LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Bệnh thán thư trên dưa hấu ( Colletotrichum lagenarium)
Tên khoa học: Citrullus lanatus [Thumb.] Matsum & Nakai
Dưa hấu là loại cây trồng có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới Trung Phi, phía Bắc sa mạc Sahara Loại trái cây này đã được du nhập vào Trung Quốc và Nga vào thế kỷ 10 sau Công Nguyên, và đến Anh vào năm 1600 Hiện nay, dưa hấu được trồng rộng rãi ở các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Dưa hấu, một loại trái cây truyền thống của Việt Nam, đã được trồng từ thời vua Hùng Vương thứ 18 (Trần Khắc Thi, 1999) và trở thành món ăn không thể thiếu trong ngày Tết cổ truyền của người dân (Trần Thị Ba và ctv., 1999).
Theo FAO (2008), tổng sản lượng dưa hấu toàn cầu đạt khoảng 99 triệu tấn hàng năm, trồng trên diện tích 3.753.000 ha Tại Việt Nam, sản lượng dưa hấu khoảng 420.000 tấn với diện tích trồng 28.000 ha Đồng bằng sông Cửu Long là khu vực chủ yếu trồng dưa hấu ở Việt Nam, đặc biệt tập trung tại các tỉnh Tiền Giang, Cần Thơ và Trà Vinh.
1.2 BỆNH THÁN THƯ TRÊN DƯA HẤU DO NẤM Colletotrichum lagenarium
Nấm Colletotrichum lagenarium có khả năng tấn công mọi bộ phận của cây, bao gồm lá, thân và trái Bệnh này có thể xuất hiện ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây, từ giai đoạn đầu đến giai đoạn trưởng thành.
Vết bệnh ở lá thường xuất hiện gần gân lá, có hình dạng hơi tròn hoặc bất định Những đốm bệnh này có màu nâu hoặc đen, kích thước từ 3-10 mm, và khi bệnh nặng hơn, vết bệnh có thể lớn tới 1-2 cm Lá bị bệnh nặng sẽ xuất hiện nhiều đốm, trở nên nhăn, khô và rách do sự kết hợp của nhiều vết bệnh Trong điều kiện ẩm ướt, lớp bào tử hồng có thể được nhìn thấy tại các vết bệnh Bệnh lây lan nhanh chóng, khiến lá cháy khô và rụng.
Vết bệnh ban đầu trên thân cây xuất hiện dưới dạng những đốm nhỏ màu nâu, sau đó lan rộng và trở nên bất định hoặc có hình thoi (Nguyễn Thị Nghiêm và Võ Thanh Hoàng, 1993) Theo Roberts và Kucharek (2006), trong điều kiện ẩm ướt, vết bệnh sẽ lan nhanh, có hình dạng thon dài và lõm sâu xuống.
Trên trái, vết bệnh có màu hồng, hình tròn hoặc hình thoi, hơi úng nước và lõm xuống Các đốm bệnh phát triển nhanh chóng, phân bố đều khắp vùng vỏ trái, có thể liên kết lại thành các vết thối rộng, với đốm bệnh úng nước có màu nâu đen đến đen, đường kính 1-2cm, có vòng đồng tâm và hơi lõm vào vỏ, kèm theo nứt nẻ và bào tử hồng tại vết bệnh Sự xâm nhiễm qua lá có thể là nguồn lây nhiễm cho trái, dẫn đến sự suy giảm nhanh chóng sức khỏe của trái.
Hình 1.1 Triệu chứng gây hại của Colletotrichum lagenarium trên dưa hấu
(Nguồn: Nguyễn Thị Thu Nga, tài liệu cá nhân) a Trên lá; b Trên thân; c Trên trái; d Bào tử nấm
Theo nghiên cứu của Phạm Hoàng Oanh và cộng sự (2003) tại Đồng Bằng Sông Cửu Long và TP Hồ Chí Minh, bốn chi nấm gây hại chính trên dưa bầu bí bao gồm Colletotrichum, Cercospora, Didymella bryoniae và Fusarium Trong đó, bệnh thán thư do nấm Colletotrichum sp gây hại nặng nhất, chiếm tới 64,2%.
Bệnh thán thư trên dưa hấu, do nấm Colletotrichum lagenarium gây ra, đã được ghi nhận tại Mỹ và có thể dẫn đến thiệt hại nghiêm trọng về năng suất, lên tới 63% (CABI, 2001).
1.2.2.1 Tác nhân và phân loại
Bệnh thán thư trên cây họ bầu bí dưa do nấm Colletotrichum lagenarium gây ra (Agrios, 2005), còn được biết đến với tên gọi Colletotrichum orbiculare (Võ Thanh Hoàng và Nguyễn Thị Nghiêm, 1993; CABI, 2001).
Nấm Colletotrichum lagenarium thuộc bộ nấm đĩa đài Molanconiales của lớp nấm bất toàn Deuteromycetes Giai đoạn sinh sản hữu tính, nấm
Colletotrichum lagenarium thuộc lớp nấm nang Ascomycetes có tên là Glomerella lagenarium Giai đoạn này rất hiếm (Bartnett và Hunter, 1998)
1.2.2.2 Đặc điểm hình thái nấm
Nấm có cấu trúc đĩa đài (acervulus) với các gai cứng (setae) màu nâu, bên trong chứa đính bào đài (conidiophore) và đính bào tử (conidia) Đính bào đài được cấu tạo từ một tế bào hình trụ dài, không màu, có kích thước khoảng 20-25 x 2,5.
3 μm Đính bào tử cũng gồm 1 tế bào hình trụ dài hay hình thoi dài, không màu và kích thước khoảng 14-20 x 5-6 μm (Trần Văn Hai, 2005)
Hình 1.2 Bào tử nấm Colletotrichum lagenarium (Nguồn: Gray, 1996)
Hình dạng của sợi nấm khí sinh có mặt trên màu xám trắng và nâu đen, trong khi khối bào tử có màu hồng với các gai và hạch nấm Mặt dưới của sợi nấm có màu nâu đậm Bào tử có hình dạng thẳng, hình trụ với đỉnh cùn, kích thước dao động từ 14-15 x 4,5.
Đĩa ấm có hình dạng chứ nhật dài hoặc không đều, màu nâu, kích thước từ 9-10 x 5-6 cm (Sutton, 1980; trích dẫn từ Lê Hoàng Lệ Thủy, 2004) Theo Trần Bạch Lan (2010), sợi nấm có đặc điểm mịn, mọc dày đặc và bám sát môi trường Màu sắc của khuẩn lạc thay đổi theo thời gian và điều kiện ánh sáng, bắt đầu từ màu trắng xám và dần chuyển sang nâu sậm, thậm chí đen (Hình 1.3).
Hình 1.3: Hình khuẩn lạc nấm Colletotrichum lagenarium trên đĩa Petri chứa môi trường
PDA ct 11 ngày sau khi cấy
1.2.2.3 Đặc điểm sinh học và sinh thái
Nấm phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ cao và độ ẩm, với nhiệt độ lý tưởng cho sự phát triển của nấm gây bệnh dao động từ 28-30 độ C Trong điều kiện khô, nấm giảm khả năng gây bệnh và không thể xâm nhiễm nếu thời tiết khô kéo dài từ 10-12 ngày (Trần Bạch Lan, 2007) Nấm có khả năng lưu tồn trong đất và hạt giống (CABI, 2001), đồng thời cũng có thể tồn tại trong xác bã thực vật hoặc bám trên bề mặt hạt giống (Trần Văn Hai, 2005).
1.2.2.4 Con đường lan truyền và lưu tồn
Bệnh thường xuất hiện trong các tháng mưa nhiều, với bào tử chủ yếu lây lan qua nước mưa (Trần Văn Hai và ctv., 2005) Ngoài ra, mầm bệnh cũng có thể được truyền từ người sang người hoặc qua các phương tiện cơ học (Roberts và Kucharek, 2006).
PHÒNG TRỪ SINH HỌC VÀ VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN VÙNG RỄ
1.3.1 Khái niệm phòng trừ sinh học
Theo Phạm Văn Kim (2006), biện pháp sinh học trong phòng trị bệnh cây là việc điều chỉnh môi trường, cây trồng và sinh vật đối kháng một cách hợp lý để duy trì sự cân bằng sinh học, từ đó giảm mật độ mầm bệnh xuống dưới mức gây hại Phương pháp này giúp bệnh cây chỉ xuất hiện ở mức độ nhẹ, không gây ảnh hưởng đáng kể về mặt kinh tế Điều quan trọng là biện pháp sinh học không nhằm tiêu diệt hoàn toàn mầm bệnh và cũng không có khả năng thực hiện điều đó.
Theo Agrios (2005), phòng trừ sinh học bệnh cây là phương pháp kiểm soát mầm bệnh bằng cách sử dụng các vi sinh vật tự nhiên, nhằm đạt được hiệu quả kiểm soát hoàn toàn hoặc một phần.
Các biện pháp đối phó với bệnh có liên quan đến vi sinh vật đối kháng đều được xem là biện pháp sinh học (Phạm Văn Kim, 2006)
Theo Kennedy (2005) vùng rễ (rhizosphere) là thể tích đất xung quanh bộ rễ và ảnh hưởng đến bộ rễ
1.3.3 Khái niệm vi khuẩn vùng rễ
Vi khuẩn vùng rễ (rhizobacteria) là các vi khuẩn sống tại vùng rễ cây, có khả năng sinh sôi và định cư trong các ổ sinh thái rễ trong suốt quá trình phát triển của cây Chúng đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và sức khỏe của cây trồng (Antoun và Prévost, 2005).
Khoảng 2 - 5% vi khuẩn vùng rễ khi được đưa vào đất có hệ vi sinh cạnh tranh có tác động tích cực đến sự phát triển của cây, được gọi là vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng cây trồng (PGPR) (Siddiqui, 2006) Theo nghiên cứu của Kloepper và cộng sự (2004), vi khuẩn này không chỉ định cư ở rễ cây mà còn kích thích sự phát triển của cây trồng, góp phần làm tăng trọng lượng hạt và năng suất cây trồng từ 10% đến 20%.
Theo Vessey (2003) có 2 kiểu liên hệ tác động của vi khuẩn vùng rễ lên rễ cây ký chủ: vi khuẩn quanh rễ cây và vi khuẩn nội sinh rễ
- Vi khuẩn quanh rễ cây
Nhiều vi khuẩn như Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus và Pseudomonas có khả năng phát triển quanh rễ cây ký chủ, đặc biệt là ở vùng rễ non, giúp ngăn chặn vi sinh vật gây hại (Lambert và ctv., 1987; trích dẫn Đoàn Thị Kiều Tiên, 2010) Các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn vùng rễ có ảnh hưởng tích cực đến sự tăng trưởng của cây nhờ khả năng kiềm chế hoặc chiếm chỗ của mầm bệnh (Cavaglier và ctv., 2004) Một nghiên cứu của Trần Vũ Phến và ctv (2008) đã phát hiện 05 chủng vi khuẩn có khả năng kích thích tăng trưởng cây trồng và kiểm soát bệnh héo xanh do Ralstonia solanacearum gây ra, cho thấy rễ cây mọc dài hơn bình thường Những vi khuẩn này không chỉ thúc đẩy sự phát triển của cây mà còn hạn chế sự hình thành hạch nấm và hạch khuẩn, từ đó giảm thiểu nguồn lây lan bệnh trong tự nhiên (trích dẫn Trần Bạch Lan, 2010).
- Vi khuẩn nội sinh rễ (endophytic bacteria)
PGPR (Vi khuẩn thúc đẩy sự phát triển của cây trồng) là những vi khuẩn sống tự nhiên trong đất, có khả năng xâm nhập vào mô cây mà không gây hại, giúp cây chống lại mầm bệnh trong đất Chúng được gọi là vi khuẩn nội sinh rễ và có thể ức chế hoặc kích thích phản ứng kháng lại mầm bệnh tại vị trí tấn công Để xâm nhập vào rễ, các vi khuẩn này phải là vi khuẩn vùng rễ Vi khuẩn nội sinh rễ thường được tách ra từ mô cây đã khử trùng bề mặt hoặc từ bên trong rễ cây.
Nhiều chủng vi khuẩn nội sinh rễ đã được nghiên cứu và ứng dụng hiệu quả trong phòng trị sinh học bệnh cây trên toàn cầu (Siddiqui, 2006) Theo nghiên cứu của Aravind và cộng sự, việc sử dụng các vi khuẩn này mang lại nhiều lợi ích cho nông nghiệp bền vững.
(2009) nhóm vi khuẩn nội sinh rễ trên cây trồng được tìm thấy gồm: Bacillus spp.,
Pseudomonas spp., Seratia spp., Clavibacter spp., …có khả năng ức chế mầm bệnh trong đất như Phytophthora và Fusarium (Lian và ctv., 2008; trích dẫn Trần Thị Kim Đông, 2010)
1.3.4 Vai trò của vi khuẩn vùng rễ trong phòng trừ sinh học (PTSH) bệnh cây trồng
Nhóm vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng cây trồng (PGPR) có khả năng ngăn chặn mầm bệnh trong đất thông qua nhiều cơ chế, bao gồm sản xuất siderophore để làm giảm tính khả dụng của sắt cho mầm bệnh, tạo ra kháng sinh và enzyme giúp ngăn chặn sự phát triển của chúng, cũng như cạnh tranh về thức ăn và chỗ ở trên rễ cây (Nelson, 2004) Theo Van Loon và Bakker (2005), vi khuẩn vùng rễ không chỉ giúp cây chống chịu tốt hơn với mầm bệnh mà còn kích thích cơ chế tự vệ của cây Ngoài ra, vi khuẩn vùng rễ còn có khả năng tiết ra các chất kích thích tăng trưởng, như indol-acetic-acid (IAA), giúp rễ phát triển tốt hơn, với một số loài trong chi Pseudomonas và Agrobacterium đóng vai trò quan trọng trong quá trình này (Phạm Văn Kim, 2006) Thakuria và cộng sự (2003) cũng cho thấy rằng vi khuẩn vùng rễ có khả năng tổng hợp và sản xuất các hormone tăng trưởng như auxins, cytokinins và gibberellins, góp phần vào sự phát triển của cây trồng.
1.3.5 Các cơ chế đối kháng của vi khuẩn vùng rễ
Vi khuẩn vùng rễ (PGPR) đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại vi sinh vật gây bệnh, đã được ứng dụng thành công trong phòng trừ sinh học đối với nấm, tuyến trùng, vi khuẩn và virus gây hại cây trồng trên toàn thế giới PGPR hoạt động thông qua nhiều cơ chế đối kháng, bao gồm cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian sống, tiết kháng sinh, và enzyme phân hủy vách tế bào mầm bệnh Đặc biệt, PGPR có khả năng làm cho sắt không hữu dụng đối với mầm bệnh, đồng thời kích thích khả năng kháng của cây trồng trước sự xâm nhập của mầm bệnh Các biện pháp phòng trừ sử dụng vi khuẩn đối kháng được xem là một phần quan trọng trong chiến lược phòng trừ sinh học.
Kháng sinh, được biết đến như một cơ chế phòng trừ sinh học của PGPR, đã được nghiên cứu và hiểu rõ trong hơn hai thế kỷ qua (Whipps, 2001) Đây là những hợp chất có trọng lượng phân tử thấp, được vi sinh vật sản xuất với nồng độ rất thấp, và có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác (Trần Bạch Lan, 2010).
- Theo Phạm Văn Kim (2000): sự kháng sinh (antibiosis) là sự ức chế mầm bệnh bởi tiến trình sản xuất ra các chất kháng sinh
Chi vi khuẩn Pseudomonas spp có khả năng tiết ra nhiều loại kháng sinh như pyoluteorin (PLT), pyrolnitrin (PRN), 2,4-diacetyl-phloroglucinol (DAPG) và phenazine-1-carboxamide (PCN), trong đó pyrolnitrin và DAPG được phát hiện phổ biến ở các chi vi khuẩn đối kháng DAPG, với phổ ức chế rộng, có khả năng ức chế cả nấm và tuyến trùng, chứng minh hiệu quả cao trong phòng trừ sinh học Nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sản sinh ra aerugine, giúp cây chống lại bệnh tật.
Phytophthora trên ớt, Colletotrichum lagenarium (C orbiculare) trên dưa hấu
Vi khuẩn Pseudomonas cepacia B37w có khả năng tiết ra kháng sinh pyrrolnitrin, giúp hạn chế sự phát triển của nấm Fusarium sambucinum, nguyên nhân gây ra vết thương trên củ khoai tây Ngoài ra, vi khuẩn này cũng ức chế Botrytis cinerea, tác nhân gây bệnh mốc xám, và Penicillium expanum, gây bệnh mốc xanh trên đào và táo sau thu hoạch.
Chi vi khuẩn Bacillus có khả năng phòng trừ sinh học bệnh cây trồng nhờ vào khả năng hình thành nội bào tử, giúp chúng tồn tại lâu dài trong điều kiện môi trường bất lợi (Antoun và Prévost, 2005) Bacillus spp tiết ra các loại kháng sinh như Kanosamine và Zwittermicin A (Nguyễn Thị Thu Nga, 2003), cùng với các chất kháng sinh khác như bacillomycin (Volpon và ctv., 1999), iturin A (Yoshida và ctv., 2002), oligomycin A và xanthobaccin (Kim và ctv., 1999; Hashidoko và ctv.).
Năm 1999, nghiên cứu đã chỉ ra rằng các dòng vi khuẩn Bacillus có khả năng sản xuất các chất ức chế với phổ tác dụng rộng lớn nhằm tiêu diệt mầm bệnh Những chất ức chế này bao gồm lipopeptiddes surfactins, fengycin, và các hợp chất iturins như iturins, mycosubtilins và bacillomycins (Hashidoko và cộng sự, 1999; Raaijmaker và cộng sự, 2002).
- Tiêu sinh (lysis) là sự giết chết, làm tan đi, phân hủy sinh chất của mầm bệnh (Phạm Văn Kim, 2000)
Vách tế bào nấm được cấu tạo từ glucan, chitin và protein (Phạm Văn Kim, 2000) Vi khuẩn vùng rễ thuộc nhóm Pseudomonas spp và Bacillus spp có khả năng tiết ra enzym chitinase, giúp phân hủy chitin trong vách tế bào nấm bệnh (Trương Thị Bích Ngân, 2009) Các enzyme như β-1,3-glucanse và chitinase không chỉ thủy phân cấu trúc vách tế bào của mầm bệnh mà còn ức chế sự phát triển của chúng (Van Loon và ctv., 1994).
- Đặc điểm và vai trò của enzyme chitinase:
+ Chitinase (E.C.3.2.1.14) là dạng poly (1,4-(N-acetyl-β-D- glucosaminide))-glycanohydrolases (trích dẫn bởi Phan Văn Thuật, 2007)
PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP
PHƯƠNG TIỆN
2.1.1 Thời gian và địa điểm:
Thời gian: từ tháng 08/2010 đến tháng 02/2011 Địa điểm: Tại phòng thí nghiệm bệnh cây Bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa
Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ
Vật liệu trong phòng thí nghiệm:
- Tủ cấy vi sinh, tủ úm, tủ thanh trùng khô, autoclave, máy đo pH, micropipette, water bath, vortex- genie 2, cân điện tử, dụng cụ phân phối môi trường
- Bình tam giác, ống nghiệm, ống eppendorf, đĩa Petri…
- Các hóa chất cần thiết cho môi trường King’ B, môi trường PDA, cồn
Vật liệu dùng trong nhà lưới:
- Đất trồng (trộn đất với tỷ lệ 2:1, hai phần đất + một phần hữu cơ)
- Các vật liệu cần thiết khác
Nấm Colletotrichum lagenarium (C-VL2), được phân lập từ Tân Hưng - Vĩnh Long, là nguồn gây bệnh nghiêm trọng nhất trên dưa hấu (Trần Bạch Lan, 2010).
Nghiên cứu đã xác định năm chủng vi khuẩn vùng rễ ở cây dưa hấu tại Đồng bằng sông Cửu Long, có khả năng phân giải chitin trong điều kiện in vitro, do bộ môn Bảo Vệ Thực Vật cung cấp.
Sau đây là bảng 2.1, cho thấy đặc điểm của các chủng vi khuẩn vùng rễ sử dụng trong thí nghiệm
Bảng 2.1: Đặc điểm của các chủng vi khuẩn vùng rễ sử dụng trong thí nghiệm
* Kết quả do Trần Thị Kim Đông (2010) cung cấp
** Kết quả do Phan Văn Phương (2011) cung cấp
Các loại môi trường sử dụng trong thí nghiệm:
- PDA (Potato-dextrose-Agar) (Shurtleff & Averre III, 1997)
- PDA cải tiến (Trần Mỹ Duyên, 2009)
- King’ B (Shurtleff và Averre III, 1997)
STT Mã số Vị trí phân lập Tên vi khuẩn
Bán kính vòng vô khuẩn trung bình đối với nấm
Bán kính phân giải chitin trung bình ** (mm)
1 18 Bình Phước Xuân - Chợ Mới –
2 89 Bình Phước Xuân - Chợ Mới –
3 119 Kiên Bình-Kiên Lương-Kiên
4 198 Tập Ngãi-Tiểu Cần-Trà Vinh Bacillus sp -
5 200 Bình Thủy-Cần Thơ Bacillus sp 1,8 1,87
PHƯƠNG PHÁP
Mục đích của nghiên cứu là đánh giá hiệu quả phòng trị của năm chủng vi khuẩn phân giải chitin đối với bệnh thán thư trên cây dưa hấu trong điều kiện nhà lưới Nghiên cứu này nhằm xác định chủng vi khuẩn và biện pháp xử lý tối ưu nhất để kiểm soát bệnh, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố:
- Nhân tố 1: 05 chủng vi khuẩn + Đối chứng không xử lý
- Nhân tố 2: 04 cách xử lý vi khuẩn gồm:
1 Ngâm hạt và tưới đất với vi khuẩn phân giải chitin
2 Phun lá với vi khuẩn phân giải chitin trước khi chủng bệnh
3 Phun lá với vi khuẩn phân giải chitin sau khi chủng bệnh
4 Phun lá với vi khuẩn phân giải chitin trước và sau khi chủng bệnh
Mỗi nghiệm thức gồm 15 lần lặp lại (mỗi lặp lại tương ứng với 1 cây, gồm 5 chậu,
- Nấm được nuôi cấy trong môi trường PDAct khoảng 3 tuần thì phát triển hết đĩa Petri
Phương pháp tạo bào tử cho nấm Colletotrichum lagenarium bao gồm việc cấy nấm trên đĩa Petri với môi trường PDA và để trong điều kiện phòng thí nghiệm trong 13 ngày để nấm phát triển Sau đó, đĩa nấm được chuyển vào phòng lạnh ở nhiệt độ 25°C và chiếu sáng 12 giờ mỗi ngày bằng ánh sáng đèn bình thường.
10 ngày sẽ xuất hiện các khối bào tử màu cam trên bề mặt đĩa
Khi cây dưa hấu phát triển đầy đủ với 1 lá thật (khoảng 13-16 ngày sau khi gieo), cần chuyển chúng vào nhà lưới có che mát Tại đây, cây sẽ được xử lý bằng vi khuẩn đối kháng và chủng bệnh để đảm bảo sự phát triển khỏe mạnh.
Cách xử lí vi khuẩn đối kháng:
- Nhân nuôi vi khuẩn phân giải chitin:
Vi khuẩn được cấy trên đĩa Petri với môi trường King's B hai ngày trước khi chủng bệnh Để thu hoạch huyền phù vi khuẩn, nước muối sinh lý 0,9% được thêm vào đĩa và dùng lame cạo đều để khuẩn lạc phân tán vào nước Mật số vi khuẩn được xác định bằng cách đo OD ở bước sóng 600 nm, sau đó pha loãng để đạt mật số 10^8 cfu/ml dựa trên đường chuẩn đã xây dựng trước.
- Cách xử lí ngâm hạt + tưới đất:
Hạt dưa hấu được xử lý ở nhiệt độ 52°C trong 30 phút, sau đó được ngâm trong huyền phù vi khuẩn phân giải chitin với mật số 10^8 cfu/ml trên máy lắc ngang HY2 trong 45 phút.
+ Tưới đất với 5ml huyền phù vi khuẩn phân giải chitin với mật số 10 8 cfu/ml/ cây (7 ngày sau khi gieo)
- Cách xử lí vi khuẩn phân giải chitin trước chủng bệnh: chủng vi khuẩn phân giải chitin trên lá với mật số 10 8 cfu/ml 1 ngày trước khi chủng bệnh
Sau khi chủng bệnh, cần xử lý vi khuẩn phân giải chitin bằng cách phun chủng vi khuẩn với mật độ 10^8 cfu/ml lên lá cây vào ngày thứ nhất.
Để xử lý trước và sau khi chủng bệnh, vi khuẩn phân giải chitin cần được phun lên lá với mật độ 10^8 cfu/ml Lần phun đầu tiên thực hiện một ngày trước khi chủng bệnh và lần thứ hai thực hiện một ngày sau khi chủng bệnh.
Để chuẩn bị huyền phù bào tử nấm C lagenarium, bạn cần cho nước cất thanh trùng vào đĩa cấy, sau đó nhẹ nhàng cạo bề mặt nấm bằng lame và lọc qua 4 lớp vải thưa để thu thập bào tử Để xác định mật số bào tử gốc, hãy rút huyền phù nấm và đặt lên lame đếm, sau đó quan sát dưới kính hiển vi Công thức tính mật số bào tử nấm là 2,5 x 10^5 (A), trong đó A là số bào tử quan sát được trong ô lớn.
Phun huyền phù bào tử nấm Colletotrichum lagenarium với mật số 2x10^6 bào tử/ml lên lá thật thứ nhất cho đến khi toàn bộ bề mặt lá được phủ một lớp sương huyền phù bào tử Sau khi thực hiện việc chủng bệnh, cây cần được đặt trong môi trường tối và có độ ẩm cao để đảm bảo sự phát triển của nấm.
Phần trăm diện tích lá bị nhiễm bệnh vào 4, 5, và 6 ngày sau khi chủng bệnh (NSKC)
Các số liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC qua phép thử DUNCAN
Trên lá thật thứ nhất của mỗi cây trong mỗi nghiệm thức, bằng mắt thường xác định phần trăm diện tích lá bị nhiễm bệnh thán thư.
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
Biện pháp xử lý vi khuẩn phân giải chitin bằng cách ngâm hạt và tưới đất
Bảng 3.1 cho thấy, tại thời điểm khởi phát nấm bệnh (4NSKC), bệnh đã xuất hiện đồng đều ở tất cả các nghiệm thức Hầu hết các chủng vi khuẩn đối kháng cho kết quả với tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh thấp hơn và có sự khác biệt thống kê so với nhóm đối chứng, đặc biệt là các chủng vi khuẩn 18, 119, 198.
Ngoại trừ chủng 89, các chủng còn lại đều có tỷ lệ bệnh tương đương với đối chứng Trong số bốn chủng cho thấy hiệu quả, chủng 198 có tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh thấp nhất (14,7%), khác biệt có ý nghĩa so với chủng 200 (21,2%) và cho kết quả tương đương với chủng vi khuẩn 18 (17,7%) và chủng vi khuẩn 119 (16,0%).
Vào 5 NSKC, bệnh đã bộc phát mạnh và gây thiệt hại nặng trên toàn bộ nghiệm thức Ta có thể thấy được, hết 3/5 chủng vi khuẩn cho tỷ lệ bệnh tương đương với đối chứng lần lượt là chủng 18, 119 và 200 Còn lại 2 chủng vi khuẩn là chủng 198 và 89 với tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh lần lượt là: 51,8% và 48,5% thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng (90,3%) và hai chủng này không có sự khác biệt ý nghĩa so với nhau về tỷ lệ diện tích lá nhiễm bệnh
Tại thời điểm 6NSKC, bệnh đã phát triển 100% diện tích lá trong nghiệm thức đối chứng và các nghiệm thức khác Hiện tại, không còn biện pháp xử lý vi khuẩn nào hiệu quả.
Biện pháp ngâm hạt và tưới đất để xử lý vi khuẩn đối kháng với nấm C lagenarium cho thấy hiệu quả cao trong 2 ngày đầu khảo sát, nhưng đến ngày thứ 6, tất cả các nghiệm thức đều nhiễm bệnh 100% diện tích lá giống như đối chứng Trong thời gian 2 ngày đầu, chủng 198 (Bacillus sp.) cho hiệu quả phòng trị cao nhất và ổn định nhất.
Bảng 3.1 trình bày tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh (%) do thán thư (Colletotrichum lagenarium) gây ra trên các nghiệm thức xử lý với 05 chủng vi khuẩn phân giải chitin Nghiên cứu này áp dụng biện pháp ngâm hạt và tưới đất, đánh giá qua các thời điểm 4 và 5.
Các số trung bình trong cùng một cột theo sau bởi một hoặc những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Duncan
1 : Số liệu phần trăm diện tích lá bị bệnh được chuyển sang arcsin x trước khi phân tích thống kê
*: khác biệt mức ý nghĩa 5% ns: không có khác biệt
Việc áp dụng vi khuẩn vùng rễ có khả năng phân giải chitin để kiểm soát nấm bệnh thông qua biện pháp ngâm hạt kết hợp tưới đất cho thấy hiệu quả tương đối, mặc dù không cao và không kéo dài Trong số các chủng vi khuẩn, chủng 198 (Bacillus sp.) cho hiệu quả phòng trị tốt nhất, kéo dài qua hai thời điểm khảo sát, tiếp theo là chủng 89 (cxđ), và hai chủng này không có sự khác biệt ý nghĩa về tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh Nghiên cứu trước đây cũng đã chỉ ra khả năng đối kháng của vi khuẩn vùng rễ với các tác nhân gây bệnh khác khi áp dụng phương pháp ngâm hạt kết hợp tưới đất.
Tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh (%)
Mã số Tên vi khuẩn
Theo Đoàn Thị Kiều Tiên (2010), việc xử lý vi khuẩn đối kháng bằng cách ngâm hạt và tưới đất có thể giảm thiểu sự tấn công của vi khuẩn Acidovorax avenae subsp citrulli, nguyên nhân gây ra bệnh cháy lá và đốm trái, trong điều kiện nhà lưới Nghiên cứu này cho thấy hiệu quả cao của các chủng bệnh với các chỉ số CV lần lượt là 26,98%, 31,55% và 12,57%.
Nghiên cứu năm 2007 cho thấy việc sử dụng huyền phù vi khuẩn Bacillus 8 có khả năng ức chế bệnh nấm D bryoniae trên lá dưa hấu trong điều kiện nhà lưới Phương pháp ngâm hạt và tưới đất bằng vi khuẩn phân giải chitin giúp giảm thiểu bệnh do Colletotrichum lagenarium Cơ chế phòng trị có thể liên quan đến đối kháng và kích kháng, phù hợp với các nghiên cứu trước đây Kloepper và cộng sự (1989) đã chỉ ra rằng chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả năng đối kháng với các tác nhân gây bệnh từ đất thông qua việc tiết ra kháng sinh và enzyme phân hủy vách tế bào nấm Bacillus sp cũng được phát hiện có khả năng tiết nhiều loại kháng sinh như kanosamine và zwittermicin A.
2005) và bacillomycin (Volpon và ctv., 1999) Ngoài ra chúng cũng có thể tiết ra một số chất kháng sinh khác như: iturin A (Yoshida và ctv., 2002), oligomycin
A, xanthobaccin (Kim và ctv., 1999) để tiêu diệt và ức chế mầm bệnh Bên cạnh việc ức chế mầm bệnh theo cơ chế đối kháng nói trên, vi khuẩn vùng rễ còn có cơ chế kích kháng lên cây trồng từ đó giúp hạn chế mầm bệnh dưới rễ cây cũng như trên tán lá (Van Loon và Bakker, 2005)
Chủng vi khuẩn 89 không chỉ tiết ra chitinase mà còn ức chế sự phát triển của nấm C lagenarium với bán kính vô khuẩn trung bình 3,2 mm nhờ cơ chế tiết kháng sinh Chất kháng nấm này có khả năng lưu dẫn trong cây và ngăn chặn mầm bệnh trên lá Hiệu quả giảm bệnh cũng có thể liên quan đến cơ chế kích kháng Theo nghiên cứu của Nga và cộng sự (2010), việc ngâm hạt và tưới đất bằng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 23 1-1 có thể ức chế bệnh trên lá dưa hấu do D bryoniae thông qua các cơ chế đối kháng và kích kháng Ngoài ra, chủng vi khuẩn 198 (Bacillus sp.) cũng cho thấy hiệu quả trong việc phòng trị bệnh qua biện pháp ngâm hạt và tưới đất.
Giống cây 198 không thể kháng lại nấm C lagenarium trong điều kiện in vitro, nhưng việc ngâm hạt và tưới đất có thể giảm hiệu quả bệnh do vi khuẩn này thông qua cơ chế kích kháng Theo nghiên cứu của Kloepper và cộng sự (2004), các loài thuộc chi Bacillus như B amyloliquefaciens, B subtilis, B pasteurii, B cereus, B pumilus và B mycoides được biết đến với khả năng kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng, giúp giảm thiểu bệnh do nhiều tác nhân khác nhau và trên nhiều loại cây trồng.
Hình 3.1 Hiệu quả phòng trị bệnh thán thư trên dưa hấu ở chủng vi khuẩn 198
( Bacillus sp.) và chủng vi khuẩn 89 (cxđ) so với đối chứng bằng biện pháp ngâm hạt kết hợp với tưới đất vào thời điểm 5 NSKC ĐC
3.2 Biện pháp xử lý vi khuẩn bằng cách phun lên lá trước khi chủng bệnh
Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy, sau 4 ngày sau khi nhiễm, nấm C lagenarium đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho cây dưa hấu, với tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh ở nhóm đối chứng đạt 28,1% Ngược lại, tất cả các nghiệm thức xử lý bằng vi khuẩn đối kháng đều cho thấy hiệu quả phòng trị cao, với tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh thấp hơn và có sự khác biệt rõ rệt so với nhóm đối chứng Đặc biệt, nghiệm thức xử lý bằng chủng vi khuẩn 200 (Bacillus sp.) có tỷ lệ diện tích lá bị bệnh là 15,3%, tuy nhiên vẫn cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với các nghiệm thức xử lý vi khuẩn khác.
Sang 5 NSKC, bệnh còn phát triển nhanh hơn và gây tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh trên các nghiệm thức gia tăng đột biến Qua đó càng thấy rõ sự khác biệt giữa các nghiệm thức có xử lý vi khuẩn đối kháng so với đối chứng Sự khác biệt này là, toàn bộ các nghiệm thức có áp dụng vi khuẩn đối kháng với nấm bệnh thì đều có tỷ lệ bệnh thấp hơn hẳn và có khác biệt ý nghĩa so với đối chứng Chủng 18 có tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh thấp nhất (40,3%) khác biệt ý nghĩa so với 3 chủng 119, 198 và 200
Vào thời điểm 6 NSKC, nghiệm thức đối chứng cho thấy 100% diện tích lá bị nhiễm bệnh Trong khi đó, chỉ có hai chủng vi khuẩn, chủng 18 và 89, có tỷ lệ bệnh thấp hơn so với đối chứng, lần lượt là 65,3% và 78,9% So sánh hiệu quả giữa các chủng vi khuẩn này cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong khả năng kháng bệnh.
2 chủng này thì chủng 18 (Bacillus sp.) có tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với chủng 89 (cxđ)
Biện pháp áp dụng vi khuẩn phân giải chitin bằng cách phun lên lá dưa hấu vào thời điểm sau khi chủng nấm gây bệnh……………………… 30 3.4 Biện pháp xử lý vi khuẩn bằng cách phun lá trước và sau khi chủng bệnh……………………………………………………………………… 33 3.5 So sánh sự tương tác xảy ra ở các ngày khảo sát: 4, 5 và 6 NSKC
Kết quả từ bảng 3.3 cho thấy, ở 4 NSKC, tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh của các chủng vi khuẩn 18, 89, 119, 198 và 200 lần lượt là 8,93%; 6,93%; 7,8%; 11,4%; 10,2%, đều thấp hơn so với đối chứng (28,1%) và có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê Đến thời điểm 5 NSKC, chỉ còn 4 chủng vi khuẩn 18, 89, 119 và 200 có tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh thấp hơn và có ý nghĩa khác biệt so với đối chứng, trong đó chủng 18 cho kết quả phòng bệnh tốt nhất.
Tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh thấp nhất là 33,5%, cho thấy LT ĐC trị bệnh cao nhất, với sự khác biệt rõ rệt về mặt ý nghĩa thống kê so với các chủng vi khuẩn khác.
Vào cuối 6NSKC, thiệt hại do nấm bệnh gây ra là cao nhất, với nghiệm thức đối chứng bị chết hoàn toàn trên lá Chỉ có 1/5 chủng vi khuẩn có tỷ lệ diện tích lá nhiễm bệnh thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng, trong đó chủng 18 (Bacillus sp.) có tỷ lệ nhiễm bệnh 68,3% Đánh giá chung cho thấy biện pháp xử lý vi khuẩn bằng cách phun lên lá 1 ngày sau khi nhiễm bệnh C lagenarium cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn đối kháng đều có khả năng phòng trị bệnh, nhưng chủng 18 (Bacillus sp.) là hiệu quả nhất qua tất cả các ngày ghi nhận.
Nhìn chung, biện pháp phun vi khuẩn có khả năng phân giải chitin lên lá
Một ngày sau khi phun chủng vi khuẩn Bacillus sp., hiệu quả phòng trị bệnh được ghi nhận nhờ vào cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng, nơi ở và khả năng tiết kháng sinh, giúp ức chế sự phát triển của mầm bệnh Bacillus sp có khả năng tiết ra các chất kháng sinh và enzyme chitinase, phân hủy vách tế bào nấm bệnh, đồng thời tham gia vào các cơ chế cạnh tranh về dinh dưỡng và chỗ ở Do đó, việc phun chủng vi khuẩn Bacillus sp với các cơ chế đối kháng và khả năng phân giải chitin cao mang lại hiệu quả trong việc phòng trị bệnh.
Bốn chủng vi khuẩn còn lại, được áp dụng trực tiếp lên lá một ngày sau khi chủng bệnh, đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế sự phát triển của mầm bệnh.
Việc sử dụng chủng vi khuẩn 18 (Bacillus sp.) với cơ chế đối kháng mạnh mẽ giúp ức chế sự phát triển của mầm bệnh là rất quan trọng Bên cạnh đó, áp dụng biện pháp xử lý vi khuẩn đối kháng một cách thích hợp, như phun sau, sẽ nâng cao hiệu quả phòng trừ sinh học cho cây trồng.
Bảng 3.3 trình bày tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh thán thư do C lagenarium gây ra, dựa trên 05 chủng vi khuẩn phân giải chitin Các dữ liệu được thu thập qua biện pháp phun lên lá sau khi chủng bệnh, tại các thời điểm 4, 5 và 6 NSKC.
Các số trung bình trong cùng một cột nếu được theo sau bởi các chữ cái giống nhau thì không có sự khác biệt đáng kể ở mức ý nghĩa 5% theo phép thử Duncan.
1 : Số liệu phần trăm diện tích lá bị bệnh và hiệu quả giảm bệnh được chuyển sang arcsin x trước khi phân tích thống kê
Tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh (%)
Mã số Tên vi khuẩn
Nghiên cứu cho thấy hiệu quả phòng trị bệnh thán thư trên cây dưa hấu do nấm C lagenarium gây ra bằng chủng vi khuẩn phân giải chitin 18 (Bacillus sp.) được áp dụng qua biện pháp phun lên lá, so với đối chứng, trong giai đoạn 6 ngày sau khi chủng bệnh.
3.4 Biện pháp xử lý vi khuẩn bằng cách phun lá trước và sau khi chủng bệnh
Kết quả từ bảng 3.4 cho thấy, tại thời điểm 4 NSKC, tất cả các chủng vi khuẩn đều có sự khác biệt ý nghĩa so với đối chứng, với tỷ lệ bệnh thấp hơn Trong số đó, chủng 89 ghi nhận tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh thấp nhất (4,4%), tiếp theo là chủng 200 (7,4%) Hai chủng này không có sự khác biệt ý nghĩa so với nhau nhưng khác biệt rõ rệt so với các chủng vi khuẩn còn lại Đến thời điểm 5 NSKC, nấm bệnh bắt đầu tấn công mạnh mẽ, gây chết nhanh chóng trên tất cả các nghiệm thức, đặc biệt là nghiệm thức đối chứng, với tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh tăng từ 28,1% lên 90,3% Lúc này, chỉ còn 3 chủng vi khuẩn tồn tại.
Trong nghiên cứu, các chủng vi khuẩn 18, 89 và 200 cho thấy tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh thấp hơn so với đối chứng, với chủng 200 đạt hiệu quả cao nhất (40,2%) Sự khác biệt giữa chủng 200 và chủng 18 (72,7%) là rõ ràng, nhưng không có sự khác biệt ý nghĩa so với chủng 89 (47,3%) Đến giai đoạn 6 NSKC, chỉ còn chủng 89 và 200 cho kết quả tốt hơn đối chứng, trong đó chủng 89 có tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh là 60,0%, cho thấy sự khác biệt ý nghĩa so với chủng 200 (73,3%).
Bảng 3.4 trình bày tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh (%) do nấm thán thư C lagenarium gây ra, được khảo sát từ 05 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải chitin Nghiên cứu này đánh giá hiệu quả của biện pháp phun vi khuẩn lên lá trước và sau khi nhiễm bệnh tại các thời điểm 4, 5 và 6 NSKC.
Tỷ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh (%)
Mã số Tên vi khuẩn
Các số trung bình trong cùng một cột theo sau bởi một hoặc những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Duncan
1 : Số liệu phần trăm diện tích lá bị bệnh và hiệu quả giảm bệnh được chuyển sang arcsin x trước khi phân tích thống kê
Tất cả 5 chủng vi khuẩn đều có hiệu quả phòng trị bệnh thán thư trên dưa hấu ở thời điểm 4 NSKC, nhưng số lượng chủng vi khuẩn hiệu quả ức chế mầm bệnh giảm dần theo thời gian Sau 3 ngày theo dõi, chỉ còn 2 chủng vi khuẩn có hiệu quả cao và kéo dài là chủng vi khuẩn 89 (cxđ) và chủng vi khuẩn 200 (Bacillus sp.), trong đó chủng vi khuẩn 89 (cxđ) cho hiệu quả tốt nhất.
Phun vi khuẩn phân giải chitin lên lá trước và sau khi chủng bệnh 1 ngày mang lại hiệu quả phòng trị bệnh cao nhờ kết hợp hai biện pháp xử lý vi khuẩn đối kháng Các nghiên cứu cho thấy chủng Bacillus sp có khả năng tiết ra chất kháng sinh và enzyme chitinase, giúp phân hủy vách tế bào nấm bệnh Ngoài ra, vi khuẩn này còn tham gia vào cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và chỗ ở với mầm bệnh Cụ thể, chủng vi khuẩn 89 và 200 đã được ghi nhận có khả năng ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm C lagenarium với bán kính vô khuẩn lần lượt là 3,2 mm và 1,8 mm Các cơ chế đối kháng như tiết kháng sinh, tạo enzyme phân giải vách tế bào, cạnh tranh dinh dưỡng và oxy đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế mầm bệnh, đặc biệt là khả năng tiết enzyme phân hủy vách tế bào nấm, giúp nâng cao hiệu quả phòng trị bệnh cây trồng.
Nghiên cứu của Kim và Chung (2004) chỉ ra rằng chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả năng tiết enzyme chitinase, giúp ức chế mầm bệnh một cách trực tiếp Cụ thể, Bacillus amyloliquefaciens MET0908 có khả năng tiết ra enzyme β-1,3-glucanase và chitinase, góp phần phân hủy vách tế bào của nấm Colletotrichum lagenarium, như được đề cập trong nghiên cứu của Waldemar.
(2004), cũng cho thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả năng làm ức chế sự tăng trưởng của sợi nấm C lagenarium (trích dẫn Nguyễn Thị Hồng Phương,
Hình 3.4: Hiệu quả phòng trị bệnh thán thư ở chủng vi khuẩn 89 (cxđ) và 200
( Bacillus sp.) bằng biện pháp xử lý phun lên lá trước và sau khi chủng bệnh ở thời điểm 6 NSKC
