Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng lợn, đặc điểm sinh vật của vi khuẩn pasteurella multocida gây bệnh tụ huết trùng ở lợn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vnĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM VŨ PHẠM THÁI NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DịCH TỄ BỆNH TỤ HUYẾT TRÙ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

VŨ PHẠM THÁI

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DịCH TỄ BỆNH

TỤ HUYẾT TRÙNG, ĐẶC ĐIỂM SINH VẬT HỌC

CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

VŨ PHẠM THÁI

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DịCH TỄ BỆNH

TỤ HUYẾT TRÙNG, ĐẶC ĐIỂM SINHVẬT HỌC

CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là hoàn toàn trung thực và chưa hề sử dụng cho bảo vệ một học vị nào Mọi

sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn đã được cảm ơn và các thông tin tàiliệu trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Vũ Phạm Thái

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn, cùng với sự nỗ lực của bản thân, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ tận tình và trực tiếp của các Thày hướng dẫn, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới:

- PGS.TS Nguyễn Quang Tuyên

Xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu của tập thể Lãnh đạo và cán bộ Chi cục Thú y tỉnh Phú Thọ, tập thể Lãnh đạo và cán bộ Trạm Thú y các huyện: huyện Lâm Thao, huyện Phù Ninh, Thị xã Phú Thọ và các anh, chị thú

y viên cơ sở, các hộ chăn nuôi thuộc các xã Tứ Xã, Sơn Vi, Hợp Hải, Phú Nham, Gia Thanh, Hạ Giáp, Hà Thạch, Văn Lung và Hà Lộc.

Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này.

Xin trân trọng cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Vũ Phạm Thái

1 11

KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

n : Số lượng

% : Tỷ lệ phần trăm

cs : Cộng sự

P multocida : Pasteurella multocida

YPC : Yeast extract Peptone L - Cytine

TSA : Trytone soy agar

LT1 : Mẫu nghiên cứu sô 1 tại Lâm Thao

PN4 : Mẫu nghiên cứu sô 4 tại Phù Ninh

TX10 : Mẫu nghiên cứu sô 10 tại T.X Phú Thọ

DANH MỤC ẢNH CỦA LUẬN VĂN

TT ẢNH NỘI DUNG ẢNH TRANG

Ảnh 1 Triệu chứng lâm sàng lợn mắc bệnh tụ huyết trùng 94Ảnh 2 Bệnh tích phổi lợn xung huyết và tụ huyết 94Ảnh 3 Bệnh tích phổi lợn xung huyết và tụ huyết 95Ảnh 4 Khuẩn lạc tụ huyết trùng sau khi nuôi cấy 24h ở 370C 95Ảnh 5 Hình thái vi khuẩn tụ huyết trùng trên kính hiển vi 96

Ảnh 7 Khả năng mẫn cảm hoặc kháng kháng sinh của các 97

chủng vi khuẩn phân lập được

Ảnh 8 Các sản phẩm của phản ứng PCR 97

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ i

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Ở Việt Nam 5

1.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng lợn 6

1.2.1 Nguồn bệnh, đường xâm nhiễm của mầm bệnh và cơ chế gây bệnh tụ huyết trùng 6

1.2.2 Chất chứa và độc tố của vi khuẩn P multocida 8

1.2.3 Tuổi mắc bệnh của gia súc 8

1.2.4 Mùa vụ phát bệnh 9

1.2.5 Vùng phát dịch 10

1.2.6 Hiện tượng mang vi khuẩn P multocida ở đường hô hấp trên của động vật khỏe Nguồn lây lan bệnh tạo các ổ dịch tụ huyết trùng 11

1.2.7 Đặc tính sinh học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng 13

1.2.8 Đặc điểm nuôi cấy 16

1.2.9 Đặc tính sinh hoá của vi khuẩn P multocida 22

1.2.10 Cấu trúc kháng nguyên P multocida và type huyết thanh 23

1.2.11 Sức đề kháng của vi khuẩn P multocida 27

1.3.Tính gây bệnh của vi khuẩn P multocida 28

1.4 Chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng lợn 33

1.5 Biện pháp phòng và trị bệnh tụ huyết trùng 36

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

43 2.1 Nội dung nghiên cứu 43

2.2 Đối tượng, địa điểm 43

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 43

2.2.2 Địa điểm 43

2.3 Vật liệu 43

2.3.1 Mẫu bệnh phẩm dùng phân lập vi khuẩn 43

2.3.2 Động vật thí nghiệm: Chuột bạch có trọng lượng từ 18 - 20gam/con 44

2.3.3 Giống vi khuẩn: Các chủng P multocida phân lập được để xác định các đặc tính sinh vật, hóa học được đông khô giữ giống .44

2.3.4 Các hệ mồi (Primer): Dùng để xác định serotype vi khuẩn P.multocida bằng phương pháp PCR .44

2.3.5 Các loại đường dùng cho phản ứng lên men đường 44

2.3.6 Máy móc, thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm 44

2.3.7 Các loại hóa chất dùng cho nghiên cứu 44

2.3.8 Môi trường sử dụng và nuôi cấy vi khuẩn 44

2.4 Phương pháp nghiên cứu 44

2.4.1 Phương pháp điều tra dịch tễ bệnh THT lợn 44

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu 44

2.4.3 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn 45

2.4.4 Phương pháp xác định một số đặc tính sinh vật, hoá học của vi khuẩn P multocida 47

2.4.5 Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn P multocida phân lập được 47

2.4.6 Phương pháp xác định type kháng nguyên của P multocida 50

2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 51

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 52

3.1 Kết quả điều tra tình hình dịch bệnh tụ huyết trùng lợn tại các huyện nghiên cứu ở tỉnh Phú Thọ 52

3.1.1 Kết quả điều tra bệnh tụ huyết trùng ở lợn tại tỉnh Phú Thọ qua các năm 2006 - 2008 52

3.1.2 Kết quả điều tra số lượng lợn mắc và chết do bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Phú Thọ ở các mùa vụ 56

3.1.3 Kết quả điều tra tỷ lệ lợn mắc bệnh tụ huyết trùng ở các lứa tuổi 59

3.1.4 Kết quả điều tra tỷ lệ lợn mắc và chết do bệnh tụ huyết trùng ở tỉnh Phú Thọ theo phương thức chăn nuôi 61

3.1.5 Kết quả điều tra tỷ lệ lợn mắc bệnh và chết do bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Phú Thọ theo giống lợn 64

3.1.6 Kết quả theo dõi các triệu chứng ở lợn bệnh nghi mắc tụ huyết trùng 66

3.1.7 Kết quả kiểm tra bệnh tích của lợn ốm nghi mắc bệnh tụ huyết trùng 68

3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella từ bệnh phẩm của lợn chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng 69

3.3 Kết quả phân lập Pasteurella từ dịch ngoáy mũi của lợn khoẻ 70

3.4 Kết quả xác định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Pasteurella phân lập được 72

3.5 Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tụ huyết trùng lợn 80

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 82

4.1 Kết luận 82

4.2 Đề nghị 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO 84

ở các thời vụ 57Bảng 3.4: Kết quả điều tra tỷ lệ lợn mắc và chết bệnh tụ huyết trùng ở

các lứa tuổi 60Bảng 3.5: Kết quả điều tra tỷ lệ lợn mắc và chết bệnh tụ huyết trùng ở

tỉnh Phú Thọ theo phương thức chăn nuôi 62Bảng 3.6: Kết quả điều tra tỷ lệ lợn mắc và chết bệnh tụ huyết trùng

theo giống lợn 65Bảng 3.7: Kết quả theo dõi các triệu chứng ở lợn bệnh nghi mắc tụ

huyết trùng 67Bảng 3.8: Kết quả kiểm tra bệnh tích của lợn ốm nghi mắc bệnh tụ huyết

trùng 68

Bảng 3.9: Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella từ bệnh phẩm của lợn

chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng 69

Bảng 3.10: Kết quả phân lập Pasturella từ dịch ngoáy mũi của lợn khoẻ 71

Bảng 3.11: Kết quả kiểm tra đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn

Pasteurella phân lập được 73

Bảng 3.12: Kết quả kiểm tra khả năng lên men một số loại đường của

các chủng Pasteurella phân lập được 74 Bảng 3.13 Kết quả định type vi khuẩn P multocida bằng phản ứng

PCR 76

Bảng 3.14: Kết quả xác định độc lực của các chủng P multocida phân

lập được 77Bảng 3.15: Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với một số kháng sinh

của các chủng P multocida phân lập được 79

Bảng 3.16: Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tụ huyết trùng lợn 80

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Tính cấp thiết của đề tài

Chăn nuôi của tỉnh Phú Thọ đang có bước phát triển, hiện nay đã hìnhthành nhiều trang trại chăn nuôi lợn theo hướng hàng hóa bên cạnh những hộchăn nuôi trước đây Tổng đàn lợn của tỉnh theo ước tính có trên 55 vạn con,tốc độ tăng trung bình 5 - 6% năm Đến nay, cả tỉnh có trên 300 trang trạinuôi lợn nái giống ngoại Đồng thời, tỉnh có nhiều chính sách khuyến khích,

hỗ trợ phát triển chăn nuôi và chăn nuôi lợn đang trở thành ngành chính trongsản xuất nông nghiệp

Tuy vậy, để chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng phát triểncho hiệu quả cao, ngoài công tác giống, thức ăn, quản lý, chăm sóc…thì côngtác phòng, chống dịch bệnh cần được đặc biệt coi trọng Trong những nămqua ngành thú y trong cả nước hoạt động mạnh mẽ nên đã hạn chế được nhiềubệnh truyền nhiễm cho vật nuôi và đảm bảo cho chăn nuôi phát triển Với đặcđiểm của từng vùng, khu vực, địa phương và nhiều nguyên nhân khác nhaunên vẫn còn một số bệnh truyền nhiễm thường xảy ra ở gia súc, trong đó cóbệnh tụ huyết trùng lợn Đây là bệnh gây nguy hiểm không chỉ đối với lợn màcòn đối với nhiều loài gia súc, gia cầm khác, bệnh này xảy ra ở hầu hết cácvùng chăn nuôi lợn trên thế giới

Những năm qua, bệnh tụ huyết trùng xảy ra ở đàn lợn nuôi tại tỉnh PhúThọ theo ước tính hàng năm có tới 25 - 30% tổng đàn lợn nuôi Việc chẩnđoán, phòng chống bệnh này tại tỉnh Phú Thọ còn gặp nhiều khó khăn do cónhững đặc thù riêng về địa lý, kinh tế xã hội, tập quán chăn nuôi lạc hậu,trình độ dân trí chưa cao Đặc biệt ở những nơi dân tộc ít người sinh sống,việc áp dụng khoa học kỹ thuật và phòng chống dịch bệnh trong chăn nuôicòn hạn chế Chính những nhân tố đó đã tạo nên sự tồn tại, phát sinh nhiều ổ

dịch tụ huyết trùng lợn lẻ tẻ ở vật nuôi, gây thiệt hại đáng kể về kinh tế chongười chăn nuôi.

Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết của thực tiễn sản xuất, chúng tôi đã tiến

hành đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng lợn, đặc điểm sinh vật học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng ở lợn nuôi tại tỉnh Phú Thọ và biện pháp phòng trị”.

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

+ Điều tra tình hình bệnh tụ huyết trùng ở lợn nuôi tại tỉnh Phú Thọ: Xác

định tỷ lệ lợn khoẻ mang vi khuẩn THT và tỷ lệ lợn ốm chết do bệnh tụ huyết trùng

+ Phân lập, xác định một số đặc điểm sinh học và type của vi khuẩn

Pasteurella phân lập được.

+ Thử nghiệm phác đồ phòng và trị bệnh tụ huyết trùng lợn cho tỉnhPhú Thọ đạt hiệu quả cao

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đây là đề tài đầu tiên nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng lợn tại huyệnLâm Thao, huyện Phù Ninh và Thị xã Phú Thọ tỉnh Phú Thọ thử nghiệm phác

đồ phòng và trị bệnh tụ huyết trùng lợn cho tỉnh Phú Thọ đạt hiệu quả cao

ở thỏ năm 1881; ở lợn do Loeffer phát hiện năm 1886; ở trâu năm 1887 vàsau đó đã phát hiện vi khuẩn còn gây bệnh cho nhiều loài động vật khác(Cater, 1959)[51] Pavri và Apte (1976)[79] đã ghi nhận vi khuẩn tụ huyếttrùng gây bệnh cho hươu, nai, chó, mèo, ngựa, chồn, khỉ…

Năm 1880, Louis Passteur lần đầu tiên phân lập được vi khuẩn gâybệnh từ xác gà chết Sau đó nhiều nhà khoa học cũng phân lập được vi khuẩngây bệnh tương tự từ các loài động vật khác nhau như: Gaffky (1881) phânlập được vi khuẩn trên thỏ và Kitt (1885) phân lập được vi khuẩn trên bò…

Năm 1887, Trevisan đề nghị đặt tên vi khuẩn là Pasteurella để ghi nhớ

công lao của Louis Pasteur - người đầu tiên xác định vi khuẩn là nguyên nhângây bệnh tụ huyết trùng

Sau này, người ta đặt tên vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng cho độngvật theo tên vật chủ mà chúng thích nghi gây bệnh

Pasteurella suiseptica gây bệnh cho lợn

Pasteurella boviseptica gây bệnh ở trâu, bò

Pasteurella aviseptica gây bệnh ở gà

Rosenbush và Merchant (1939) [87] đã đề nghị đặt tên cho vi khuẩn

này là Pasteurella multocida (P multocida) để chỉ khả năng gây bệnh cho

nhiều loài vật của chúng, tên vi khuẩn này đã được công nhận chính thức trên

thế giới và được sử dụng cho đến ngày nay Bệnh do P multocida gây ra

thường ở hai thể chủ yếu là nhiễm trùng máu, xuất huyết HaemorrhagicSepticaemia (HS) và viêm phổi ở bò (Bovine Pneumonia) Thể viêm phổi ở

bò thấy tại các nước châu Âu và Bắc Mỹ (Frank, 1989)[62] Bệnh tụ huyếttrùng lợn gặp ở khắp các châu lục, xảy ra lẻ tẻ, ít khi thành dịch (Lê Minh Trí

và cs, 1999)[37] Thể nhiễm trùng máu, xuất huyết (HS) thấy ở trâu, bò cácnước châu Á và châu Phi (Phan Thanh Phượng, 2000)[29]

Từ năm 1887 đến nay, bệnh THT đã được phát hiện ở nhiều nướctrên thế giới, bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế cho nhiều nước ,nhất là ở các nước nhiệt đới nóng ẩm thuộc châu Á, bệnh xảy ra tại cácnước Đông Dương, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia Ở Nhật Bản, bệnh đượcphát hiện vào năm 1923, song không thấy gây thành dịch và không thể hiệndịch tễ Bệnh cũng được phát hiện ở bò rừng Vườn thú quốc gia Mỹ vàocác năm 1912, 1922, 1967 và chỉ thấy có một báo cáo cho biết bệnh có ở

bò sữa vào năm 1969 (Cater, 1982)[53] Năm 1984, Tổ chức dịch tễ thếgiới OIE (Office International Epizooties) chính thức công bố bệnh THTtrâu, bò trên thế giới (FAO, 1991)[61], OIE cũng phân loại bệnh (HS) vàobảng B trong danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở gia súc Theo(De Alwis, 1992a De Alwis, 1992a[57]) bệnh cũng đã sảy ra ở châu Phi vàgây thiệt hại nghiêm trọng cho đàn gia súc

Kể từ khi phát hiện đến nay, vi khuẩn P multocida vẫn là nguyên nhân

gây bệnh tụ huyết trùng cho nhiều loài gia súc và gia cầm Tuy có tính thích

nghi gây bệnh trên các loài vật khác nhau, nhưng P multocida đều có đặc tính

cơ bản giống nhau

1.1.2 Ở Việt Nam

Có nhiều nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng, theo Phan Đình Đỗ vàTrịnh Văn Thịnh (1958)[2] bệnh tụ huyết trùng trâu, bò được phát hiện đầutiên vào năm 1868 bởi Condamin ở Bà Rịa, Long Thành, sau đó Gemain(1869) phát hiện bệnh ở Gò Công; Shein (1901) xác định có bệnh này ở TâyNinh Những năm sau này Nguyễn Vĩnh Phước (1978a)[24], Hoàng Đạo Phấn

(1986)[19] đã nghiên cứu về đặc tính của P multocida và type huyết thanh của

chúng

Một số tác giả trong nước đã nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở gia súcnhư: Dương Thế Long (1995)[14] nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ và vikhuẩn học của bệnh THT trâu, bò ở Sơn La để xác định biện pháp phòng trịthích hợp Võ Văn Hùng (1997)[10] nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ học bệnhTHT lợn ở Đắk Lắk và biện pháp phòng trị

Trước đây bệnh tụ huyết trùng lợn xảy ra mạnh ở các tỉnh phía Nam vàxảy ra lẻ tẻ ở các tỉnh phía Bắc Trong những năm 1970, có 80% số ổ dịch và84% số gia súc thiệt hại do bệnh tụ huyết trùng thuộc về các tỉnh ở Phía Nam.Đến những năm 1990 phân bố địa lý của bệnh nghiêng về các tỉnh phía Bắc,

số địa phương có dịch tụ huyết trùng cũng tăng lên nhiều, hàng năm có 20-25tỉnh thông báo có bệnh lưu hành (Bùi Quý Huy, 1998)[11]

Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng ở vật nuôi

như: Bùi Văn Dũng (2000)[4] nghiên cứu tình hình bệnh THT và vi khuẩn P.

multocida phân lập từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe ở tỉnh Lai Châu; Phan

Thanh Phượng (2000)[26] nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng ở gia súc, giacầm và biện pháp phòng chống; Cao Văn Hồng (2002)[9] nghiên cứu đặcđiểm dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu, bò, lợn tại Đắk Lắk; Hoàng ĐăngHuyến (2004)[12] nghiên cứu đặc điểm dịch tễ, các yếu tố ảnh hưởng đếnbệnh THT ở Bắc Giang; Nguyễn Văn Minh (2005)[15] nghiên cứu một số đặc

điểm dịch tễ bệnh THT và xác định tỷ lệ mang trùng Pasteurella ở đàn trâu

bò tỉnh Hà Tây; Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn (2007)[8] nghiên cứu một

số đặc tính của vi khuẩn P multocida phân lập từ trâu, bò, lợn; Đỗ Ngọc

Thúy và cs (2007)[36] đã ứng dụng kỹ thuật PCR để định type các chủng vi

khuẩn P multocida phân lập từ vật nuôi Tuy nhiên việc nghiên cứu vi khuẩn

P multocida gây bệnh ở lợn một cách hệ thống thì vẫn còn chưa đầy đủ.

1.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng lợn

Bệnh tụ huyết trùng lợn là bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn P multocida

gây ra thường ở thể nhiễm trùng máu, xuất huyết (Haemorrhagic Septicaemia).Bệnh thường phát sinh rải rác, nhưng có khi tạo thành dịch lây lan rộng tại địaphương Hiện nay, bệnh tụ huyết trùng lợn xuất hiện ở hầu hết các địa phươngtrong cả nước và gây tổn thất đáng kể về kinh tế cho người chăn nuôi

1.2.1 Nguồn bệnh, đường xâm nhiễm của mầm bệnh và cơ chế gây bệnh

tụ huyết trùng

Trong tự nhiên các giống lợn đều mắc bệnh, trong đó lợn sau cai sữa,lợn từ 3 - 6 tháng tuổi hay mắc bệnh nhất Nguồn lây lan bệnh tụ huyết trùngchủ yếu là lợn bị bệnh, mang trùng và thải ra môi trường, do việc giết mổ thịtđem phân tán làm cho dịch lây lan rộng, đặc biệt là quá trình vận chuyển lợn

từ nơi này sang nơi khác Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1970)[23] lợn mắc bệnhcấp tính thì trong máu, dịch bài tiết, các phủ tạng đều có vi khuẩn và bài thải

vi khuẩn ra môi trường ngoài trong thời kỳ nung bệnh Ngoài ra, vi khuẩn

P.multocida còn gặp thường xuyên trong cơ thể lợn khỏe, chúng cư trú ở

niêm mạc đường hô hấp trên, ở hầu bệnh súc, khi gia súc gặp điều kiện khôngthuận lợi như stress, thời tiết thay đổi, mật độ nuôi nhốt đông, chăm sóc nuôi

dưỡng kém làm sức đề kháng con vật giảm thì vi khuẩn P multocida sẽ tăng

độc lực và gây bệnh Bệnh tụ huyết trùng lan truyền theo hai phương thứctrực tiếp và gián tiếp Truyền bệnh trực tiếp do tiếp xúc giữa lợn ốm với lợnkhỏe hoặc qua không khí thở ra từ lợn ốm rồi lợn khỏe hít vào, đây là cách

truyền bệnh phổ biến trong đàn khi có lợn mắc bệnh tụ huyết trùng Truyềnbệnh gián tiếp khi vi khuẩn vào đường tiêu hóa qua thức ăn, nước uống bịnhiễm khuẩn hoặc qua các vết xước ở da, niêm mạc Phương thức truyềnbệnh ngang và truyền bệnh dọc đều có thể xảy ra nhưng chưa được chứngminh rõ ràng về cơ chế gây bệnh, nhiều tác giả cho rằng bệnh đường hô hấp

ở lợn là kết quả tác động của nhiều yếu tố gây nên, chứ không phải duy nhất

do cảm nhiễm vi khuẩn Vì vậy, bệnh tụ huyết trùng lợn không phải chỉ làkết quả của cảm nhiễm xảy ra đột ngột, mà phải có một quá trình vi khuẩn

có sẵn cư trú ở đường hô hấp sản sinh một lượng lớn, gây tổn thương phổi.Kết quả này chỉ xảy ra khi sức đề kháng của vật chủ yếu đi Mặc dù cơ chếsinh bệnh tụ huyết trùng lợn chưa được nghiên cứu đầy đủ, nhưng những

dẫn chứng hiện có đã chỉ ra rằng vi khuẩn P multocida gây bệnh tụ huyết

trùng lợn bằng các yếu tố có sẵn

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978b)[25] vi khuẩn P multocida phân

lập từ bệnh phẩm lợn bị tụ huyết trùng thường có giáp mô mỏng thể hiệndung quang rõ Nhưng khi cấy chuyển nhiều lần trên môi trường nhân tạogiáp mô biến mất, dung quang không rõ thì độc lực cũng giảm Vì vậy,nhiều tác giả cho rằng giáp mô là yếu tố gây bệnh thông qua việc giúp cho vikhuẩn tránh được hiện tượng thực bào và các yếu tố phòng vệ không đặchiệu của vật chủ Mặt khác, hiện tượng bám dính, cơ chế gây bệnh của vikhuẩn này cũng đã được một số tác giả nghiên cứu như Trigo (1989)[92] đã

xác định được yếu tố bám dính của P multocida type D và A phân lập từ lợn

bị bệnh tụ huyết trùng và chứng minh chúng bám dính trên tế bào nuôi cấy,

nhưng gây bệnh trong tự nhiên thì P multocida type A chỉ bám dính trên tế

bào biểu mô không có nhung mao Vì vậy, mỗi type đều có vị trí bám trêncác tổ chức có tế bào biểu mô khác nhau dẫn đến đường xâm nhập, thể bệnhgây ra cũng khác nhau

1.2.2 Chất chứa và độc tố của vi khuẩn P multocida

Vi khuẩn P multocida thường tồn tại trong cơ thể gia súc khỏe mạnh và

cư trú ở niêm mạc đường hô hấp trên, trong niêm mạc mũi, nước mũi và cókhi trong ruột Vì thế, có thể phân lập vi khuẩn này từ vòm khẩu cái và hạchnhân của gia súc khỏe Ở những gia súc này có hiện tượng mang trùng vàliên tục thải vi khuẩn ra ngoại cảnh qua đường hô hấp, nguồn vi khuẩn phânlập được bằng cách nuôi cấy các hạch lympho lấy từ lò mổ hay từ các dịch tiết

ở mũi, hầu (Omar và cs, 1982)[78] Trong cơ thể con vật bị bệnh ở thể quá cấp

tính và cấp tính vi khuẩn P multocida có nhiều trong máu, tủy xương, gan,

lách, phổi, tim và các chất bài tiết đều có chứa vi khuẩn Mầm bệnh còn cótrong các dịch rỉ, dịch trào ra ở hầu hết các mô và cơ quan do kết quả củanhiễm trùng máu giai đoạn cuối (Carter, 1989 )[55] Trong xác chết, vi khuẩn

có thể tồn tại lâu trong tủy xương, do vậy khi gia súc đã chết lâu ngày mà nghibệnh tụ huyết trùng thì bệnh phẩm tốt nhất là xương ống Con vật mắc bệnh

ở thể mãn tính, vi khuẩn có trong khớp bị viêm, ở gan và lách Ackemann

và cs, (1994)[42] cho rằng hạch nhân là nơi P multocida thường tập trung

nhiều nhất, có vai trò gây bệnh viêm khí quản, viêm phổi, viêm màng phổi

1.2.3 Tuổi mắc bệnh của gia súc

Bệnh tụ huyết trùng xảy ra ở mọi lứa tuổi của gia súc, theo các tác giảthì gia súc non đang bú mẹ ít mắc hơn những con trưởng thành, gia súc sau caisữa dễ mắc bệnh hơn gia súc già Các giống lợn đều mắc bệnh THT, bệnhthường xảy ra ở lợn 3 - 6 tháng tuổi Võ Văn Hùng (1997)[10] khi nghiên cứubệnh tụ huyết trùng ở Đắk Lắk cho biết lợn ở lứa tuổi 3 - 4 tháng mẫn cảmnhất với bệnh Theo Bùi Quý Huy (1998)[11] lợn dưới 2 tháng tuổi ít mắcbệnh hơn

Ở một số nước châu Á những con vật non dễ cảm nhiễm hơn nhữngcon vật trưởng thành (De Alwis, 1999)[58] Cao Văn Hồng (2002)[9] khi

nghiên cứu về bệnh THT gia súc ở Đắk Lắk cho biết ở lợn từ 3 -10 tháng tuổi

có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất 4,62%, còn lợn trên 10 tháng tuổi có tỷ lệ mắcbệnh thấp, chiếm 2,08%.

1.2.4 Mùa vụ phát bệnh

Bệnh tụ huyết trùng ở gia súc phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết,khí hậu Mustafa và cs (1978)[74] khi nghiên cứu về ảnh hưởng của mùa vụ tớibệnh tụ huyết trùng đã nhận xét, bệnh thường liên quan đến điều kiện khí hậu

ẩm ướt

Ở Việt Nam, bệnh xảy ra quanh năm nhưng thường xảy ra vào cáctháng mưa nhiều Nguyễn Vĩnh Phước (1978a)[24], (1978b)[25] cho rằng khibắt đầu mùa mưa, khí hậu nóng ẩm thì bệnh lây lan và phát thành dịch Đặcbiệt là sau những trận mưa đầu mùa mang đến, những thay đổi về sức khỏe dogia súc bị lạnh

Theo Yeo và Mukhtar (1992)[95] khi nghiên cứu dịch tễ học bệnh THTphải quan tâm đến điều kiện thời tiết, khí hậu và địa lý của từng vùng vìnhững yếu tố này ảnh hưởng đến sự tồn tại và phát triển của mầm bệnh trongmôi trường sinh sống của động vật cảm nhiễm

Carter và De Alwis (1989)[55] nhận xét bệnh THT xảy ra quanh nămsong tập trung vào các tháng mưa, ẩm Ở Lào bệnh phát ra từ tháng 5 đếntháng 8; ở Pakistan bệnh xảy ra rải rác quanh năm song thường ở tháng 4 đếntháng 6 hàng năm (FAO, 1991[61]) Ở đảo Java (Indonesia) bệnh xuất hiệnvào cuối mùa khô, đầu mùa mưa (Natalia và cs, 1992)[77], bệnh xảy ra cáctháng 8, 9 ở Malaysia (Yeo và Mukhtar, 1992)[95] Ở Campuchia, bệnh xảy ravào cuối mùa nóng (Kral và cs, 1992)[70]

Ở những vùng ngập lụt sau khi nước rút đi, cỏ bị dính bùn và thối, nênbệnh thường phát sinh vào các tháng có mưa nhiều và chuyển mùa (ĐoànThị Băng Tâm, 1987)[31], Dương Thế Long (1995)[14], Nguyễn Xuân Bình(1996)[1], Nguyễn Thiên Thu (1996)[35], Võ Văn Hùng (1997)[10], đều cho

rằng vào thời gian mưa, bệnh xảy ra nhiều Bùi Quý Huy (1998)[11] cho biết

ở miền Bắc bệnh có quanh năm nhưng tập trung vào các tháng mưa nhiều từtháng 7 đến tháng 9 Ở miền Nam bệnh xảy ra mạnh sau khi mưa và nắng từtháng 4 đến tháng 10 Từ tháng 7 đến tháng 9 số ở dịch chiếm tới 78% trongtổng số các ổ dịch sảy ra trong năm Đỗ Văn Được (1999)[5] cho biết ở LạngSơn bệnh xảy ra mạnh từ tháng 4 đến tháng 8, tháng 9, bệnh xảy ra nhiều đốivới gia súc chưa được tiêm phòng vac-xin Bùi Xuân Đồng (2000)[3] nghiêncứu bệnh THT trâu, bò ở Hải Phòng cho thấy bệnh bắt đầu vào tháng 4, đỉnhcao là tháng 6 và tháng 7 Theo Bùi Văn Dũng (2000)[4] cho biết ở Lai Châubệnh THT xảy ra quanh năm nhưng tập trung vào tháng 3, tháng 4, tháng 7,tháng 8 và vào cuối mùa khô, đầu mùa mưa Cao Văn Hồng (2002)[9] chobiết mùa dịch THT ở Đắk Lắk từ tháng 5 đến tháng 9, đây là những thángmưa nhiều Theo Hoàng Đăng Huyến (2004)[12] bệnh THT xảy ra ở BắcGiang từ tháng 4 đến tháng 9 háng năm, thời gian này đang là mùa mưa Cũngtheo Nguyễn Văn Minh (2005)[15] bệnh THT xảy ra rải rác quanh nămnhưng tập trung từ tháng 3 đến tháng 8, vào các tháng đầu mùa mưa đến cuốimùa mưa của vụ hè thu, cao nhất là tháng 5 và tháng 6, đây là những thángnắng, nhiệt độ, ẩm độ cao và mưa nhiều.

1.2.5 Vùng phát dịch

Theo Phan Đình Đỗ và Trịnh Văn Thịnh (1958)[2] bệnh thường xảy ra

ở những vùng ẩm thấp, khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều, đặc biệt là vào đầu mùamưa Điều kiện tự nhiên, khí hậu và phương thức chăn nuôi cũng ảnh hưởngđến quá trình phát sinh và lây lan bệnh Đặc biệt là ở những vùng đất trũng, ẩmthấp, lầy lội, bị ngập lụt, có nhiều ruộng nước, nhiều kênh rạch, bệnh thườngxảy ra và lây lan mạnh, làm chết nhiều gia súc

Đoàn Thị Băng Tâm (1987)[31], Nguyễn Ngã (1996)[17] cho biết bệnhnày phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện tự nhiên, kinh tế, xã hội Theo Võ VănHùng (1997)[10] bệnh xảy ra ở vùng có địa hình phức tạp như núi cao, đầm

lầy, trình độ dân trí thấp, tập quán chăn nuôi lạc hậu Năm 1990, riêng 3 tỉnhSơn La, Hoàng Liên Sơn, Bắc Thái số ổ dịch THT gia súc chiếm 60% vàtrong đó có tới 70% số gia súc chết so với toàn miến Bắc (Bùi Quý Huy,1998)[11] Đỗ Văn Được (2003)[5] cho biết ở Lạng Sơn vùng núi đất có độdốc lớn, nhiệt độ thấp, độ ẩm cao, tập quán chăn nuôi còn lạc hậu, chăn thả tự

do thì tỷ lệ bị nhiễm bệnh và chết cao Theo Hoàng Đăng Huyến (2004)[12]

ở Bắc Giang những vùng đồi núi thấp, tỷ lệ mắc bệnh THT và chết cao.Nguyễn Văn Minh (2005)[15] thông báo ở Hà Tây tỷ lệ trâu, bò ốm chết vìbệnh THT ở vùng đồi, bán sơn địa cao hơn so với vùng chiêm trũng và vùngđồng bằng

Ở những vùng phương thức chăn nuôi còn chăn thả rông, không cóngười chăm sóc, không làm chuồng nuôi nhốt, để gia súc ở những nơi bùnlầy, ngập nước không dọn phân thường xuyên, công tác vệ sinh thú y, chămsóc nuôi dưỡng gia súc kém thì khả năng xảy ra bệnh cao Ngoài ra trình độnhận thức của người dân về công tác phòng chống bệnh chưa cao, việc ápdụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào việc phòng chống dịch bệnh còn nhiềukhó khăn thì cũng không tránh khỏi việc dịch bệnh thường xuyên sảy ra

1.2.6 Hiện tượng mang vi khuẩn P multocida ở đường hô hấp trên của

động vật khỏe Nguồn lây lan bệnh tạo các ổ dịch tụ huyết trùng

Từ khi phát bệnh tụ huyết trùng do P multocida gây ra đến nay đã hơn

100 năm, có khá nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn P multocida, về bệnh học Pasteurellosis và vac-xin tiêm phòng bệnh nhưng vẫn không loại trừ

và thanh toán được bệnh, đặc biệt là những nước nhiệt đới, bệnh tụ huyếttrùng vẫn là mối đe dọa cho người chăn nuôi

Hiện tượng mang vi khuẩn P multocida ở động vật sống đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu Gupta (1962)[63] đã phân lập được P multocida

type Robert F ở đường hô hấp của lợn khỏe

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1970)[23] trong đàn gà thường xuyên cómầm bệnh tụ huyết trùng, tỷ lệ gà khỏe mang trùng lên tới 20 - 30%, còn đàn

gà không bị bệnh thì không có gà khỏe mang trùng Ảnh hưởng của đàn

gà khỏe mang trùng đến đàn gà nuôi có xảy ra dịch hay không vẫn chưa được

làm rõ và tác giả có nhận xét rằng khi gia súc mang vi trùng P multocida đây cũng chính là nguồn reo rắc mầm bệnh ra môi trường, vi khuẩn Pasteurella

xâm nhập vào các con khỏe gây nên các ổ dịch

Mustafa (1978)[74] đã tiến hành lấy dịch ngoáy mũi trâu, bò để phân

lập P multocida và có nhận xét thường ở nơi không có dịch tụ huyết trùng

trâu bò, thì tỷ lệ trâu bò khỏe mạnh mang trùng là 3%, còn ở nơi có dịch tụhuyết trùng trâu bò tỷ lệ mang trùng là 44,4%

Gupta (1980)[64] nghiên cứu bệnh THT ở Ấn Độ thấy tỷ lệ mang trùng

ở trâu bò khỏe trong vùng không có dịch là 0%, ở vùng ít xảy ra dịch là 1,9%,còn ở vùng dịch hay xảy ra 5 - 6% Ngay ở các vùng có dịch thì tỷ lệ mangtrùng ở đàn trâu bò khỏe mạnh cũng giảm dần theo thời gian sau khi dịch chấmdứt

Theo Hiramune (1982)[67] tỷ lệ trâu bò khỏe mang trùng giảm nhanh

từ 22% ở tuần lễ đầu, sau 6 tuần của vụ dịch giảm xuống còn 1,9% và vikhuẩn này có thể tồn tại đến 8 tháng

Nguyễn Vĩnh Phước (1986a)[26] cho biết tỷ lệ mang trùng ở đường

hô hấp trên của trâu bò khỏe ở các tỉnh phía Nam là 5,61% Ở miền TrungTây Nguyên là 1,0 - 9,4% Tương tự như ở trâu bò, thì có 4,1% tỷ lệ lợn

khỏe mang vi khuẩn Pasteurella Theo Wijewardana (1992)[94] trong các

đàn động vật khoẻ mạnh luôn có một tỷ lệ cá thể mang vi khuẩn

Pasteurella ở đường hô hấp trên.

Theo Phan Thanh Phượng (1994)[27] khi gia súc mang vi khuẩn

Pasteurella hoặc nó sẽ gây bệnh cho vật chủ khi vật chủ chịu tác động của các

yếu tố strees làm cho sức đề kháng của cơ thể giảm.

Cao Văn Hồng (2002)[9] cho thấy tỷ lệ trâu bò và lợn mang

P.multocida ở đường hô hấp khi điều tra ở Đắk Lắk là 14,79% và 11, 61% và

sau 6 tháng có dịch thì tỷ lệ này lên tới 21,43%

1.2.7 Đặc tính sinh học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ

huyết trùng

1.2.7.1 Đặc tính chung

Pasteurella multocida gây bệnh bại huyết, xuất huyết cho gia súc ,

gia cầm nên thường gọi là bệnh tụ huyết trùng Trước đây, người ta chia

Pasteurella thành nhiều loại, nhiều chủng theo khả năng thích nghi cho các

loài vật, như Pasteurella aviseptica gây bệnh tụ huyết trùng gà, Pasteurella

boviseptica gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò, Pasteurella suiseptica gây bệnh

tụ huyết trùng lợn, Pasteurella equiseptica gây bệnh bại huyết cho ngựa…

Các loại Pasteurella gây bệnh cho động vật có những đặc tính chung

căn bản giống nhau về mặt hình thái và nuôi cấy, nhưng tác động gây bệnhthay đổi tuỳ theo loài vật, đó là điểm chủ yếu để phân biệt các loại

Pasteurella với nhau.

Vấn đề đặt ra là các loại Pasteurella có phải thuộc một giống duy nhất

hay không, những vi khuẩn tụ huyết trùng phân lập từ trâu, bò, lợn, gà có một

số đặc điểm chung của giống Pasteurella và chỉ khác nhau ở chỗ thích nghi đối với một loài vật Pasteurella của gà thì độc đối với gà, nhưng không độc đối với lợn Pasteurella của lợn rất giống loại của gà nhưng chỉ độc đối với lợn Trong thực tế, có thể coi tất cả các chủng Pasteurella đều thuộc một

giống gốc duy nhất, tồn tại và gây bệnh cho các loài vật trong tự nhiên, khácnhau nhiều hay ít tuỳ cơ thể mang nó Trong thiên nhiên cũng có trùng hợp

nhiều loài vật cảm nhiễm đối với một loại Pasteurella không phân biệt nguồn

gốc như: Pasteurella của bò có thể gây cho ngựa, lợn Pasteurella của thỏ độc

với thỏ, bồ câu

1.2.7.2 Phân loại vi khuẩn P multocida

Theo Bergey (1974)[47] vi khuẩn P multocida thuộc bộ

Eubacteriales, họ

Pavrobacteriacea, tộc Pasteurellaceae, giống Pasteurella, loài multocida.

Vi khuẩn P multocida thuộc chi Pasteurella, trong P multocida có nhiều loài và chủng vi khuẩn khác nhau Trước kia trong chi Pasteurella còn

có P haemolytica nhưng loài này được xếp vào chi Mannheimia với tên gọi

Mannheimia haemolytica Trong chi Pasteurella thì các vi khuẩn thuộc P.multocida gây nhiều bệnh nguy hiểm cho gia súc, gia cầm và làm thiệt hại

kinh tế chung cho nghành chăn nuôi

1.2.7.3 Đặc điểm hình thái của P multocida

Theo Smith (1959)[89] vi khuẩn P multocida có sự thay đổi phụ thuộc

vào nguồn gốc của chúng, vi khuẩn phân lập từ bò có kích thước đồng nhất từ0,5 - 1,2 µ, trong khi đó vi khuẩn phân lập từ lợn có dạng tròn hơn, kích thước0,8 - 1,0 µ

Vi khuẩn P multocida có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, ngắn, hình trứng,

hình cầu hay bầu dục, có kích thước 0,6 - 2,5 x 0,2 - 0,4µ Vi khuẩn có thểđứng riêng lẻ, thành đôi hoặc chuỗi, có giáp mô, không sinh nha bào, không

có lông, không di động và bắt màu lưỡng cực Ở các tiêu bản động vật mới

chết P multocida là vi khuẩn Gram âm, dễ bắt màu với thuốc nhuộm Fucxin hoặc xanh Methylen Tính chất bắt màu lưỡng cực của P multocida có thể

thấy khi nhuộm bằng xanh Methylen và chỉ thấy ở những tiêu bản làm từ máuđộng vật hay vi khuẩn phân lập từ những bệnh phẩm từ con vật mới chết Vikhuẩn nuôi cấy trong môi trường nhân tạo ít thấy tính chất này, nguyên nhânnày là do trong quá trình phân bào, nguyên sinh chất bắt màu lưỡng cực dồn

về hai đầu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Theo Carter (1952)[49] trong môi trường nước thịt P multocida mọc

tốt làm đục môi trường có mùi tanh đặc trưng Mùi tanh đặc trưng này thểhiện rõ nhất ở pha phát triển nhanh, khi nuôi cấy vi khuẩn lâu ngày mùi tanh

này sẽ mất dần Cater (1955)[50] cho biết khuẩn lạc của vi khuẩn P.multocida

tập trung ở hai dạng chính là khuẩn lạc có dung quang sắc cầu vồng và khuẩnlạc có dung quang màu xanh Những khuẩn lạc có dung quang màu xanhthường ít hoặc không có giáp mô, độc lực thấp hoặc không có độc lực thuộcdạng R (Rough)

Trong môi trường nuôi cấy, không phát sinh ra quá trình dung giảinguyên sinh chất ở giữa tế bào vi khuẩn nên không thấy vi khuẩn bắt màu xẫm

ở hai đầu (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001[33] và Nguyễn Quang Tuyên,2008[40])

Trong mô bào và máu động vật mắc bệnh, các tế bào vi khuẩn thườngđồng nhất Trong môi trường nhân tạo, các tế bào vi khuẩn thường đa dạng cóthể hình trứng, hình cầu hoặc hình que

P multocida không di động, không tạo nha bào nhưng có giáp mô Vi

khuẩn có giáp mô nuôi lâu ngày trong môi trường nhân tạo thì giáp mô sẽmất, nếu được cấy chuyển nhiều lần trong môi trường có bổ sung máu thì giáp

mô của nó sẽ được tái tạo Vi khuẩn có giáp mô thường có kích thước lớn hơn

vi khuẩn không có giáp mô

Vi khuẩn bắt màu với 2 loại thuốc nhuộm aniline hòa tan thông thường.Tính chất bắt màu lưỡng cực (Bipolar-straining) có thể thấy khi nhuộm bằngxanh Methylen với những tiêu bản làm từ máu, tế bào động vật hay vi khuẩnmới phân lập Vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường nhân tạo ít thấy tính chấtnày Sở dĩ có tính chất lưỡng cực là do tế bào vi khuẩn đang phân chia,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

nguyên sinh chất của vi khuẩn dung giải về hai đầu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.2.8 Đặc điểm nuôi cấy

Pasteurella multocida là loại vi khuẩn sống hiếu khí hay yếm khí tuỳ

tiện, rất dễ nuôi cấy trong các môi trường nhân tạo với độ pH = 7,2 - 7,4, nuôicấy ở nhiệt độ thích hợp 37 - 38oC trong tủ ấm

Vi khuẩn P multocida phát triển tốt trong hầu hết các loại môi trường dinh dưỡng thông thường Môi trường dùng để nuôi cấy P multocida có thể

là môi trường đặc, lỏng hoặc bán lỏng

Theo Namioka và Murata (1961a)[75] cho biết môi trường phân lập

P.multocida là môi trường thạch có thêm 5 - 10 % huyết thanh thỏ hoặc ngựa.

Còn môi trường nuôi cấy và thu hoạch kháng nguyên là môi trường YPCthạch Khi giữ giống tươi thì có thể dùng môi trường này đậy nút kín để ở 4oCgiữ được 2 - 3 tuần Để đông khô giữ giống thì dùng môi trường YPC khôngcho thạch mà thêm Sucrose 1,0 g, sodium glutamic 1,0 g Giống vi khuẩntrong ống đông khô có thể giữ được 10 năm

Nuôi cấy vi khuẩn P multocida trên môi trường thạch máu sẽ ức chế

xuất hiện các biến thể Một số nghiên cứu còn cho thấy có thể thay thànhphần máu bằng các chất khác như Haematin, Catalase, Sodium sulfite và một

số chất khác có đặc tính xúc tác phân hủy H2O2 Vi khuẩn P multocida cũng

mọc tốt trong môi trường nước thịt, sau 24h làm đục môi trường và canhtrùng thuần khiết có mùi tanh đặc trưng, vài ngày sau nước thịt trở nên trong,đáy có cặn nhày, lắc khó tan, trên mặt môi trường có lớp màng mỏng khi lắclớp màng này vỡ ra Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn là 37OC, pH trongkhoảng 7,2 - 7,4 Trong môi trường nuôi cấy nếu có thêm huyết thanh hoặcmáu thì vi khuẩn sẽ mọc tốt hơn

Peter và cs (1996)[80] sử dụng môi trường dinh dưỡng tối thiểu nuôi

cấy chủng sinh độc tố và không sinh độc tố của P multocida Môi trường này

gồm 17 thành phần, trong đó có cystein, glutamic acid, leucine, methionine,muối vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine, đường…

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Trong đó leucine có tác dụng kích thích tăng trưởng và thiamine có thểthay thế bằng adenine (Jablonski và cs, 1996)[69]

Trong các loại môi trường dùng để bảo quản mẫu bệnh phẩm chứa

P.multocida thấy vi khuẩn này có thể duy trì sự sống được trong môi trường

Cary - Blair và L-15 (Leubovitz medium No 15) hơn 15 ngày ở điều kiệnnhiệt độ phòng, tuy nhiên sử dụng Cary-Blair làm môi trường vận chuyển(transport medium) thì sẽ tốt hơn, còn môi trường L-15 thích hợp hơn khi bảoquản vi khuẩn này trong phòng thí nghiệm (Eiichi, 1997)[60]

Khi nghiên cứu các dạng khuẩn lạc của P multocida cho thấy chủ yếu

hai dạng là dạng có dung quang màu xanh và dạng có dung quang sắc cầuvồng Những khuẩn lạc có dung quang màu xanh thường không có hoặc ít cógiáp mô, vì thế không có độc lực hoặc độc lực thấp Các chủng cường độc

hoặc mới phân lập có dung quang mạnh Khi tiêm truyền các chủng P.

multocida qua bồ câu thấy có sự tăng lên của những vi khuẩn tạo khuẩn lạc

dạng S (Smooth)

- Môi trường thạch thường: Sau 24 giờ nuôi cấy P multocida phát triển

thành khuẩn lạc nhỏ long lanh như hạt sương, để lâu ngày thì kích thướckhuẩn lạc sẽ lớn hơn Khi cấy chuyển nhiều lần giáp mô bị mất, kích thướckhuẩn lạc sẽ nhỏ lại Trên môi trường thạch vi khuẩn phát triển thành 3 dạngkhuẩn lạc:

+ Dạng S (Smooth) là dạng thường thấy, khuẩn lạc nhỏ, bóng láng longlanh, mặt vồng, có dung quang sắc cầu vồng, khuẩn lạc có huỳnh quang, cótính kháng nguyên và độc lực cao Vi khuẩn thuộc dạng khuẩn lạc này thườngtạo thành lớp giáp mô

+ Dạng R (Rough): Là dạng biến dị, khuẩn lạc thường to dẹt, rìa nhám

xù xì, có dung quang màu xanh lơ, có tính kháng nguyên và độc lực thấp

+ Dạng M (Mucoid): Là dạng biến dị, khuẩn lạc nhày ướt, rìa nhẵn, cókích thước to nhất, dung quang sắc cầu vồng yếu hơn ở dạng S và độc lực

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

thấp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Tính biến dạng của vi khuẩn này rất lớn khi nuôi cấy chuyển qua môitrường dinh dưỡng nhiều lần hoặc tiêm qua động vật, từ dạng S chúng có thểchuyển thành dạng M hoặc R và ngược lại

- Trên môi trường thạch máu: Vi khuẩn phát triển mạnh không làmdung huyết, khuẩn lạc phát triển mạnh hình tròn to có kích thước lớn hơnthạch thường, có màu xanh tro nhạt hình giọt sương và có mùi tanh nước rãikhô rất đặc trưng Đặc điểm này dễ nhận ra và được nhiều tác giả công nhậnnhư một đặc điểm để chẩn đoán

- Trên môi trường thạch có bổ xung huyết cầu và huyết thanh: Đây làmôi trường đặc biệt dùng để phân lập, giám định và xác định độc lực của vi

khuẩn, ở môi trường này vi khuẩn P multocida phát triển thành khuẩn lạc đặc

biệt có hiện tượng phát dung quang khi quan sát vi khuẩn trên kính hiển vi độphóng đại 20 lần và góc chiếu sáng phản quang của ánh sáng đèn điện là 45o.Màu sắc phát quang của khuẩn lạc phụ thuộc vào độc lực của vi khuẩn: vikhuẩn có độc lực cao màu xanh lá mạ chiếm 2/3 diện tích khuẩn lạc, còn 1/3diện tích khuẩn lạc có màu vàng da cam, khuẩn lạc này gọi là Fg (GreenishFluorescent) Vi khuẩn có độc lực trung bình thì diện tích khuẩn lạc có màuxanh lá mạ ít hơn diện tích màu vàng da cam, khuẩn lạc này gọi là Fo (OrangeFluorescen), còn vi khuẩn có độc lực yếu, khuẩn lạc của chúng không có hiệntượng phát quang, gọi là Nf (Not Fluorescent)

Vi khuẩn P multocida khi mới phân lập từ bệnh phẩm, tổ chức hoại tử

bắt màu lưỡng cực và có giáp mô nếu có dung quang mạnh Các tính chất này

sẽ thay đổi cùng với số lần cấy chuyển trên môi trường nhân tạo, nhưng sẽđược phục hồi khi tiêm truyền qua động vật thí nghiệm hoặc động vật mẫncảm

Một tính chất quan trọng là hình thái và màu sắc cầu vồng của khuẩn

lạc P multocida nhìn qua ánh sáng điện xiên 45o: Khi mới phân lập, khuẩnlạc có cầu vồng mạnh hoặc yếu hay có hình rẻ quạt với màu biến đổi hoặc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

khuẩn lạc có màu xanh ít hay không màu

Màu của khuẩn lạc P multocida thường liên quan đến giáp mô của vi

khuẩn Từ dạng có giáp mô trong canh khuẩn tươi, khuẩn lạc có dung quang,sau vài lần nuôi cấy giáp mô mất dần, khuẩn lạc nhỏ và dung quang kém, khikhuẩn lạc chứa chất nhày thì dung quang càng kém hơn, độc lực của vi khuẩngiảm dần từ dạng S đến dạng R

Sau khi nuôi cấy vi khuẩn P multocida phát triển thành những khuẩn

lạc đặc biệt, có hiện tượng phát huỳnh quang khi quan sát bằng kính hiển vivới ánh sáng đèn điện góc chiếu phản quang là 45o thấy có 3 loại khuẩn lạc.Tùy theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc của khuẩn lạc khác nhau

Loại Fg (Greenish fluorescent): 2/3 khuẩn lạc có màu xanh lơ, 1/3 cómàu da cam, khuẩn lạc hình tròn, rìa gọn, mặt vồng và có độc lực cao

Loại Fo (Orange fluorescent): màu xanh lơ ít và vàng da cam nhiều,những khuẩn lạc này độc lực tương đối yếu

Loại Nf (Not fluorescent): khuẩn lạc độc lực yếu nhất, không màu,không có huỳnh quang, khuẩn lạc dạng S, nhỏ, trong

Cách xem huỳnh quang của khuẩn lạc trên chỉ áp dụng cho Pasteurella gây bệnh ở lợn và trâu bò, nhưng không áp dụng cho Pasteurella gây bệnh ở gia cầm Pasteurella aviseptica gây bại huyết, xuất huyết cho gia cầm có độc

lực mạnh nhưng khuẩn lạc của chúng thuộc loại Fo

Hiện tượng phát huỳnh quang của khuẩn lạc xem rõ khi nuôi cấy vikhuẩn trong môi trường thạch trong sáng, khuẩn lạc cách xa nhau sau 24 giờ,nếu để lâu sau 72 giờ thì huỳnh quang sẽ mất đi Vi khuẩn loại Fg có thể biến

dị thành vi khuẩn dạng Fo hay loại Nf, đi đôi với sự biến dị của khuẩn lạc thìđộc lực của vi khuẩn cũng phát sinh biến dị

- Môi trường Gelatin: Hình thành khuẩn lạc mịn, hình hạt dọc theođường cấy chích sâu, không làm gelatin tan chảy

- Môi trường huyết thanh đông: Vi khuẩn phát triển thành những khuẩnlạc hình giọt nước nhỏ, trong suốt trên mặt thạch.

- Môi trường cho thêm Neomycine 2,5 mg/lit, có tác dụng ngăn chặn sự

phát triển của P pseudotubeculosis và cho phép P multocida phát triển Trên

môi trường thạch huyết cầu tố và huyết thanh vi khuẩn mọc tốt hơn (NguyễnVĩnh Phước, 1964)[22] Trong môi trường nước thịt Hottinger hoặc Martinsau khi nuôi cấy 24 giờ, vi khuẩn phát triển làm môi trường đục nhẹ, khi lắcnhẹ có vẩn như sương mù sau đó mất, nếu để quá 24 giờ dưới đáy có lắng cặnnhày và bên trên có màng mỏng (Cater, 1967)[52] Theo Rhoades và cs

(1992)[82] hình thái kích thước của P multocida thường thay đổi trong quá

trình nuôi cấy, nếu nuôi cấy trong những điều kiện không thuận lợi hoặc cấychuyển nhiều lần trên môi trường thì tế bào vi khuẩn sẽ có kích thước nhỏ lại

và có hình thái đa dạng Thomson và cs (1992)[90] cho biết môi trườngBactotryptose ở 15oC và 37oC trong vài tháng vi khuẩn vẫn còn sinh độc tố

Một số chủng P multocida còn có pili trên bề mặt, vai trò của những cấu trúc

này trong việc bám dính đã được nghiên cứu, đa phần các vi khuẩn

P.multocida gây bệnh viêm teo mũi lợn có pili (chiếm 60 - 80%), tuy nhiên

khi cấy các vi khuẩn này ở invitro thì số lượng vi khuẩn có pili giảm đi rấtnhiều, chỉ còn từ 3 - 5% (Richard và Emilio, 1995)[83]

Theo Hoàng Đạo Phấn (1996)[20] để giữ giống P.multocida tươi cần

cấy chuyển vi khuẩn qua thạch máu vì vi khuẩn mới được phân lập mọc tốttrong các môi trường nuôi cấy thông thường nhưng khi nuôi cấy chuyển tiếp

sẽ mọc yếu, vì vậy phải cho thêm hồng cầu vào môi trường nuôi cấy Nếu

phân lập trong bệnh phẩm thì P multocida thường có hình trứng, hình cầu,

trực khuẩn hoặc hình thành chuỗi ngắn Nuôi cấy trong môi trường nhân tạo

trước 24 giờ, P multocida có dạng cầu khuẩn đứng riêng rẽ hay thành đôi.

Ngoài ra, hình thái của P multocida còn thay đổi tùy theo sự hình

thành giáp mô, kích thước của vi khuẩn có giáp mô thường lớn hơn vi khuẩnkhông có giáp mô Vi khuẩn thoái hóa nhanh sau khi phân lập và nuôi giữtrên môi trường dinh dưỡng, khi nuôi cấy trên môi trường thạch thường ở

37oC sau 24 giờ P mutocida phát triển thành khuẩn lạc nhỏ long lanh như hạt

sương, hơi lồi ở giữa, để lâu khuẩn lạc to màu trắng đục

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn P multocida để làm vac-xin người ta

thường sử dụng môi trường cơ bản có thêm Saccarore, peptone và chất chiết

men bia Môi trường Hottinger cũng tốt cho P multocida phát triển Nuôi cấy

có sục khí (aeration) có thể làm tăng sinh khối vi khuẩn lên gấp 20 lần so vớinuôi cấy tĩnh Sục khí bằng hỗn hợp khí có tỷ lệ CO2 và O2 khác nhau cũngtác dụng như sục khí bằng không khí thông thường, nhưng nếu sục khí bằngoxy nguyên chất sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn Nuôi cấy động trên máylắc vi khuẩn cần 12 giờ để đạt đến pha dừng, còn nuôi cấy sục khí khuấy đảoliên tục trong fermentor bằng công nghệ lên men hiện đại thì chỉ cần 5 giờ đãđạt mức phát triển tối đa Trong môi trường Hottinger có bổ xung thêm

đường, tụy đệm thì vi khuẩn P multocida chủng P52 phát triển mạnh và có

thể đạt tới nồng độ 50 tỷ CFU/ml (Trần Đình Từ và cs, 2000)[38]

Nếu nuôi cấy tĩnh P multocida sẽ phát triển theo 4 pha phát triển chậm

(pha thích nghi) kéo dài từ khi nuôi cấy đến giờ thứ 8, pha phát triển (phalogrit) bắt đầu từ giờ thứ 8 đến 14, pha cân bằng bắt đầu từ giờ 14 đến giờ 19,sau đó là pha suy tàn

Trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, các gen liên quan tới quá trìnhtrao đổi chất của vi khuẩn hoạt động mạnh (Shivachandra và cs, 2006)[88]

Một số phòng thí nghiệm đã thử nghiệm nuôi cấy P multocida trong

nhiều loại môi trường có thêm một số chất, kết quả thu được rất đáng khích lệ,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

tuy nhiên chất lượng vi khuẩn (kháng nguyên) nuôi cấy trong các môi trườngkhác nhau thì có thể khác nhau Nồng độ vi khuẩn trong một số môi trường rấtcao nhưng hoạt tính huyết thanh học của vi khuẩn có thể bị thay đổi

1.2.9 Đặc tính sinh hoá của vi khuẩn P multocida

Có nhiều công trình nghiên cứu về đặc tính sinh hóa của P multocida, trong môi trường đường: Vi khuẩn P multocida lên men nhưng không sinh hơi

đường glucoza, saccaroza, mannit, sorbit, xyloza Lên men bất thường:mannoza, galactoza, levuloza và không lên men lactoza, arabinoza,salixin, dunxit, adonit Khả năng lên men saccaroza, không lên men lactoza là

rất quan trọng để kiểm nghiệm và phân biệt P multocida với các vi khuẩn khác như vi khuẩn Salmonella (không lên men saccaroza), vi khuẩn E.coli (lên

men lactoza)

Theo Lignieres (1900)[72] đã nghiên cứu thấy rằng P multocida không

làm tan chảy Gelatin, không phân giải đường lactose và sinh Indol Tác giả đã

Rosenbusch và Merchant (1939)[87] đã nghiên cứu sự lên men đường

xyloes, arabinose và dunxit của P multocida và cũng chia làm 3 nhóm:

+ Nhóm 1: Gồm các chủng P multocida phân lập từ gia cầm, có khả

năng lên men đường arabinoza, dunxit, không lên men xyloza

+ Nhóm 2: Gồm các chủng P multocida phân lập từ động vật có vú, có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

khả năng lên men đường xyloza, không lên men arabinoza và dunxit