Sản xuất vi khuẩn bacilus subtilis và lactobacillus tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo chế phẩm phân bón lá

tên đề tài.txt c Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hai SV: Huỳnh Phương Thảo Lớp: 13DSH03 MSSV: 1311100669 Page Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân hướng dẫn TS Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh Những kết có đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp người khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đồ án TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực Huỳnh Phương Thảo Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án em nhận nhiều quan tâm giúp đỡ Thầy Cơ, gia đình bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gủi đến cô Nguyễn Thị Hai ln tận tình quan tâm hướng dẫn bảo em suốt trình học tập xây dựng đề cương hoàn thành đồ án Em xin chân thành cám ơn quý Thầy Cô khoa Công nghệ sinh học- Thực phẩm - Môi trường với tri thức tâm huyết để truyền đạt kiến thức quý báu cho chúng em suốt trình học tập Em xin gửi lời cám ơn đến gia đình ln chăm sóc,dạy dỗ hỗ trợ em bên cạnh làm chỗ dựa tinh thần cho em Em xin gửi lời cám ơn đến tất anh chị bạn bè thực đề tài phòng thí nghiệm ln quan tâm, giúp đỡ chia sẻ với em thực đồ án tốt nghiệp Cuối em xin gửi lời cám ơn đến quý Thầy Cô Hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Với điều kiện thời gian kinh nghiệm hạn chế sinh viên, đồ án khơng thể tránh thiếu sót Em mong nhận bảo, đóng góp ý kiến q Thầy Cơ để em có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức mình, nhằm phục vụ tốt công tác thực tế sau Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cơ Em xin chân thành cám ơn! TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực Huỳnh Phương Thảo Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài .1 Tình hình nghiên cứu 2.1 Tình hình nghiên cứu enzyme protease nước 2.2 Tình hình nghiên cứu enzyme protease ngồi nước 2.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis Lactobacillus tạo phân bón vi sinh 2.4 Tình hình chất thải thực phẩm thừa Mục đích nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu .8 4.1 - Phương pháp tổng hợp tài liệu 4.2 - Phương pháp thu thập xử lí số liệu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Kết đạt Ý nghĩa đề tài Kết cấu đồ án CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1.Tổng quan vi sinh vật dùng để phối trộn vào thức ăn thừa 10 1.1.1 Giới thiệu vi khuẩn Bacillus subtilis 10 1.1.2 Giới thiệu vi khuẩn Lactobacillus 15 1.2 Tổng quan enzyme 20 1.2.1 Enzyme protease 20 1.2.2 Enzyme amylase 24 1.2.3 Enzyme cellulase 28 1.3.Tổng quan phân bón 30 i Đồ án tốt nghiệp 1.3.1.Khái niệm 30 1.3.2 Phân loại 31 1.3.3 Thành phần dinh dưỡng 33 1.3.4 Ưu điểm phân bón hữu 33 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 334 2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 34 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 34 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 34 2.2 Vật liệu nghiên cứu 34 2.2.1 Nguồn vi sinh vật 34 2.2.2 Hóa chất môi trường 35 2.3.Thiết bị dụng cụ 36 2.3.1 Thiết bị 36 2.3.2 Dụng cụ 36 2.4.1 Bố trí thí nghiệm chung 37 2.4.2 Bố trí thí nghiệm chi tiết 38 2.5 Phương pháp nghiên c ứu 52 2.5.1 Phương pháp tăng sinh 52 2.5.2 Phương pháp pha loãng mẫu 52 2.5.3 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc 53 2.5.4 Phương pháp quan sát hình thái tế bào 54 2.5.5 Phương pháp bảo quản giữ giống vi sinh vật 55 2.5.6 Phương pháp đục lỗ thạch 56 2.5.7 Phương pháp nghiên cứu khả phân giải tinh bột, protein, cellulose 57 2.5.8 Phương pháp xử lí số liệu 58 2.5.9 Xác định mật độ tế bào VSV 58 2.5.10 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng chủng vi khuẩn tuyển chọn 59 2.5.11 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng chủng vi khuẩn 60 ii Đồ án tốt nghiệp 2.5.12 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn 61 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 63 3.1 Kết khảo sát khả thủy phân tinh bột sinh, cellulse protein chủng BM13 BDH 63 3.1.1 Kết khảo sát khả phân giải tinh bột chủng vi khuẩn BM BDH 65 3.1.2 Kết khảo sát khả phân giải protein chủng vi khuẩn BM BDH 65 3.1.3 Kết khảo sát khả thủy phân CMC chủng vi khuẩn BM BDH 67 3.2 Kết khẳng định lại đặc điểm hình thái chủng BDH4 63 3.2.1 Kết nhuộm Gram 70 3.2.2 Kết nhuộm bào tử 70 3.3 Kết khẳng định lại đặc điểm hình thái chủng L2 71 3.4 Kết khảo sát khả đối kháng chủng Bacillus subtilis BDH4 với Lactobacillus L2 73 3.5 Kết khảo sát khả sinh enzyme protease chủng Bacillus subtilis BDH4 với Lactobacillus L2 trộn chung với 74 3.6 Khảo sát điều kiện nuôi cấy để nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4 75 3.6.1 Thời gian nuôi cấy 75 3.6.2 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng chủng BDH4 77 3.7 Khảo sát điều kiện nuôi cấy để nhân sinh khối vi khuẩn Lactobacillus L2 78 3.7.1 Thời gian nuôi cấy 78 3.7.2 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng chủng vi khuẩn L2 80 3.8 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng khả sinh enzyme chủng BDH4 82 3.9 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng khả sinh enzyme chủng L2 827 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 92 iii Đồ án tốt nghiệp Kết luận 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 93 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 97 iv Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis (Theo Holt,1992) 13 Bảng 2.1 Danh sách chủng vi khuẩn BM BDH chọn để khảo sát 34 Bảng 3.1 Kết khảo sát khả thủy phân tinh bột sinh amylase chủng vi khuẩn BM BDH 63 Bảng 3.2 Kết khảo sát khả thủy phân protein sinh enzyme protease chủng vi khuẩn BM BDH 65 Bảng 3.3 Kết khảo sát khả thủy phân CMC sinh enzyme cellulase chủng vi khuẩn BM BDH 67 Bảng 3.4 Kết khảo sát thời gian nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4 75 Bảng 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng chủng BDH4 77 Bảng 3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng chủng vi khuẩn L2 78 Bảng 3.7 Khảo sát pH ban đầu môi trường đến sinh trưởng chủng vi khuẩn L2 80 Bảng 3.8 Kết khảo sát môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng khả sinh enzyme chủng BDH4 82 Bảng 3.9 Kết khảo sát môi trường nuôi cấy đến ST khả sinh enzyme chủng L2 87 v Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 11 Hình 1.2 Hình dạng tế bào số chủng vi khuẩn Lactobacillus 17 Hình 2.1 Sơ đồ tổng quan bố trí bước thí nghiệm 37 Hình 2.2 Sơ đồ quy làm chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM BDH 38 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình làm chủng Lactobacillus L2 40 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình khảo sát khả sinh enzyme protease chủng BM BDH 42 Hình 2.5 Sơ đồ quy trình khảo sát khả sinh enzyme amylase chủng BM BDH 44 Hình 2.6 Sơ đồ quy trình khảo sát khả sinh enzyme cellulase chủng vi khuẩn BM BDH 46 Hình 2.7 Khảo sát tính đối kháng hai chủng VSV tuyển chọn dùng để phối trộn vào thức ăn thừa 48 Hình 2.8 Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả sinh enzyme protease chủng Bacillus subtilis tuyển chọn 50 Hình 3.1 Vòng phân giải tinh bột chủng BM BDH 64 Hình 3.2 Kết khảo sát khả thủy phân tinh bột sinh enzyme amylase chủng vi khuẩn BM BDH 64 Hình 3.3 Khả thủy phân protein sinh enzyme protease cuả chủng BM BDH 65 Hình 3.4 Kết khảo sát khả thủy phân protein sinh enzyme protease 65 chủng vi khuẩn BM BDH 66 Hình 3.5 Vòng phân giải CMC chủng BM BDH sau 48 67 Hình 3.6 Vòng phân giải CMC chủng vi khuẩn BM BDH sau ngày nuôi cấy 68 Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng Bacillus subtilis BDH4 nhuộm Gram kính hiển vi x100 70 vi Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8 – Kết nhuộm bào tử chủng vi khuẩn BDH4 71 Hình 3.9 Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng s L2 nhuộm Gram kính hiển vi x100 72 Hình 3.10 Khả đối kháng chủng Bacillus subtilis BDH4 với Lactobacillus L2 73 Hình 3.11 Khả sinh enzyme protease trộn chủng vi khuẩn BDH4 L2 74 Hình 3.13 Ảnh hưởng pH ban đầu mơi trường nuôi cấy đến sinh trưởng chủng BDH4 sau 36 nuôi cấy 77 Hình 3.14 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng chủng vi khuẩn L2 79 Hình 3.16 Ảnh hưởng mơi trường ni cấy cho sinh trưởng khả sinh enzyme amylase chủng BDH4 83 Hình 3.17 Mơi trường ni cấy chủng Bacillus subtilis BDH4 83 Hình 3.18 Hình thái khuẩn lạc chủng BDH4 ni cấy loại môi trường … 84 Hình 3.19 Ảnh hưởng mơi trường ni cấy đến khả sinh enzyme amylase chủng vi khuẩn BDH4 85 Hình 3.20 Ảnh hưởng mơi trường nuôi cấy đến khả sinh enzyme protease chủng vi khuẩn BHD4 86 Hình 3.21 Ảnh hưởng môi trưởng nuôi cấy đến sinh trưởng khả sinh enzyme protease chủng L2 88 Hình 3.22 Mơi trường ni cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus L2 88 Hình 3.23 Hình thái khuẩn lạc chủng L2 nuôi cấy mơi trường 89 Hình 3.24 Kết khảo sát khả sinh amylase chủng L2 nuôi cấy loại môi trường 90 Hình 3.25 Kết khảo sát khả sinh protease chủng L2 nuôi cấy loại môi trường 90 vii Đồ án tốt nghiệp PH BAN DAU DEN SU SINH TRUONG CHUNG L2 SAU 48 GIỜ NUÔI CẤY The ANOVA Procedure Dependent Variable: MDTB Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 0.00222416 0.00044483 Error 12 0.00002993 0.00000249 Corrected Total 17 0.00225409 178.37 F 0.00222416 0.00044483 178.37 F Model 0.00179111 0.00044778 Error 10 0.00067635 0.00006763 Corrected Total 14 0.00246746 6.62 0.0072 R-Square Coeff Var Root MSE MDTB Mean 0.725894 0.749020 0.008224 26 1.097971 Đồ án tốt nghiệp Source DF Moitruong Anova SS Mean Square F Value Pr > F 0.00179111 0.00044778 6.62 0.0072 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHỦNG BDH4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for MDTB Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t 10 0.000068 3.16927 Least Significant Difference 0.0213 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N Moitruong 1.113894 MT3 A A 1.101932 MT4 A 27 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different t Grouping B A B A B A Mean N Moitruong 1.100074 MT2 1.093371 MT1 B B 1.080586 MTCB B.8 Kết khảo sát mơi trường nuối cấy thích đến tăng sinh khối chủng L2 sau 48 với pH MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHUNG L2 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Moitruong Levels Values HI LBS MRS MRT Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 28 Đồ án tốt nghiệp MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHUNG L2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: MDTB Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 0.00010859 0.00003620 Error 0.00001941 0.00000243 11 0.00012800 Corrected Total 14.92 0.0012 R-Square Coeff Var Root MSE MDTB Mean 0.848353 Source Moitruong DF 0.144633 0.001558 1.076966 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 0.00010859 0.00003620 29 14.92 0.0012 Đồ án tốt nghiệp MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHUNG L2 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for MDTB Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t 2.426E-6 3.35539 Least Significant Difference 0.0043 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N Moitruong 1.080479 MRT A A 1.079296 LBS B 1.074870 MRS B B 1.073220 HI 30 Đồ án tốt nghiệp B.8 Kha nang sinh enzyme amylase chủng BDH4 nuôi cấy loại môi trường khác KHẢ NĂNG SINH ENZYME AMYLASE CHUNG BDH4 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Moitruong MT1 MT2 MT3 MT4 MTCB Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 KHẢ NĂNG SINH ENZYME AMYLASE CHUNG BDH4 The ANOVA Procedure Dependent Variable: VPG Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 156.2333333 39.0583333 Error 10 7.0000000 0.7000000 Corrected Total 14 163.2333333 55.80 F 156.2333333 39.0583333 55.80 F Model 290.2666667 72.5666667 Error 10 60.6666667 6.0666667 Corrected Total 14 350.9333333 11.96 0.0008 R-Square Coeff Var Root MSE VPG Mean 0.827128 Source Moitruong DF 15.33025 2.463060 16.06667 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 290.2666667 72.5666667 34 11.96 0.0008 Đồ án tốt nghiệp ENZYME PROTEASE CHUNG BDH4 TRÊN LOẠI MÔI TRƯỜNG The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VPG Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 10 6.066667 Critical Value of t Least Significant Difference 3.16927 6.3737 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N Moitruong A 22.333 MT4 A A 20.333 MTCB B 13.333 MT1 B B 13.000 MT3 35 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N Moitruong B B 11.333 MT2 B.10 Khả nang sinh enzyme protease chủng L2 nuôi cấy loại môi trường khác ENZYME PROTEASE CHỦNG L2 TRÊN MOI TRUONG The ANOVA Procedure Class Level Information Class Moitruong Levels Values HI LBS MRS MRT Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 36 Đồ án tốt nghiệp ENZYME PROTEASE CHỦNG L2 TRÊN MOI TRUONG The ANOVA Procedure Dependent Variable: VPG Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 446.5625000 148.8541667 Error 176.6666667 11 623.2291667 Corrected Total 6.74 0.0140 22.0833333 R-Square Coeff Var Root MSE VPG Mean 0.716530 Source Moitruong DF 40.71588 4.699291 11.54167 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 446.5625000 148.8541667 37 6.74 0.0140 Đồ án tốt nghiệp ENZYME PROTEASE CHỦNG L2 TRÊN MOI TRUONG The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VPG Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 22.08333 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 8.848 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N Moitruong 19.833 MRT A B A 14.333 MRS C 8.333 HI B B C C 3.667 LBS 38 ... vi khuẩn để phân hủy thức ăn thừa, tạo phân bón dạng lỏng Xuất phát từ thực tế trên, nhóm sinh vi n tiến hành thực đề tài “ Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn Bacillus subtilis Lactobacillus tăng cường. .. lượng lớn thức ăn thừa thải bỏ từ nhà hàng, khách sạn dịch vụ ăn uống Vi c gia tăng lượng thức ăn thừa vấn nạn phạm vi toàn cầu (Syeda Azeem Unnisa, 2015) Ở Vi t Nam, lượng nhỏ thức ăn thừa thu... chủng vi khuẩn tuyển chọn Đồ án tốt nghiệp Xác đinh tỷ lệ phối trộn chủng vào thức ăn thừa để tạo phân bón dạng lỏng Đánh giá chất lượng phân bón tạo thành thơng qua vi c đánh giá có mặt vi khuẩn