Nghiên cứu nuôi cấy rễ thứ cấp sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv ) và khảo sát ảnh hưởng của một số elicitor lên sự tích lũy saponin (tt)

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - NGUYỄN THỊ NHẬT LINH NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SỰ TÍCH LŨY SAPONIN TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH LÝ HỌC THỰC VẬT HUẾ - NĂM 2017 Cơng trình hồn thành tại: VIỆN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TÂY NGUYÊN Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Dương Tấn Nhựt GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế họp tại: Vào hồi ngày tháng .năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: ĐẶT VẤN ĐỀ Vietnamese ginseng, sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), loài sâm đặc hữu Việt Nam, chứa nhiều dược chất saponin so với loài sâm quý khác giới Ngoài 26 hợp chất tương tự sâm Mỹ sâm Triều Tiên, sâm Ngọc Linh phát 20 loại saponin khác Những saponin quý có tác dụng bồi bổ sức khỏe, tăng cường sinh lực, điều hòa huyết áp, chống oxy hóa, điều trị bệnh ung thư, gan, thận tiểu đường, Tuy nhiên, loài sâm quý có giá trị kinh tế cao nằm danh mục sách đỏ cần bảo tồn Hơn nữa, để sử dụng hợp chất từ sâm Ngọc Linh vào sản xuất dược phẩm gặp nhiều khó khăn thiếu nguồn ngun liệu Ni cấy rễ sâm in vitro có tiềm thu sinh khối lớn thời gian ngắn Rễ sâm Ngọc Linh in vitro tăng trưởng tốt có mơi trường điều kiện ni cấy thích hợp Tuy nhiên, ngồi việc gia tăng sinh khối rễ, tích lũy dược chất saponin đóng vai trị quan trọng Sinh khối rễ sâm Ngọc Linh lớn làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng, chí để sản xuất thuốc, có hàm lượng saponin cao Nhưng thực tế, rế sâm in vitro có hàm lượng saponin thấp nhiều so với rễ thu ngồi tự nhiên Với lợi ích to lớn elicitor việc tăng cường tích lũy saponin nuôi cấy mô sẹo sâm Ngọc Linh, nghiên cứu ứng dụng elicitor vào nuôi cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh cần thiết Chính thế, Đề tài “Nghiên cứu nuôi cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) khảo sát ảnh hưởng số elicitor lên tích lũy saponin.” thực để cải thiện hình thành rễ thứ cấp (RTC) từ ni cấy rễ bất định (RBĐ) in vitro tối ưu môi trường điều kiện ni cấy, cịn tăng cường hàm lượng saponin (MR2, Rb1 Rg1) sâm Ngọc Linh nhờ tác dụng elicitor Mục tiêu luận án Xác định điều kiện nuôi cấy mơi trường thích hợp để RBĐ sâm Ngọc Linh phát triển hình thành nhiều RTC, từ đó, có nguồn sinh khối lớn ổn định để nhân nhanh sinh khối rễ sâm Ngọc Linh hệ thống lớn Bioreactor Xác đinh loại, nồng độ elicitor khác lên trình sản xuất ba saponin (MR2, Rg1 Rb1) quan trọng có RTC sâm Ngọc Linh in vitro thơng qua loại elicitor (SA, JA, ABA, CHN YE) có phịng thí nghiệm Sau đó, tiến hành kết hợp elicitor có nguồn gốc khác để nâng cao hiệu sản xuất saponin, đồng thời tìm thời điểm thích hợp để bổ sung elicitor vào nuôi cấy RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu cung cấp dẫn liệu khoa học có giá trị nghiên cứu phát sinh hình thái rễ, nhân nhanh sinh khối tăng cường tích lũy hợp chất saponin nuôi cấy RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro Đồng thời, tài liệu tham khảo hữu ích cho việc nghiên cứu giảng dạy lĩnh vực chuyển hóa thứ cấp, sinh lý thực vật nuôi cấy mô thực vật Ý nghĩa thực tiễn: Luận án thiết lập môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy hệ thống nuôi cấy tối ưu cho RBĐ sâm Ngọc Linh tăng sinh tạo nhiều RTC thời gian ngắn Đồng thời, nâng cao hàm lượng saponin nội sinh (MR2, Rg1 Rb1) Kết ứng dụng vào sản xuất sâm Ngọc Linh quy mô lớn nhằm giải vấn đề khan nguồn nguyên liệu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU GIỚI THIỆU VỀ SÂM NGỌC LINH Cây sâm Ngọc Linh loài sâm đặc hữu Việt Nam, có vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum Quảng Nam Hiện nay, sâm Ngọc Linh giới biết đến hợp chất saponin loài sâm vượt trội so với số loài sâm tiếng khác sâm Triều Tiên sâm Mỹ 1.1 Nguồn gốc lịch sử phát triển 1.2 Đặc điểm hình thái sinh trưởng 1.3 Đặc điểm phân bố 1.4 Đặc điểm đa dạng di truyền 1.5 Tác dụng dược lý HỢP CHẤT SAPONIN CỦA SÂM NGỌC LINH Saponin hay saponoside hợp chất glycoside tự nhiên có hoạt tính bề mặt Đây nhóm đa dạng terpenoid đặc trưng cấu trúc khác Saponin cấu tạo từ aglycon steroid triterpenoid với nhiều chuỗi đường Những kết nghiên cứu phân lập thành phần hóa học công bố cho thấy hợp chất saponin sâm Ngọc Linh có 60 loại, mà nhóm chất quan trọng loài sâm triterpene saponin với đại diện MR2, Rb1 Rg1 nằm nhóm dammaran Triterpene saponin có cấu trúc phức tạp nên tổng hợp hóa học khơng có khả cạnh tranh kinh tế sản xuất quy mô lớn mà nguồn sâm lại vơ NI CẤY TẠO RỄ THỨ CẤP TỪ RỄ BẤT ĐỊNH Rễ bất định (RBĐ) rễ có nguồn gốc nội sinh, phát sinh từ nhiều quan khác thực vật (như lá, hoa, cuống lá) phản biệt hóa tế bào nhu mơ nằm xung quanh hệ thống mô mạch tác động auxin Rễ thứ cấp (RTC) hình thành từ vùng ngoại vi trụ bì trưởng thành khoảng cách khác từ mô phân sinh đỉnh rễ Sơ khởi RTC phát triển thông qua chương trình phân chia tế bào đặc trưng để tạo cấu trúc y khuôn mẫu rễ Một số yếu tố ảnh hưởng đến ni cấy rễ thứ cấp rễ bất định: Loại mẫu cấy, vị trí phát sinh, vai trị điều hịa auxin, tương tác auxin cytokinin, nhiệt độ, ánh sáng, giá thể ni cấy Các nghiên cưu ngồi nước vể ni cấy rễ ELICITOR VÀ SỰ KÍCH KHÁNG Elicitor (elicitor thực vật) định nghĩa chất mà đưa với nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống khởi động q trình phịng vệ thực vật, dẫn đến sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp Kích kháng việc gây kích thích hay tăng cường trình sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp diện elicitor môi trường ni cấy Elicitor phân loại dựa vào chất dựa nguồn gốc Cho đến nay, nghiên cứu ứng dụng elicitor vào nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh nhằm nâng cao hàm lượng saponin hạn chế Dương Tấn Nhựt cs (2012) bước đầu nghiên cứu đánh giá tác động MeJA lên việc tích lũy saponin mơ sẹo sâm Ngọc Linh cho thấy hiệu elicitor việc tăng cường saponin lên đáng kể Trịnh Thị Hương (2017) bước đầu nghiên cứu tác động MeJA, SA ABA nhằm tăng cường hợp chất saponin nuôi cấy rễ tơ sâm Ngọc Linh CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Nguồn mẫu Mẫu rễ bất định (RBĐ) 30 ngày tuổi tách từ cụm RBĐ nuôi cấy môi trường SH bổ sung mg/L IBA có Phịng Sinh học Phân tử Chọn tạo Giống trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 2.1 Tối ưu cách chọn mẫu môi trường nuôi cấy RTC từ nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh in vitro 2.1.1 Khảo sát ảnh hưởng cách cắt mẫu rễ bất định lên hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh 2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng auxin lên hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng việc kết hợp auxin cytokinin lên hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh 2.1.4 Khảo sát ảnh hưởng môi trường khống lên hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh 2.1.5 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ NH4+/NO3- mơi trường MS lên hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh 2.1.6 Khảo sát ảnh hưởng loại đường carbohydrate lên hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh 2.1.7 Khảo sát ảnh hưởng giá thể nuôi cấy lên hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh 2.2 Tối ưu điều kiện nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh để tăng cường hình thành RTC tích lũy saponin ni cấy in vitro 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ni cấy lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng pH lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng giai đoạn nuôi cấy tối sáng lên tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh 2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng thể tích ni cấy lên tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng hệ thống nuôi cấy lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh 2.3 Tối ưu khả tích lũy saponin RTC hình thành từ rễ bất định sâm Ngọc Linh nhờ tác động elicitor 2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng chitosan lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng dịch chiết nấm men lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh 2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng abscisic acid lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh 2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng salicylic acid lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh 2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng jasmonic acid lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh 2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp elicitor ngoại sinh elicitor nội sinh lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh in vitro 2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng thời gian xử lý elicitor lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 2.4 Phương pháp xác định số tăng trưởng, tỷ lệ chất khơ, tỷ lệ hình thành tăng sinh mẫu cấy 2.5 Môi trường nuôi cấy Mơi trường dinh dưỡng khống MS, SH B5 có bổ sung 30 g/L đường sucrose, g/L agar, pH = 5,8 thay đổi tùy vào thí nghiệm 2.6 Điều kiện ni cấy Các thí nghiệm tiến hành nhiệt độ 25±2C (trừ thí nghiệm khảo sát nhiệt độ ni cấy), độ ẩm trung bình 50-60%, tất thí nghiệm đặt điều kiện tối hồn tồn (trừ thí nghiệm khảo sát thời gian chiếu sáng), thí nghiệm ngồi sáng để ánh sáng đèn huỳnh quang có cường độ chiếu sáng khoảng 40-45 µmol.m-2.s-1 với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày Nuôi cấy lỏng máy lắc Innova 2100 plantform shaker (Hermle, Đức) với tốc độ 100 vòng/phút PHƯƠNG PHÁP SINH HĨA ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN 3.1 Phương pháp định tính sắc ký lớp mỏng 3.2 Phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao 3.3 Phương pháp xác định suất tổng hợp saponin PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT TẾ BÀO HỌC PHƯƠNG PHÁP THỐNG KÊ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TỐI ƯU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH TỪ NHỮNG MẪU RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO 1.1 Tối ưu cách chọn mẫu môi trường nuôi cấy RTC sâm Ngọc Linh 1.1.1 Ảnh hưởng cách cắt mẫu rễ bất định lên hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh Kết nghiên cứu ảnh hưởng nguồn RBĐ (RBĐ) lên hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro thể Bảng 3.1, cho thấy nguồn RBĐ từ mẫu cuống lá, kích thước cm, khơng tách hết mẫu cấy thích hợp cho RTC sâm Ngọc Linh in vitro hình thành tăng trưởng Bảng 3.1 Ảnh hưởng cách cắt mẫu RBĐ lên khả hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro Tỷ lệ tạo Chiều dài Số KLT RTC RTC RTC (mg) (%) (cm) e h f 31,67 * 0,33 0,37 29,33g C1 d efg f 46,67 2,00 0,83 39,67f Từ b ef e Lá 82,33 2,33 2,00 65,00c C2 c bc b a 7,33 3,33 73,00 93,33 d fgh e 46,00 1,33 1,67 30,33g C1 Từ cd b a 53,67 10,00 5,23 49,67e cuống b e cd 79,00 3,00 3,13 57,67d C2 94,33a 13,67a 5,60a 78,00a d gh f 48,33 0,67 0,67 42,33f C1 c d b 60,00 6,00 4,03 51,00e Từ thân củ 75,00b 8,33c 2,33de 56,33d C2 83,33b 13,33a 5,00a 71,33b *Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan KLT: Khối lượng tươi, TM: Cách cắt mẫu, C1: mẫu cắt ngang RBĐ để bỏ phần mẫu tái sinh, C2: mẫu cắt phần mẫu tái sinh, KT: Chiều dài mẫu cắt Mẫu RBĐ TM KT (cm) 11 Số rễ chiều dài rễ (cm) 20 15 c Chiều dài rễ (cm) a a b bc 400 b c 300 d c e 200 d f 10 c c b e a a 100 d 0 1/2 MS 1/2 SH 3/4 MS 3/4 SH MS MSCB Môi trường nuôi cấy Biểu đồ 3.1 Khối lượng tươi (mg) Số rễ/mẫu a b 25 SH So sánh môi trường cải biên có tỷ lệ NH4+/NO3- tốt so với mơi trường nuôi cấy khác Các chữ khác (a, b, c ) cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan 1.1.6 Ảnh hưởng loại đường carbohydrate lên hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh Bảng 3.6 Ảnh hưởng loại đường carbohydrate lên hình thành tăng trưởng RTC từ RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro Tỷ lệ chất Đặc điểm rễ khô (%) 51,67e* 3,33hi 6,42d trong, nhũn, không phát triển 160,33d 15,00gh 9,82bc trắng, dài, phân nhánh 10 206,67d 18,33g 8,89bcd trắng, dài, phân nhánh 30 D379,33c 41,57e 10,96ab trắng, dài, mập, nhánh 40 Glucose 577,67b 51,93bcd 8,99bcd trắng, dài, mập, nhiều nhánh 50 523,00b 67,40a 13,03a trắng, dài, mập, nhiều nhánh 60 374,33c 29,33f 8,85bcd trắng đục, trịn đều, mập, nhánh 10 dài, trắng đục, mập, nhiều nhánh 30 641,33a 55,33bc 8,64bcd 572,33b 56,00b 9,79ab dài, trắng đục, mập, nhiều nhánh Sucrose 40 533,33b 47,83cde 9,16bcd dài, trắng đục, mập, nhiều nhánh 50 526,67b 46,33de 7,80cd dài, vàng, mập, nhiều nhánh 60 91,67e 9,00hi 8,22bcd vàng, phân nhánh kéo dài 10 182,67d 15,33gh 9,54bc vàng, phân nhánh 30 181,67d 17,33f 9,76bc vàng, phân nhánh Maltose 40 102,73e 7,67hi 7,37cd vàng, mọng nước, phân nhánh 50 62,53e 4,33hi 6,94cd vàng, không phân nhánh 60 *Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan Loại đường (g/L) KLT (mg) KLK (mg) 12 1.1.7 Ảnh hưởng giá thể nuôi cấy lên hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh Bảng 3.7 Ảnh hưởng giá thể nuôi cấy lên khả hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro Tỷ lệ Số lượng Chiều tạo Giá thể rễ dài rễ RTC (rễ/mẫu) (cm) (%) Agar 100,00a 48,45a* 2,70a a b Gelrite 100,00 13,83 0,94b Bông gòn 93,34b 8,80c 0,68b KLT (mg) KLK (mg) 121,40a 121,03a 77,20b 12,47a 13,23a 8,27b *Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô 1.2 Tối ưu điều kiện nuôi cấy RTC từ nuôi cấy RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro 1.2.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro 300 277,7a R² = 0.9508 b 230 250 203,3b 200 148,7c 150 88d 100 58a 50 0,63e 11e 28,3d 0e 5,3d 38c 13,3c 27,8a 56,3ab 17,7b 54,3b 16,3b 14 28 42 56 70 Thời gian nuôi cấy (ngày) Khối lượng khô (mg) Khối lượng tươi (mg) 84 Số lượng rễ thứ cấp/mẫu Hướng phát triển rễ thứ cấp Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến khả hình thành tăng trưởng RTC từ nuôi cấy RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro 13 1.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro Bảng 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tăng trưởng RTC từ RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro Nhiệt độ (°C) 22 25 28 Tỷ lệ tạo RTC (%) 100a* 100a 100a Số RTC (rễ/mẫu) 41,67a 23,67b 18,00c Chiều dài rễ (cm) 1,00a 0,73b 0,50c KLT (mg) 127,33a 102,00b 62,00c KLK (mg) 8,33a 6,67b 4,33c *Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô 1.2.3 Ảnh hưởng pH môi trường lên tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro Bảng 3.9 Ảnh hưởng pH đến khả hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro pH 4,3 4,8 5,3 5,8 6,3 Tỷ lệ tạo RTC (%) 100a* 100a 100a 100a 100a Số RTC 18,67c 36,67b 56,00a 30,00bc 21,33c Chiều dài RTC (cm) 0,80c 1,07b 1,37a 1,00bc 1,00bc KLT (mg) KLK (mg) 91,67bc 169,67b 210,67a 116,33b 77,33c 9,67c 16,33b 20,67a 11,33c 8,00c *Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô 1.2.4 Ảnh hưởng giai đoạn nuôi cấy tối sáng lên tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh Bảng 3.10 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro Thời điểm chiếu sáng 100%Tối 80% Tối 50% Tối 100% Sáng Tỷ lệ tạo RTC (%) 94,00a* 94,67a 64,67b 12,33c Số RTC 18,67a 19,00a 8,67b 1,00c Chiều dài RTC (cm) 5,66a 5,00a 2,83b 0,83c KLT (mg) a 365,33 369,00a 188,67b 24,67c KLK (mg) 26,67b 34,33a 13,67c 1,67d *Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan 80% tối thời gian đầu nuôi cấy; 100% tối thời gian ni cấy hồn tồn tối; 50% tối nửa thời gian đầu nuôi cấy tối hồn tồn; 100% sáng ni cấy ngồi sáng với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày 14 1.2.5 Ảnh hưởng thể tích mơi trường ni cấy lên tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh Bảng 3.11 Ảnh hưởng thể tích mơi trường ni cấy lên khả hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro Tỷ lệ Chiều Thể tích Số lượng rễ KLT KLK tạo rễ dài rễ (mL) (rễ/mẫu) (mg) (mg) (%) (cm) 93,34b 8,2d* 2,12b 117,20c 12,80c 10 a a a 100 30 70,60 3,18 455,60a 45,60a a b a 100 38,80 2,84 176,40b 18,20b 50 100a 14,40c 2,38b 134,00c 13,40c 70 b c c 93,34 12,60 1,32 114,00c 12,00c 90 *Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô 1.2.6 Ảnh hưởng hệ thống ni cấy lên hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh Bảng 3.12 Ảnh hưởng hệ thống ni cấy đến hình thành tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro Hệ thống nuôi cấy L Bioreactor tự tạo Bình tam giác kết hợp lắc Bioreactor hình cầu *Các chữ khác nghĩa với p ≤ 0,05 KLK: Khối lượng khô KLT (g) KLK (g) 72,82a* 6,74a Tỷ lệ tăng sinh (lần) 9,71a 30,54c 2,65c 4,07c Tỷ lệ chất khô (%) 9,25a 8,68b 51,30b 4,63b 6,84b 9,03ab cột thể khác biệt có ý phép thử Duncan KLT: Khối lượng tươi, 15 TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY SAPONIN CỦA RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH 2.1 Ảnh hưởng số điều kiện ni cấy lên tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh 2.1.1 Ảnh hưởng giai đoạn ni cấy lên tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh Bảng 3.13 Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến khả tích lũy saponin từ RTC nuôi cấy RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro Hàm lượng saponin (‰)* Thời gian NS Tổng (Rg1+ (ngày) (mg/L) Rg1 Rb1 MR2 Rb1+ MR2) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 14 0,05 0,02 0,74 0,81 0,14 28 0,06 0,03 1,05 1,14 0,51 42 56 0,05 0,01 2,41 2,47 2,29 0,06 0,02 3,13 3,21 1,89 70 0,08 0,02 3,26 3,36 1,83 84 *Trung bình lần chạy mẫu tính g chất khô; NS: suất tổng hợp saponin tồn sinh khối khơ thu 2.1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro Bảng 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro Hàm lượng saponin (‰)* Nhiệt NS độ (°C) Rg1 Rb1 MR2 (mg) Tổng saponin 22 0,06c 0,76a 0,64a 1,40a 0,40a b b b b 0,07 0,73 0,35 1,12 0,23b 25 0,07b 0,62c 0,39b 1,08c 0,17c 28 *Trung bình lần chạy mẫu tính g chất khơ; NS: Năng suất tổng hợp ba saponin tồn sinh khối khơ thu 16 2.1.3 Ảnh hưởng pH lên tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh ni cấy từ RBĐ in vitro Bảng 3.15 Ảnh hưởng pH đến khả tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro Hàm lượng saponin (‰)* pH Rg1 Rb1 MR2 c b c NS (mg) Tổng saponin 1,25 1,29 c 0,42c 4,3 0,03 0,01 4,8 0,03c 0,01b 1,45c 1,49c 0,81b 5,3 0,04b 0,02ab 1,62b 1,68b 1,16a 5,8 0,04b 0,02a 2,45a 2,51a 0,95ab 6,3 0,06a 0,02b 1,61b 1,67b 0,45c *Trung bình lần chạy mẫu tính g chất khơ; NS: Năng suất tổng hợp ba saponin toàn sinh khối khô thu 2.1.4 Ảnh hưởng hệ thống nuôi cấy lên tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro Bảng 3.16 Ảnh hưởng hệ thống ni cấy đến khả tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro Hệ thống nuôi cấy L Bioreactor tự tạo Bình tam giác kết hợp lắc Hàm lượng saponin (‰)* Tổng NS (mg) Rg1 Rb1 MR2 0,12c 1,03c 3,00b 4,15b 0,93b 0,35a 1,90a 1,15c 3,40b 0,30c saponin Bioreactor hình cầu 0,25ab 1,41ab 6,86a 8,52a 1,31a *Trung bình lần chạy mẫu tính g chất khơ; NS: suất tổng hợp ba saponin toàn sinh khối khô thu 17 2.2 Ảnh hưởng số elicitor lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro 2.2.1 Ảnh hưởng chitosan lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro Bảng 3.17 Ảnh hưởng chitosan lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh từ mẫu RBĐ in vitro Hàm lượng (% g RTC khô) CHN KLT KLK Tổng (mg/L) (mg) (mg) Rg1 Rb1 MR2 saponin 0,88d 456,90a* 41,85a 0,339d 0,144d 0,395c 271,82c 26,93c 0,260e 0,466a 0,164e 0,89d 50 e e a d d 100 159,93 15,85 1,632 0,142 0,251 2,03a d d b b a 202,87 20,32 0,676 0,328 0,433 1,43b 150 b c c b 298,33b 29,50 0,368 0,231 0,415 1,02c 200 *Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô 2.2.2 Ảnh hưởng dịch chiết nấm men lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh Bảng 3.18 Ảnh hưởng dịch chiết nấm men lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro YE KLT KLK (mg/L) (mg) (mg) c* c 41,85 Hàm lượng (% g RTC khô) Rg1 Rb1 c 0,339 MR2 c Tổng saponin 0,144 0,395 d 0,88d 0,679c 1,48b 456,90 50 510,83a 51,25a 0,502b 0,251a 100 473,30b 47,25b 0,534b 0,200b 0,743b 1,42b 150 250,03d 25,03d 2,482a 0,244a 0,786b 3,51a 200 154,60e 15,39e 0,544b 0,256a 0,842a 1,67c *Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan 18 2.2.3 Ảnh hưởng abscisic acid lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh Bảng 3.19 Ảnh hưởng abscisic acid lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh từ mẫu RBĐ in vitro ABA (µg/L) 50 100 150 200 KLT (mg) 456,9a* 156,33b 107,17c 82,47d 76,30d KLK (mg) 41,85a 16,67b 10,59c 8,25d 7,58d Rg1 0,339d 0,703c 1,234b 1,506a 0,731c Hàm lượng (% g RTC khô) Rb1 MR2 Tổng saponin 0,144d 0,395d 0,88e 0,198c 1,058b 1,96d 0,204c 0,973c 2,41c b a 0,219 1,651 3,37a 2,65b 0,277a 1,637a **Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô 2.2.4 Ảnh hưởng salicylic acid lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh Bảng 3.20 Ảnh hưởng salicylic acid lên tăng sinh tích lũy saponin RTC từ mẫu RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro Hàm lượng (% g RTC khô) Tổng Rb1 MR2 saponin 0,339d 0,144d 0,395c 0,88d 456,9a* 41,85a 1,79a 50 433,07b 43,52a 0,675a 0,248b 0,867a b b a 100 200,03c 19,8b 0,455c 0,599 1,44 0,385 150 84,23d 8,18c 0,503b 0,176c 0,576b 1,25c 200 67,37d 6,79c 0,439c 0,356b 0,398c 1,19c *Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khơ SA (µg/L) KLT (mg) KLK (mg) Rg1 2.2.5 Ảnh hưởng jasmonic acid lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh Bảng 3.21 Ảnh hưởng jasmonic acid lên tăng sinh tích lũy saponin RTC từ mẫu RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro JA KLT KLK Hàm lượng (% g RTC khơ) (µg/L) (mg) (mg) Rg1 Rb1 MR2 Tổng saponin 0,144e 0,395e 0,88d 456,90a* 41,85a 0,339e b b c c a 50 166,24 15,89 2,227 1,855 4,93c 0,849 100 125,56c 12,76c 3,219a 0,718b 1,302d 5,24b 150 81,56d 8,59d 2,524b 0,582c 2,464b 5,57a 200 75,56d 7,59d 1,975d 0,401d 5,21b 2,826a *Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô 19 2.2.6 So sánh tác động elicitor đơn lẻ lên sư tổng hợp saponin RTC sâm Ngọc Linh Năng suất tổng hợp saponin (mg/L) 25 a b 20 c c 15 10 f e e hij hij ij fg b d f fgh ghi k fg j l l ĐC 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 ABA (µg/L) Biểu đồ 3.3 CHN (mg/L) SA (µg/L) YE (mg/L) JA (µg/L) Ảnh hưởng elicitor lên suất tổng hợp ba saponin RTC sâm Ngọc Linh Rg1 (%) ĐC 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 CHN (mg/L) YE(mg/L) ABA (µg/L) SA (µg/L) JA (µg/L) MR2 (%) ĐC CHN (mg/L) Rb1 (%) 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 ABA (µg/L) SA (µg/L) JA (µg/L) 0.5 ĐC 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 CHN (mg/L) Tổng saponin (%) YE(mg/L) YE(mg/L) ABA (µg/L) SA (µg/L) JA (µg/L) ĐC 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 CHN (mg/L) YE(mg/L) ABA (µg/L) SA (µg/L) JA (µg/L) sánh ảnh hưởng elicitor lên tổng hợp ba saponin RTC sâm Ngọc Linh Biểu đồ 3.4 So 20 2.2.7 Ảnh hưởng việc kết hợp đồng thời salicylic acid dịch chiết nấm men lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh in vitro Bảng 3.22 Ảnh hưởng việc kết hợp acid salicylic dịch chiết nấm men lên khả phát triển RTC từ nguồn RBĐ sâm Ngọc Linh SA µg/L YE (mg/L) KLT (mg/L) KLK (mg/L) Chỉ số tăng trưởng % tỷ lệ chất khô 453,47a 41,85a 17,14a 9,23bcde 25 440,00a 33,67b 16,60a 7,69def c e c 342,20 28,8d 12,69 8,42bcde 50 de h de 281,5 21,75 10,26 7,73cdef 100 ghi ij ghi 219,00 19,00 7,76 8,68bcde 150 205,00hijk 17,06km 7,20hijk 8,32bcde 200 182,22ijk 15,67mn 6,29ijk 8,61bcde 50 25 ghij ijk ghij 217,11 18,33 7,68 9,78b 50 255,00efg 24,67f 9,20efg 9,68bc 100 267,00ef 34,00b 9,68ef 150 12,73a k mn k 174,25 16,38 5,97 9,40bcd 200 ef fg ef 266,33 23,67 9,65 8,89bcde 100 25 240,67fgh 23,00gh 8,63fgh 9,57bcd 50 de h de 283,00 22,00 10,32 7,77cdef 100 cd f cd 320,00 25,00 11,80 7,82cdef 150 198,33ijk 16,00mn 6,93ijk 8,07cdef 200 de ijk de 288,67 18,33 10,55 6,35f 150 25 b c b 383,67 31,00 14,35 8,08cdef 50 b cd b 404,33 30,11 15,17 7,44ef 100 255,00efg 20,00i 9,20efg 7,86cdef 150 178,70jk 15,00n 6,15jk 8,39bcde 200 b b b 379,33 32,67 14,17 8,61bcde 200 25 311,33cd 28,00e 11,45cd 8,99bcde 50 de fg de 290,33 23,67 10,61 8,15cdef 100 hijk ij hijk 211,67 19,33 7,47 9,13bcde 150 ijk jk ijk 192,25 18,06 6,69 9,39bcde 200 *Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô 25 Rb1 (%/gKLK) 21 a b 0.5 0.4 c d de 0.3 efg 0.2 g h j d e f fgh hi h i fg h g j j jk 0.1 kl k k l MR2 (%/g KLK) 25 0.8 50 100 150 200 150 50 100 25 200 150 50 100 25 200 150 50 100 25 200 150 50 100 25 200 150 50 100 25 ĐC 200 SA (µg/L) a b 0.6 de e de e ef h i f h j ij ijk 0.2 c bcd d d 0.4 YE (mg/L) cd e ef e f g ij k 50 b gh h ij l 100 150 150 100 50 25 200 lm 200 i 100 150 k 25 200 100 25 50 200 o n 150 ijk ij 50 g j 150 100 l 200 150 100 50 25 200 150 100 50 25 200 150 50 100 25 200 f l YE (mg/L) SA (µg/L) 200 c 50 25 200 150 100 50 25 150 YE (mg/L) SA (µg/L) 200 a b bc b c d d j l i hi fgh efg g e e d c fg de f h k l i jk ĐC 25 50 100 150 200 25 50 100 150 200 25 50 100 150 200 25 50 100 150 200 25 50 100 150 200 Năng suất tổng hợp saponin (mg/L) 100 a 25 150 50 0.035 0.03 d 0.025 e 0.02 0.015 fg 0.01 m n mn o 0.005 ĐC Rg1 (%/g KLK) 25 10 100 50 25 200 150 100 50 25 ĐC 25 Biểu đồ 3.5 Tác 50 100 150 200 YE (mg/L) SA (µg/L) động đồng thời dịch chiết nấm men salycylic acid lên khả tích lũy saponin ni cấy tạo RTC sâm Ngọc Linh Năng suất tổng hợp saponin (mg/L) 23,41 25 20 15 9,15 10 Rb1 (%/g KLK) 22 30 0,24 0.25 0,19 0.2 0.15 0.1 0.05 25 mg/L YE + 25 µg/L SA 150 mg/L YE 0.3 0,25 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 MR2 (%/g KLK) 25 mg/L YE + 25 µg/L SA 150 mg/L YE Rg1 (%/g KLK) Biểu đồ 3.6 0.3 0.9 0,79 0.8 0.7 0.6 0,45 0.5 So sánh tác động kết hợp dịch chiết nấm men salycylic acid lên tích lũy saponin ni cấy tạo RTC sâm Ngọc Linh 0.4 0.3 0.2 0,02 0.1 25 mg/L YE + 25 µg/L SA 150 mg/L YE 25 mg/L YE + 25 µg/L SA 150 mg/L YE 2.2.8 Ảnh hưởng thời gian bổ sung dịch chiết nấm men lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh 656,5a 0.35 0,29a 0,26b Khối lượng tươi RTC (mg) 600 500 0.25 374,5b 373,4b 400 0.20 0,13c 300 254,4c 200 0,08e 0.30 0.15 0,10d 0.10 208,25cd 100 0.05 0.00 T0 T10 T20 T30 NS (mg/L) T40 Năng suất tổng hợp saponin (mg/L) 700 Biểu đồ 3.7 Năng xuất tổng hợp saponin thời điểm xử lý với dịch chiết nấm men nuôi cấy RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro Bảng 3.23 Ảnh hưởng thời gian bổ sung dịch chiết nấm men lên khả phát triển RTC từ nguồn RBĐ sâm Ngọc Linh Thời gian (ngày) 10 20 30 40 KLT (mg) KLK (mg) Hàm lượng (% g RTC khô) Rb1 MR2 Rg1 Tổng Nồng độ (µg/mL) suy từ đường chuẩn Rb1 MR2 Rg1 Tổng 254,40c 24,40c 0,0237d 236,6e 785,81b 1046,46b 0,7858a 0,2405a 1,050a 24,05a 208,25c 20,00c 0,1793c 0,4836b 0,0042e 0,667b 327,26c 22,16b 882,70a 1232,13a 373,40b 33,20b 0,2366d 0,0097c 0,558b 431,48d 17,70b 1016,68b 0,3112a 567,50a 374,75b 29,50c 0,2210b 0,1020e 0,0051d 0,328d 405,03b 186,96e 9,37d 601,36d 0,1655c 0,2763c 0,0122b 0,454c 301,32d 502,80c 7,62e 811,73c 656,50a 64,00a *Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 phép thử Duncan KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô 23 KẾT LUẬN Từ kết đạt cho thấy: Các RTC sâm Ngọc Linh hình thành từ trụ bì vị trí bó mạch dẫn trung tâm đạt tốt mẫu RBĐ cm tái sinh từ cuống không bỏ phần mô cuống nuôi cấy tạo RTC Nhu cầu dinh dưỡng, CĐHST đường carbohydrate đảm bảo tốt cho RTC sâm Ngọc Linh tăng trưởng từ RBĐ in vitro mơi trường MS cải biên có tỷ lệ NH4+/NO3- (1/2), bổ sung mg/L IBA, 0,5 mg/L BA 30 g/L sucrose Điều kiện thích hợp cho RTC sâm Ngọc Linh tăng trưởng tích lũy saponin nuôi cấy tối đa 56 ngày, với 45 ngày đầu tối 11 ngày sau sáng; nhiệt độ 22C, 30 mL mơi trường bình 250 mL pH = 5,3 Hệ thống nuôi cấy tốt Bioreactor tự tạo L chứa 1,5 L môi trường g RBĐ Khi sử dụng đơn lẻ elicitor, JA ABA ức chế sinh trưởng mạnh nhất, cịn SA, YE CHN ức chế tăng trưởng Đối với tích lũy saponin, hàm lượng Rb1 đạt cao 50 µg/L JA, Rg1 100 µg/L JA, MR2 200 µg/L JA suất tổng hợp ba saponin đạt cao 150 mg/L YE Kết hợp đồng thời YE SA không hiệu sử dụng 150 mg/L YE Thời gian thích hợp để bổ sung 150 mg/L YE vào môi trường nuôi cấy ngày thứ 40 ngày (16 ngày trước thu hoạch) q trình ni cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ rễ bất định in vitro 24 KIẾN NGHỊ Trong khuôn khổ giới hạn kinh phí thời gian nghiên cứu, nên luận án thực số nội dung trình bày Do vậy, để nghiên cứu hồn thiện hơn, đề nghị tiếp tục nghiên cứu số nội dung sau: Nghiên cứu thời gian xử lý JA, ABA hay SA sinh khối RBĐ sâm Ngọc Linh sau khi thu hoạch Nghiên cứu thời điểm xử lý elicitor khác nuôi cấy RBĐ sâm Ngọc Linh thông qua biểu enzyme xúc tác tổng hợp saponin đường triterpenoid Nghiên cứu thêm tác động elicitor liên quan đến gen sinh tổng hợp hợp chất saponin cụ thể sâm Ngọc Linh để sản xuất saponin theo mong muốn Ứng dụng nuôi cấy RTC sâm Ngọc Linh vào sản xuất quy mô công nghiệp để tạo nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm thực phẩm DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC Nguyễn Thị Nhật Linh, Nguyễn Hoàng Lộc, Dương Tấn Nhựt (2018) Ứng dụng elicitor vào sản xuất saponin ni cấy in vitro lồi thuộc chi nhân sâm Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 15(2): 1-11 Nguyen Thi Nhat Linh, Hoang Thanh Tung, Vu Thi Hien, Vu Quoc Luan, Nguyen Phuc Huy, Nguyen Hoang Loc, Duong Tan Nhut (2017) Effect of metal nanoparticles on the growth of Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis) lateral roots cultured in vitro Hue University Journal of Science: Natural Science, 126(1C): 47-55 Nguyễn Thị Nhật Linh, Nguyễn Hoàng Lộc, Dương Tấn Nhựt (2017) Ảnh hưởng mơi trường khống, nguồn carbon peptone lên khả phát triển rễ thứ cấp từ rễ bất định sâm Ngọc Linh in vitro Tạp chí trường Đại học Khoa học – Đại học Huế, 10(1): 155-166 Nguyễn Thị Nhật Linh, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Hoàng Lộc, Dương Tấn Nhựt (2017) Ảnh hưởng elicitor sinh học phi sinh học đến sinh khối hàm lượng saponin rễ thứ cấp nuôi cấy lỏng lắc rễ bất định sâm Ngọc Linh Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 15(2): 285-291 Nguyễn Thị Nhật Linh, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Hoàng Lộc, Dương Tấn Nhựt (2015) Tăng cường khả hình thành phát triển rễ thứ cấp từ rễ bất định sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) nuôi cấy in vitro Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 13(2): 221-230 Dương Tấn Nhựt, Trần Hiếu, Nguyễn Thị Nhật Linh, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Quốc Luận, Vũ Thị Hiền (2015) Tối ưu hóa q trình nhân nhanh tích lũy saponin rễ bất định sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) hệ thống ni cấy Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 13(3): 853-864 Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Bá Nam, Hoàng Xuân Chiến, Lê Kim Cương, Ngô Thanh Tài, Nguyễn Việt Cường, Nguyễn Phúc Huy, Trịnh Thị Hương, Trần Hiếu, Nguyễn Thị Nhật Linh, Dương Tấn Nhựt (2015) Tối ưu hóa số yếu tố môi trường điều kiện nuôi cấy đến trình tái sinh rễ bất định từ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 13(3): 865-873 ... nghiên cứu ứng dụng elicitor vào nuôi cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh cần thiết Chính thế, Đề tài ? ?Nghiên cứu ni cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv. ) khảo sát ảnh hưởng số elicitor. .. TÍCH LŨY SAPONIN CỦA RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH 2.1 Ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy lên tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh 2.1.1 Ảnh hưởng giai đoạn nuôi cấy lên tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh. .. Linh 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng pH lên tăng sinh tích lũy saponin RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định