A5t) Nhân dân hay dùng hoa tươi giã nhỏ với muối đắp lên mụn nhọt mưng mủ, khô thuốc lại thay Mụn nhọt đỡ nhức chóng vỡ mủ (Đỗ Tất Lợi, 2004) 1.2 Vi khuẩn Staphylococcuc aureus Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy Lạp staphyle nghĩa chùm nho cầu khuẩn kị khí tuỳ ý Vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào thường khơng có vỏ,có hình cầu, đường kính 0.8 - µm, hình thức tập hợp vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều không gian; bệnh phẩm vi khuẩn đứng lẻ, đơi đám nhỏ Staphylococcus aureus có nhiều mơi trường sống trước đây, thường sống ký sinh vơ hại, gây bệnh, đặc biệt Staphylococcus aureus xâm nhập xuyên qua da, chúng gây nhiều loại nhiễm trùng khác nhau, chẳng hạn nhiễm trùng da, làm loét, da nhiễm trùng nặng máu, phổi mô khác Stahylococcus aureus phân bố rộng rãi tự nhiên có nhiều thực phẩm như: thịt, trứng, sữa da, tóc, lơng người động vật Một số Staphylococcus tìm thấy khắp nơi phân lập từ khơng khí, bụi, thực phẩm, thường trú vùng da niêm mạc người Giống Staphylococcus có 20 lồi khác nhau, có lồi tụ cầu có vai trị y học: + Staphylococcus aureus (S aureus): Tụ cầu vàng xem tụ cầu gây bệnh + Staphylococcus epidermidis (Tụ cầu da) + Staphylococcus saprophyticus Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu tính kháng khuẩn cao chiết dâm bụt - Nghiên cứu tính kích ứng cao chiết da chuột - Giúp học sinh có hoạt động trải nghiệm sáng tạo khoa học kỹ thuật, vận dụng kiến thức vào xở lý tình thực tiễn, biết phương pháp nghiên cứu khoa học kỹ làm việc nhóm III NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu 1.1 Đối tƣợng nghiên cứu: Cây dâm bụt Hibiscus rose sinensis L 1.2 Vật liệu nghiện cứu: Hóa chất: - Hoá chất thu nhận cao dâm bụt: Ethanol 98%, methanol 98% - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Môi trường TSA (triptic Soya Agar): Trypticase peptone 15g/L; Phyto peptone g/L; NaCl: g/L; Agar 15g/L; PH=7,2±0,2 - Môi trường LB: Peptone 10g/L; Yeast Extract 5g/L; NaCl 10g/L; PH=7,2±0,2 Trang thiết bị: - Tủ cấy vô trùng, nồi hấp autoclave, tủ sấy, máy đo pH, cân phân tích, máy lắc - Dụng cụ: Ống đong 1L; bình thủy tinh L; phễu, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, micropipette, ống nghiệm, giá ống nghiệm,… Vi khuẩn Stahylococcus aureus: Được cung cấp Viện Môi trường Công nghệ Sinh học đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Chuột nhắt trắng đực (chủng Swiss albino): Được cung cấp Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế Nha Trang Nội dung nghiên cứu: - Thu nhận cao dâm bụt từ dung môi ethanol methanol - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hai loại cao methanol ethanol từ dâm bụt vi khuẩn Staphylococcuc aureus - Xác định nồng độ chế tối thiểu nồng độ diệt khuẩn tối thiểu cao ethanol vi khuẩn Staphylococcuc aureus - Đánh giá kích ứng da cao ethanol da chuột Phƣơng pháp nghiên cứu 3.1 Thu nhận cao dâm bụt Sử dụng phương pháp ngâm dầm dung mơi: - Quy trình thu nhận cao dâm bụt sử dụng dung môi ethanol (cao ethanol): Lấy 0.4 kg bột dâm bụt ngâm 2L ethanol (980 ) 72 Lọc qua màng lọc sau đem quay 440 để loại bỏ hết ethanol thu cao ethanol - Quy trình thu nhận cao dâm bụt dùng dung môi methanol (cao methanol): Lấy 0.4 kg bột dâm bụt ngâm 2L methanol 980 72 Lọc qua màng lọc sau đem quay 440 để loại bỏ hết ethanol thu cao ethanol - Cao ethanol cao methanol bảo quản điều kiện nhiệt độ 40 C 3.2 Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn Sử dụng phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán đĩa thạch Bauer cộng sự: Hút 100 l dịch huyền phù chủng vi khuẩn thử nghiệm có số lượng tế bào vi khuẩn khoảng 108 CFU/ml nhỏ vào đĩa môi trường trải mặt thạch khô que thủy tinh vô trùng Đục lỗ thạch 9mm, lỗ 01 đĩa thạch Nhỏ vào lỗ thạch 30 l dung dịch cao chiết dâm bụt nồng độ 40mg/ml vào lỗ thạch vừa đục Đặt tủ ấm 370 24 Lặp lại 03 lần với loại cao thử đối chứng Chỉ tiêu đánh giá: Tiến hành đo đường kính vòng kháng vi khuẩn Staphyococcus aureus cao chiết thước độ xác đến mm 3.3 Phƣơng pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu Cao chiết ethanol pha với dung môi ethanol nồng độ 40mg/ml; Cho ống nghiệm ống 1ml dung dịch cao pha lỗng mơi trường LB để nồng độ dung dịch cao là: 20mg/ml; 10mg/ml; 5mg/ml; 2,5mg/ml; 1,25mg/ml Vi khuẩn cấy vào môi trường TSA, ủ đĩa thạch 24 37 C Dùng que cấy vơ trùng lấy khuẩn lạc hịa tan vào ml môi trường LB, trộn máy trộn Vortex Pha loãng dịch vi khuẩn để nồng độ 106 CFU /ml Hút 0.5 ml huyền dịch vi khuẩn nồng độ 106 vi khuẩn/ml cho vào ống nghiệm chứa dung dịch cao pha loãng lắc sau để 24h Dùng que cấy ria, cấy nồng độ đĩa thạch, để nhiệt độ phịng sau 30 phút cho khơ sau đảo ngược đĩa ủ ấm 370C 24 Quan sát khuẩn lạc nồng độ khác để đọc kết 3.4 Thử nghiệm kích ứng cao chiết chuột Lấy 20 mg mẫu thử vào ống eppendorf sạch, bôi trực tiếp lên vùng da làm lông (áp dụng số lượng 01 con) Chọn chuột có da khỏe mạnh lành lặn Khoảng 24 trước thử nghiệm, làm lông chuột vùng lưng gồm với kích thước 1,5 cm x 1,5 cm/ ô Mỗi mẫu thử thử 08 chuột Liều chất thử chuột 20 mg, chất đối chiếu gây kích ứng (KOH 5%) 100 μL Dùng cọ bôi lớp mỏng da chuột Sau đó, dùng nước cất làm mẫu thử chất đối chiếu lại Quan sát ghi điểm phản ứng vùng da bôi mẫu thử so với vùng da kế bên đặt nước cất (hoặc dung dịch KOH 5%) thời điểm giờ, 24 giờ, 48 72 sau làm nước cất Có thể kéo dài thời gian quan sát có tổn thương sâu để đánh giá đầy đủ khả hồi phục không hồi phục vết thương không nên 14 ngày Đánh giá phản ứng da mức độ gây ban đỏ, phù nề 3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên, lần lặp lại Các số liệu thu xử lý thống kê theo chương trình excell 2010 IV SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tách chiết thu nhận cao methanol cao ethanol Kết thu nhận cao methanol cao ethanol tóm tắt theo quy trình sau: Bột khơ (400g) 2L Ethanol 980, 72h Lọc, Cô quay 440 Cao Ethanol (37,8g) Sơ đồ Quy trình thu cao chiết từ dung mơi ethanol Bột khô (400g) L Methanol , 72h Lọc, Cô quay 440 Cao Methanol (37,5g) Sơ đồ Quy trình thu cao chiết từ dung mơi methanol Bảng Hàm lượng thu nhận cao từ dung môi ethanol methanol Dung môi Hàm lượng cao (g) Hiệu suất (%) Ethanol 37,8 9,45 Methanol 37,6 9,40 Hiệu suất thu nhận cao từ dung môi ethanol 980 9,45%; hiệu suất thu nhận cao từ dung môi methanol 980 9,40% Như dung môi ethanol dung môi methanol có chênh lệch khơng đáng kể đến hiệu suất cao dâm bụt Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hai loại cao methanol ethanol từ dâm bụt chủng Staphylococcuc aureus Thí nghiệm tiến hành dịch cao dâm bụt pha vào methanol ethanol nồng độ 40mg/ml, đối chứng ethanol methanol nguyên chất Bảng 1: Kết đƣờng kính vịng vơ khuẩn Mẫu Đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm) Kết TB đƣờng kính vịng vô khuẩn (mm) Lần Lần Lần Đối chứng Methanol 10,5 11,0 11,0 10,8 Cao Methanol 14,5 15,0 14,5 14,7 Đối chứng Etahnol 15,5 15,5 16,0 15,7 Cao Ethanol 20,5 21 21,5 21,0 Như cao chiết ethanol cao chiết methanol có khả kháng khuẩn điều giống với kết nghiên cứu tác giả Arullappan Từ kết bảng cho thấy trung bình đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết ethanol 21mm cao so với vịng vơ khuẩn dịch chiết methanol 14,7mm Tuy nhiên ethanol có khả kháng khuẩn cao so với methanol kích thước vịng vơ khuẩn dịch chiết ethanol cao dịch chiết methanol 10 Bảng 2: Kết thống kê đƣờng kính vịng vơ khuẩn dịch cao methanol ethanol Tên dịch chiết Trung bình đường Trung bình đường kính kính vơ khuẩn vơ khuẩn dịch cao dung dịch cao (mm) loại trừ khả kháng khuẩn dung môi (mm) Dịch chiết Ethanol 21,0 5,3 Dịch chiết Methanol 14,7 3,8 T-tính 19,0** 6,4 * **: Khác biệt có ý nghĩa (P