Ứng dụng kĩ thuật ghép in vitro tạo cây cam bố hạ sạch bệnh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG ANH Tên đề tài: ỨNG DỤNG KĨ THUẬT GHÉP IN VITRO TẠO CÂY CAM BỐ HẠ (Citrus sinensis, Citrus Rutaceae) SẠCH BỆNH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Cơng nghệ sinh học Khóa học : 2013-2017 Khoa : CNSH-CNTP Thái Nguyên-2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG ANH Tên đề tài: ỨNG DỤNG KĨ THUẬT GHÉP IN VITRO TẠO CÂY CAM BỐ HẠ (Citrus sinensis, Citrus Rutaceae) SẠCH BỆNH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Cơng nghệ sinh học Khóa học: 2013-2017 Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Duy TS Nguyễn Tiến Dũng Thái Nguyên-2017 i LỜI CẢM ƠN Được đồng ý Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Em thực tập phòng thí nghiệm Khoa CNSH-CNTP Trường Đại học Nơng Lâm- Đại học Thái Nguyên với đề tài: “Ứng dụng kĩ thuật ghép in vitro tạo cam Bố Hạ bệnh” để hồn thành khóa luận ngồi nỗ lực thân em nhận nhiều giúp đỡ Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm- Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa CNSH-CNTP, thầy giáo tận tình giảng dạy cho em suốt năm học Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa CNSH-CNTP, thầy giáo tận tình giảng dạy cho em suốt năm học vừa qua để em hồn thành khóa luận Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng kính trọng, lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Duy TS Nguyễn Tiến Dũng người tận tình hướng dẫn em suốt trình thực đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè quan tâm, ủng hộ động viên em suốt q trình học tập nghiên cứu giúp em hồn thành tốt khóa luận Do điều kiện thời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi thiếu sót Kính mong thầy giáo bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2017 Sinh Viên Nguyễn Thị Phương Anh ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các lồi cam, qt có ý nghĩa thực tiễn sản xuất Bảng 2.2: Thành phần dinh dưỡng cam tươi (tính 100g) Bảng 2.3: Diện tích, suất, sản lượng cam, quýt giới 2010-2014 Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam số nước vùng châu Á năm 2014 Bảng 2.5: Tình hình sản xuất cam quýt giai đoạn 2010-2015 10 Bảng 2.6: Tình hình sản xuất cam, quýt vùng nước ta năm 2014 11 Bảng 3.1: Các trang thiết bị máy móc dùng thí nghiệm 31 Bảng 3.2: Thành phần môi trường MS (Murashige & Skoog) 33 Bảng 4.1: Ảnh hưởng chất khử trùng NaClO 5% đến hiệu vô trùng hạt (sau ngày nuôi cấy) 35 Bảng 4.2: Ảnh hưởng chất khử trùng HgCl2 0,1% đến hiệu vô trùng hạt (sau ngày nuôi cấy) 36 Bảng 4.3: Ảnh hưởng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng đến tỷ lệ sống cam sành Bố Hạ sau 20 ngày 37 Bảng 4.4: Ảnh hưởng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng đến tỷ lệ sống cam chanh Bố Hạ sau 20 ngày 38 Bảng 4.5: Ảnh hưởng kỹ thuật ghép chồi đỉnh đến tỷ lệ sống cam Sành Bố Hạ điều kiện in vitro sau 20 ngày 39 Bảng 4.6: Ảnh hưởng kỹ thuật ghép chồi đỉnh đến tỷ lệ sống cam chanh Bố Hạ điều kiện in vitro sau 20 ngày 39 Bảng 4.7: Ảnh hưởng điều kiện ghép chồi đỉnh đến tỷ lệ sống cam chanh Bố Hạ sau 20 ngày .40 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Đỉnh sinh trưởng (Thư Viện Học Liệu Mở Hà Nội ) 24 Hình 2.2: Cây vi ghép đỉnh sinh trưởng (Hao Wu cs, 2015) .24 Hình 2.3: Cây ghép chồi 25 Hình 4.1: Cây vi ghép đỉnh sinh trưởng cam chanh Bố Hạ gốc chấp 38 Hình 4.2: Cây ghép chồi đỉnh điều kiện in vitro 39 Hình 4.3: Cây ghép chồi đỉnh cam chanh Bố Hạ điều kiện tự nhiên 41 iv DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ (cả tiếng Anh tiếng Việt) ABA Acid Abscisic BAP 6-Benzylaminopurine B1 Thiamine B6 Pyridoxine CTV Citrus tristeza virus CEV Citrus exocortis virus CTLV Citrus tatter leaf virus Ctv Cộng tác viên DNA Deoxyribonucleic Acid DIECA Diethyl-dithocarabamate E Cách ghép hàm ếch F Fitted values (giá trị lý thuyết) FAO Food and Agriculture Organization FFTC FFTC: Food and fertilizer technology center IAA Indol-3-Acetic Acid IBA Indole-3-Butyric Acid M Cách ghép mặt cắt MS Mean square NAA Naphthalene Acetic Acid NN&PTNT Nông nghiệp Phát triển Nông thôn PVP Poly vinyl purro lidone VAC Vườn ao chuồng VACR Vườn ao chuồng ruộng 2,4D Dichloro phenoxy acitic acid v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG .ii DANH MỤC HÌNH .iii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể .2 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn .3 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu cam, quýt 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.3 Tình hình sản xuất cam, quýt giới Việt Nam 2.1.4 Đặc điểm hình thái cam 11 2.1.5 Yêu cầu sinh thái có múi 13 2.2 Các loại bệnh thường gặp môi giới truyền bệnh thuộc họ cam, quýt.15 2.2.1 Các loại bệnh thường gặp .15 2.2.2 Môi giới truyền bệnh thuộc họ cam, quýt 18 2.3 Các cách nhân giống cam .19 2.3.1 Nhân giống cổ điển .19 2.3.2 Nhân giống đại 23 2.4 Các nghiên cứu nước kỹ thuật vi ghép 28 2.4.1 Nghiên cứu nước 28 2.4.2 Nghiên cứu nước .29 vi Phần 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu .31 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 31 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 31 3.1.3 Trang thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 31 3.3 Phương pháp nghiên cứu 32 3.3.1 Phương pháp khử trùng hạt 32 3.3.2 Chuẩn bị gốc ghép mầm ghép 32 3.3.3 Chuẩn bị mắt ghép 32 3.3.4 Chuẩn bị môi trường để nuôi vi ghép .32 3.3.5 Theo dõi sinh trưởng vi ghép sau ghép 33 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .35 4.1 Ảnh hưởng chất khử trùng đến hiệu vô trùng mẫu nuôi cấy 35 4.2 Ảnh hưởng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng .37 4.3 Ảnh hưởng kỹ thuật ghép chồi đỉnh 38 4.4 Ảnh hưởng điều kiện ghép chồi đỉnh 39 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .41 5.1 Kết luận 41 5.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO i Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây ăn có múi (cam, quýt, chanh, bưởi, v.v.) nhóm ăn quan trọng sản xuất nơng nghiệp nước ta Theo Bộ NN & PTNN năm 2014 [3], diện tích ăn có múi Việt Nam đạt 75.600 Các loại có múi khơng hàng hóa đáp ứng cho tiêu thụ nội địa mà mặt hàng xuất có giá trị kinh tế cao Bên cạnh đó, ăn có múi có ý nghĩa loại cảnh trang trí gia đình Việt Nam độ xuân Đồng thời, sản phẩm loại vị thuốc quý dân gian, gia vị chủ lực số ăn tiếng Việt Nam Nghề trồng ăn có múi phát triển mạnh mẽ nhiều nước thuộc vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới ôn đới, mang lại giá trị kinh tế cao cho nơng nghiệp đóng góp phần không nhỏ vào việc phát triển kinh tế chung nước Trong Cam Bố Hạ trồng Bắc Giang, ngồi đặc điểm chung giống có múi, có đặc điểm vượt trội, mang đặc trưng riêng thương hiệu Cam Bố Hạ (Bắc Giang) như: to, mọng nước, mẫu mã đẹp, vị ngọt, thơm Trong 100g thịt tươi có chứa 612% đường, vitamin C từ 40-90 mg, acid hữu từ 0,4-1,2%, chất khoáng dầu thơm Chủ yếu dùng tươi, làm quà chữa số bệnh như: bệnh ho, bệnh sởi trẻ em Nhưng với thực trạng nay, suất chất lượng có múi có xu hướng giảm, nguyên nhân chủ yếu bắt nguồn từ bệnh Greening bệnh Tristeza Bệnh lan truyền với tốc độ nhanh gây hại nghiêm trọng cho nhiều vùng cam quýt giới Sản lượng bị giảm từ 30% đến 100% Ở Việt Nam bệnh Greening bệnh Tristeza ghi nhận gây hại ăn có múi từ năm 1960 Mức độ gây hại bưởi từ 17%-25% cam quýt từ 54%-70% Bệnh vàng Greening Tristeza bệnh hại quan trọng, nguy hiểm tàn phá nặng nề với nghề trồng ăn có múi giới… Đặc điểm nhận biết bệnh Tristeza khác tùy thuộc vào dòng virus gây như: dòng gây vàng con: gây lùn vàng nặng giống thuộc giống chanh Eureka, dòng gây sọc lõm gỗ thân bưởi: làm bị lùn, có dạng bụi thưa, nhỏ, tròn, vùng thân bị vàng, nhỏ, méo mó, vỏ dầy, gỗ thân cành có sọc lõm dài… Đặc trưng bệnh Greening có thời gian ủ bệnh dài, nên khó phát bệnh giai đoạn đầu thường nhầm lẫn với bệnh khác thiếu kẽm Đến biểu rõ ràng bệnh tàn phá nặng biện pháp chữa trị gần vô nghĩa lúc này, nhiều biện pháp thực không mang lại hiệu Hơn vi khuẩn, virus gây bệnh đến xuất chủng mới, có độc tính nặng Những nghiên cứu bước đầu bệnh Việt Nam tiến hành, song vấn đề chất bệnh chưa tìm hiểu cách đầy đủ Vì vậy, biện pháp phòng trừ bệnh hiệu Hiện cam Bố Hạ (Bắc Giang) bị mai suy thoái nghiêm trọng nhiều nguyên nhân như: bị bệnh hại nghiêm trọng nguyên nhân quan trọng chưa có biện pháp để trì giá trị cam, bảo vệ nguồn gene quý cam cần có chiến lược cụ thể nhằm bảo tồn, khai thác phục tráng lại nguồn gene quý Nhằm giải yêu cầu phòng chống bệnh vàng Greening, Tristeza để trì sản xuất ăn có múi bền vững cho vùng trồng cam quýt phía Bắc Việt Nam, việc tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật ghép in vitro tạo cam Bố Hạ bệnh” mang tính thời cấp thiết 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Ứng dụng kĩ thuật ghép in vitro để tạo cam Bố Hạ bệnh phục vụ cho sản xuất 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Ứng dụng kĩ thuật ghép chồi đỉnh tạo cam Bố Hạ bệnh - Ứng dụng kĩ thuật vi ghép tạo cam Bố Hạ bệnh 32 Nội dung 3: Nghiên cứu tạo cam Bố Hạ bệnh kỹ thuật ghép chồi đỉnh 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp khử trùng hạt Các loại hạt mua chuẩn bị sẵn trước làm thí nghiệm Hạt rửa nước, sau ngâm với dung dịch xà phòng lỗng từ 5-7 phút để loại bỏ phần bụi bẩn bên =>> rửa lại nước Tráng lại nước cất khử trùng Ngâm hạt dung dịch NaClO 5% HgCl2 1% 10 phút Tráng lại nước cất khử trùng Để khô giấy thấm Dùng pank dao tách phần vỏ cứng vỏ lụa Cắm hạt vào môi trường MS (Murashige&Skoog, 1962) Môi trường MS với 7g agar khơng có chất kích thích nảy mầm 3.3.2 Chuẩn bị gốc ghép mầm ghép Chuẩn bị gốc ghép gieo hạt môi trường MS: + Chuẩn bị Mơi trường MS + Bóc vỏ lụa hạt cam Ba Lá Chấp + Gieo hạt Cam Ba Lá hạt Chấp môi trường MS + Theo dõi đủ tiêu chuẩn cho trình ghép 3.3.3 Chuẩn bị mắt ghép Mắt ghét lấy trực tiếp từ cam sành cam chanh Bố Hạ Chỉ dùng mắt thức (mắt rõ), khơng lấy mắt ghép cành non (cành phải tháng tuổi trở lên) 3.3.4 Chuẩn bị môi trường để nuôi vi ghép Môi trường dùng để ươm hạt nảy mầm: + Môi trường MS với 7g agar khơng có chất kích thích nảy mầm + Môi trường dùng để nuôi sau ghép: môi trường MS với nồng độ đường cao 75 g/l kết hợp với chất kích thích rễ 0,5 mg/l + Môi trường chuẩn bị hấp khử trùng 121 oC, áp suất atm, 25 phút Thành phần môi trường MS (Murashige&Skoog, 1962): 33 Bảng 3.2: Thành phần môi trường MS (Murashige & Skoog) Thành phần Tên hóa chất Hàm lượng mg/l KNO3 1900 mg/l NH4NO3 1650 mg/l MgSO4.7H2O 370 mg/l CaCl2.2H2O 440 mg/l KH2PO4 170 mg/l FeSO4.7H2O 27,8 mg/l Na2EDTA 37,3 mg/l MnSO4.4H2O 22,3 mg/l KI 0,83 mg/l H3BO3 6,2 mg/l ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l Nicotinic acid 0,5 mg/l Pyridoxine-HCl 0,5 mg/l Thiamine-HCl 0,1 mg/l myo-Inositol 100 mg/l Amino acid Glycine mg/l Agar Agar 7g/l Đường Sucrose 75g/l Đa lượng Vi lượng Vitamin 3.3.5 Theo dõi sinh trưởng vi ghép sau ghép 3.3.5.1 Tỷ lệ sống vi ghép Cây vi ghép sống: vi ghép (chồi gốc ghép) xanh có mơ sẹo hình thành nơi vết cắt sau ngày vi ghép Tỷ lệ sống vi ghép (%)=(số vi ghép sống/tổng số vi ghép)*100 34 3.3.5.2 Số chồi bật mầm vi ghép Chồi hình thành: chồi bật lên từ chồi ghép ban đầu vi ghép sống (sau ngày vi ghép) Tỷ lệ chồi hình thành (%)=(số chồi hình thành/số vi ghép sống) 35 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ảnh hưởng chất khử trùng đến hiệu vô trùng mẫu nuôi cấy Bảng 4.1: Ảnh hưởng chất khử trùng NaClO 5% đến hiệu vô trùng hạt (sau ngày nuôi cấy) Mẫu Tổng số hạt Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ nảy mầm (%) Cam ba 90 12,3 77,7 Chấp 90 7,6 90,3 Cam Bố Hạ 90 10 75,3 CV% 1,9 2,1 LSD05 3,39 3,45 Dựa vào bảng 4.1 cho thấy hiệu khử trùng hạt NaClO 5% đến tỉ lệ nảy mầm hạt dao động từ 75,3 đến 90,3% sau ngày ni cấy Trong hạt chấp có tỷ lệ nảy mầm cao 90,3%, tỷ lệ nhiễm 7,6% Hạt cam ba cam Bố Hạ có tỷ lệ hạt nảy mầm 77,7 75,3% Xét tiêu tỷ lệ nảy mầm: Giá trị CV 2,1% ; LSD05 đạt 3,45 sai khác cơng thức có ý nghĩa mức độ tin cậy 95% Ngồi ra, q trình theo dõi thí nghiệm chúng tơi nhận thấy số hạt khơng có khả nảy mầm (hạt chết) sau ngày, tỷ lệ dao động từ 2,1 đến 14,7% Trong hạt cam Bố Hạ chiếm tỷ lệ cao (14,7%) Nguyên nhân nồng độ NaClO cao thời gian khử trùng lâu ảnh hưởng đến khả nảy mầm hạt Việc khử trùng mẫu trước đưa vào nuôi cấy vấn đề cần thiết, mẫu cấy tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng mức độ nhiễm loại mẫu khác đặc điểm loại mẫu khác nên cần có thử nghiệm khử trùng mẫu cấy nhằm thu lượng mẫu vơ trùng nhiều mà tốn nhiên liệu ban đầu 36 Khử trùng khâu định thành cơng ni cấy mơ in vitro Có nhiều loại hóa chất sử dụng để khử trùng Với hạt cam Bố Hạ, cam Ba hạt chấp cần nghiên cứu để đưa công thức khử trùng tốt để hạt nảy mầm tốt Tuy nhiên, nồng độ khử trùng thích hợp cho đối tượng khác hoàn toàn khác Phương pháp khử trùng thích hợp phải đảm bảo yêu cầu: Tỷ lệ hạt bị nhiễm thấp, tỷ lệ bị chết thấp nhất, mập sinh trưởng phát triển tốt NaClO 5% hóa chất có tính sát khuẩn cao nên tăng thời gian khử trùng tỷ lệ nhiễm giảm, thời gian khử trùng tốt 7-10 phút thời gian khử trùng lâu dung dịch xâm nhập vào bên gây độc với mẫu dẫn đến tỷ lệ chết cao Bảng 4.2: Ảnh hưởng chất khử trùng HgCl2 0,1% đến hiệu vô trùng hạt (sau ngày nuôi cấy) Mẫu Tổng số hạt Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ nảy mầm (%) Cam ba 90 5,6 72,6 Chấp 90 3,3 71 Cam Bố Hạ 90 6,7 80 CV% 3,3 LSD05 4,85 Chúng tiến hành nghiên cứu khử trùng hạt với HgCl2 nồng độ 0,1% thời gian 10 phút Kết khử trùng thống kê bảng 4.2 sau ngày nuôi cấy cho thấy hiệu khử trùng hạt HgCl2 0,1% dao động từ 71 đến 80%, tỷ lệ nhiễm từ 3,3 đến 6,7% Từ bảng 4.2 xét tiêu tỷ lệ nảy mầm hạt: Giá trị CV 3.3%, LSD05 đạt 4,85, cơng thức có sai khác có ý nghĩa mức độ tin cậy 95% So sánh hiệu khử trùng hạt cho thấy NaClO 5% cho tỷ lệ hạt vô trùng nảy mầm cao HgCl 0,1% Vì sử dụng NaClO 5% để khử trùng hạt cam 37 4.2 Ảnh hưởng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng Vi ghép kỹ thuật phối hợp ghép nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thông qua dinh dưỡng tự nhiên gốc ghép Mắt ghép đỉnh sinh trưởng Gốc ghép từ hạt đoạn chồi thu nhờ vi nhân giống Vi ghép kĩ thuật đòi hỏi xác, mắt ghép gốc ghép nhân lên ống nghiệm thực điều kiện vô trùng Các sau vi ghép hoàn toàn bệnh Để đánh giá phù hợp gốc ghép đến khả vi ghép đề tài lựa chọn gốc ghép chấp cam ba để tiến hành nghiên cứu kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng từ cam Bố Hạ nhằm tạo bệnh Kết thể bảng 4.3 4.4 Bảng 4.3: Ảnh hưởng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng đến tỷ lệ sống cam sành Bố Hạ sau 20 ngày Gốc ghép Tống số ghép Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) Chấp 15 36,3 63,7 Cam ba 15 13,6 86,4 CV% 8,3 LSD05 4,71 Dựa vào bảng 4.3 cho thấy gốc ghép chấp cho tỷ lệ sống cao (36,3%) so với sử dụng gốc ghép cam ba (13,6%) =>> tỷ lệ chết sử dụng gốc ghép chấp (63,7%) thấp so với gốc ghép cam ba (86,4%) Có thể đỉnh sinh trưởng cam sành Bố Hạ phù hợp với gốc ghép chấp Xét tiêu tỷ lệ sống: Giá trị CV 8,3; LSD05 đạt 4,71 cơng thức khác có sai khác có ý nghĩa mức độ tin cậy 95% 38 Bảng 4.4: Ảnh hưởng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng đến tỷ lệ sống cam chanh Bố Hạ sau 20 ngày Gốc ghép Tống số ghép Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) Chấp 15 20,6 79,4 Cam ba 15 26 74 CV% 7,6 LSD05 4,02 Dựa vào bảng 4.4 cho thấy gốc ghép cam ba cho tỷ lệ sống (26%) cao so với sử dụng gốc ghép chấp (20,6%) =>>tỷ lệ chết sử dụng gốc ghép cam ba (74%) thấp so với gốc ghép chấp (79,4%) Xét tiêu tỷ lệ sống: Giá trị CV 7,6%; LSD05 đạt 4,02 công thức có sai khác có ý nghĩa mức độ tin cậy 95% A B Hình 4.1: Cây vi ghép đỉnh sinh trưởng cam chanh Bố Hạ gốc chấp A: Gốc ghép chấp B: Cây vi ghép đỉnh sinh trưởng hoàn chỉnh 4.3 Ảnh hưởng kỹ thuật ghép chồi đỉnh Ghép chồi kỹ thuật tạo bệnh sử dụng thành cơng nhiều phòng thí nghiệm Murashige cs (1972) [36] nguời tạo Citrus bệnh kỹ thuật ghép chồi đỉnh in vitro Sau đó, Navarro (1972) [39] sử dụng kỹ thuật nhiều Citrus khác thu kết khả quan Hiện phương pháp ghép chồi đỉnh sử dụng rộng rãi để tạo dòng Citrus bệnh phục vụ cho nhân giống thương mại 39 Bảng 4.5: Ảnh hưởng kỹ thuật ghép chồi đỉnh đến tỷ lệ sống cam Sành Bố Hạ điều kiện in vitro sau 20 ngày Gốc ghép Tống số ghép Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) Chấp 30 100 Cam ba 30 100 Bảng 4.6: Ảnh hưởng kỹ thuật ghép chồi đỉnh đến tỷ lệ sống cam chanh Bố Hạ điều kiện in vitro sau 20 ngày Gốc ghép Tống số ghép Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) Chấp 15 100 Cam ba 15 100 00 Theo kết bảng 4.5 4.6 sau 20 ngày ghép chồi đỉnh đểu sống phát triển bình thưởng gốc ghép chấp cam ba =>> Gốc ghép không ảnh hưởng đến tỉ lệ sống ghép chồi đỉnh điều kiện in vitro Hình 4.2: Cây ghép chồi đỉnh điều kiện in vitro 4.4 Ảnh hưởng điều kiện ghép chồi đỉnh Bảng 4.7: Ảnh hưởng điều kiện ghép chồi đỉnh đến tỷ lệ sống cam chanh Bố Hạ sau 20 ngày Môi trường in vitro Điều kiện tự nhiên Gốc ghép Tống số ghép Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) Tống số ghép Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) Chấp 15 100 15 96,7 3,3 Cam ba 15 100 15 90 10 40 Theo kết bảng 4.7 điều kiện tự nhiên ghép chồi đỉnh có tỉ lệ chết ẩm độ thấp chồi đỉnh nước dẫn đến héo ,cây chết Trong tỷ lệ sống ghép chồi đỉnh in vitro 100% Tuy nhiên so sánh khả sinh trưởng ghép cho thấy chồi ghép trực tiếp gốc ghép trồng bầu đất có khả sinh trưởng tốt nhiều so với gốc ghép in vitro Điều giải thích sức sống gốc ghép điều kiện tự nhiên tốt hơn, khỏe Vì ưu để lựa chọn phương pháp tạo ghép bệnh A B Hình 4.3: Cây ghép chồi đỉnh cam chanh Bố Hạ điều kiện tự nhiên A: Gốc ghép cam ba B: Cây ghép chồi đỉnh hoàn chỉnh 41 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Kết nghiên cứu đề tài cho thấy: - Chất khử trùng NaClO sử dụng để vơ trùng hạt cam cho nuôi cấy in vitro Hiệu vô trùng cao nồng độ 5%, thời gian khử trùng 10 phút: chấp 90,3%, cam ba 77,7% cam Bố Hạ 75,3 - Có thể sử dụng cam ba chấp để làm gốc ghép cho cam Bố Hạ phương pháp vi ghép đỉnh sinh trưởng ghép chồi đỉnh - Ghép chồi đỉnh điều kiện in vitro cho tỷ lệ sống cao, nhiên sử dụng phương pháp ghép trực tiếp gốc ghép điều kiện tự nhiên giúp sinh trưởng khỏe hơn, nhanh 5.2 Kiến nghị Để xây dựng phương pháp hiệu đề tài cần nghiên cứu thêm: - Ảnh hưởng tuổi gốc ghép tuổi mầm ghép - Đánh giá khả sinh trưởng ghép giai đoạn vườn ươm - Đánh giá mức độ bệnh ghép TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng việt Lê Trần Bình (1993), Ứng dụng kỹ thuật vi ghép nhân giống cam chanh, NXB Nông nghiệp Huế, 125-129 Bộ Y tế Viện dinh dưỡng (2007), Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam, NXB Y học, 210 Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nơng Thơn (2015), Tổng diện tích ăn phân theo địa phương, Số liệu trồng trọt Vũ Mạnh Chinh (2002), Rệp hại trồng biện pháp phòng trừ, NXB Nơng nghiệp Tp HCM, 68 Phạm Thị Chữ (1996), “Tuyển chọn, nhân giống bưởi Phúc Trạch suất cao, phẩm chất tốt phục vụ xuất nội tiêu”, Tạp chí Khoa học cơng nghệ quản lý kinh tế, 228-229 Đường Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bưởi kỹ thuật trồng, NXB Lao động-Xã hội Bùi Huy Đáp (1960), Cây ăn nhiệt đới, NXB Nông thôn Nguyễn Hữu Đống (2003), Cây ăn có múi (cam, chanh, quýt, bưởi NXB Nghệ An Vũ Công Hậu (1996), Trồng ăn Việt Nam, NXB Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh 10 Vũ Công Hậu (1996), Trồng bưởi, NXB Nông nghiệp Tp HCM 11 Vũ Cơng Hậu (2002), Phòng trừ sâu bệnh hại họ cam quýt, NXB Nông nghiệp Tp HCM 12 Lê Thị Thu Hồng, Hà Minh Trung (1996), Tổng kết nhận xét kỹ thuật sản xuất giống có múi huyện Châu Thành, Tiền Giang, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 180-186 13 Lê Mai Nhất (2014), Nghiên cứu bệnh vàng Greening hại ăn có múi số tỉnh phía bắc Việt Nam đề xuất biện pháp phòng chống, Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 20-50 14 Niên giám thống kê (2015) 15 Nguyễn Thị Minh Phương (2007), Cây ăn đặc sản kỹ thuật trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 15-25 16 Hồng Ngọc Thuận (2000), Nhân giống vơ tính ăn chiết, ghép, giâm cành, tách chồi nuôi cấy in vitro), NXB Nông nghiệp Huế, 3-97 17 Hồng Ngọc Thuận, Cục khuyến nơng khuyến lâm, Dự án tăng cường khả tư vấn cấp (2003), Chiết, ghép, giâm, tách chồi ăn quả, NXB Nông nghiệp Huế, 23-64 18 Phan Ngưỡng Tinh, Hà Quán Võ, Đường Tự Pháp, Vương Trường Xuân, Trần Văn Thành, Trương Khắc Bình Cơng Điều Chí, Bộ Nơng nghiệp phát triển nông thôn (2001), Kỹ thuật ghép ăn quả, NXB Nông nghiệp Huế 19 Hà Minh Trung (2006), Hồn thiện cơng nghệ sản xuất có múi đặc sản (cam, quýt, bưởi) bệnh Greening bệnh virus khác tỉnh phía Bắc, NXB Nơng nghiệp 20 Trần Thế Tục (1967), Điều tra ăn quả, NXB Nông thôn 21 Đào Thanh Vân, Trần Như Ý, Nguyễn Thế Huấn (2000), Giáo trình ăn quả, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 22 Đỗ Năng Vịnh (2008), Cây ăn có múi-Cơng nghệ sinh học chọn tạo giống, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 23 Nguyễn Văn Uyển Đoàn Thị Ái Thuyền (1999), Những thành tựu công nghệ tế bào thực vật Việt Nam (Achievements of Plant Cell Biotechnology in VietNam), Cây cam quýt (Citrus ssp.), Công nghệ tế bào thực vật, (Trần Văn Minh), NXB Nông nghiệp Huế, 625-629 II Tiếng Anh 24 Aubert.B, Garnier.M, Cassin.J.C, Bertin.Y (1988), “Citrus greening disease survey in East and West African countries South of Sahara”, Proceeding of 10th conference of IOCV, IOCV, Riverside, 231-237 25 Ahmet ONAY, Vedat PIRINC, Filiz ADIYAMAN, Cigdem ISIKALAN, Engin TILKAT, Davut BASARAN (2002), In Vivo and in Vitro Micrografting of Pistachio, Pistacia veraL cv “Siirt”, Department of Biology, Faculty of Science and Literature, University Dicle, Diyarbakir-TURKEY Turl J Biol 27(2003) 95-100 26 Begum F., M.N Amin, S Islam, M.A.K Azad and M.M Rehman (2003), “In vitro Plant Regeneration from Cotyledon-derived Callus of Three Varieties”, Journal of Biological Science, 3(8), 751-759 27 Bowman K.D (1998), “Performance of ‘Fallglo’ on ten rootstocks in Lake County” Proc Fla State Hort Soc., 111, 177–180 28 Chaturvedi HC, Singh SK, Sharma AK Agnihotri S (2005), “Citrus tissue culture employing vegetative explants” Plant Cell Rep, 24 (2), 112-119 29 Davies, and F S (1986), “The navel orange Rep., J Janick (ed.) AVI Press, Westport, Conn.”, In: Hort Reviews, 300-330 30 Endriss, M.H and D.W Burger (1984), “Micrografting shoot-tip culture of citrus on three trifoliate rootstocks”, Scentia Hort 23, 255-259 31 Emmarold E Mneney & Sinclair H Mantell, 2001, “In vitro micrografting ofcashew.Department of agriculture and Horticulture,Wye College, University of London, Wye, Ashfor, TN25 5AH, UK”, Plant celltissure and culture, 66, 49-58 32 FASTAT/FAO Statistics (2016), Agricultural data 33 Hung.T.H, Hung.S.C, Chen.S.N, Hsu.M.H and Su.H.J (2004), “Detection by PCR of Candidatus Liberibacter asiaticus, the bacterium causing citrus of huanglongbin in vector psyllids: application to the study of vector-pathogen relationships”, Plant pathology., 53, 96-102 34 Huang, S and D.F Millikan (1980), “In vitro micrografting of apple shoot tips”, HortScience, 15, 741-743 35 Jonard R., J Hugard J Macheix, J Martinez, L Mosella-Chancel, J.L Poessel and P Villemur (1983), “In vitro micrografting and its applications to fruit science” Scientia Hort., 20, 147-159 36 Murashige, T., W.P Bitters, E.M Naver, C.N Roistacher, ADN P.B Holiday (1972), “A technique of shoot tip grafting and its utilization towards recovering virus-free citrus clones”, Hort Science, 7, 118-119 37 Morel G.M.; Martin C (1952), “Guerison de dahlias atteints d'une maladle A virus”, Comptes rendus hebdomaire des s~ances de l'Academie des Sciences, Paris, 235, 1324-1325 38 Nagai and Tanigawa K O (1928), “On Citrus pollination”, Procthird, Pan pacific.Sci.Cong, 2, 2023-2029 39 Navarro L., R.C.N., Murashigue T (1972), "Improvement of shoot tip grafting in vitro for virus-free citrus", J American Soc Hort Sci, 471-479 40 Navarro L., E.L Civerolo, J Juarez, and S.M Garnsey (1991), “Improving therapy methods for citrus germplasm exchange”, Proc 11th Conf Intl Orgination Citrus Virologist, 400-408 41 Navarro L and J Juarez (1991), “Tissue culture techniques used in Spain to recover virus-free citrus plants” Acta Hort., 78, 425- 435 42 Presley.D (1993), “Diseases of fruit crops’’, Dept of primary Industries, Queensdland, 190-220 43 Pummelo (Citrus grandis Osb.) (2003), “Department of Botany, University of Rajshahi, Rajshahi-6205, Bangladesh”, Online Journal of Biological Sciences, 3(8), 751-759 44 Reuther W (1973), Climate and citrus behaviour in the citrus industry, 3, University of California 45 Reuther Walter (1978), The citrus industry, 1, Puplication of University of California, USD 46 Starrantino A micropropagation, A Caruso International (2003), Society In Of vitro culture Citriculture: for citrus Proceedings, University of California, Riverside 47 Su H.J and J Y Chu (1984), “Modified technique of citrus shoot-tip grafting and rapid propagation method to obain citrus budwoods free of citrus viruses and likubin organism”, In: Proceedings of International So ciety for Citriculture, 2, 332-334 48 Wakana A Kira (1998), The citrus production in the worl, Tokyo, Janpan III Tài liệu Internet 49 https://dl.sciencesocieties.org/publications/cs/abstracts/55/6/2786?access=0&vie w=article 50 http://www fftc.agnet.org/library.htm 51 https://voer.edu.vn/m/mo-phan-sinh/569e0968 ... Ứng dụng kĩ thuật ghép in vitro để tạo cam Bố Hạ bệnh phục vụ cho sản xuất 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Ứng dụng kĩ thuật ghép chồi đỉnh tạo cam Bố Hạ bệnh - Ứng dụng kĩ thuật vi ghép tạo cam Bố Hạ. .. ANH Tên đề tài: ỨNG DỤNG KĨ THUẬT GHÉP IN VITRO TẠO CÂY CAM BỐ HẠ (Citrus sinensis, Citrus Rutaceae) SẠCH BỆNH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Cơng nghệ sinh học Khóa học:... 2.3: Cây ghép chồi 25 Hình 4.1: Cây vi ghép đỉnh sinh trưởng cam chanh Bố Hạ gốc chấp 38 Hình 4.2: Cây ghép chồi đỉnh điều kiện in vitro 39 Hình 4.3: Cây ghép chồi đỉnh cam chanh