Nghiên cứu đặc tính zymocin của nấm men moniliella sp SS4 2

VIỆN N ĐẠI Đ HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGH NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN LU TỐT NGHIỆ ỆP Đề tài: Nghiên ứu đặc tính zymocin nấấm men Moniliella sp SS4.2 Người hướ ớng dẫn Sinh viên Niên khóa : PGS Vũ Nguyên Thành : Phạm Mai Hương : K19 – Lớp 1203 - CNSH Hà Nội - 2016 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu Khóa luận trung thực Tơi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực Khóa luận cám ơn thơng tin trích dẫn Khóa luận ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 24tháng 5năm 2016 Sinh viên Phạm Mai Hương Phạm Mai Hương i Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS Vũ Nguyên Thành, người tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt q trình nghiên cứu, hồn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện để em hồn thành tốt cơng việc Em xin trân trọng cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ Sinh Học, Viện Đại học Mở Hà Nội tận tình giảng dạy, dìu dắt em suốt thời gian học tập Cuối cùng,em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn bè người ln động viên, khích lệ em đường học tập, làm quen với công tác nghiên cứu khoa học Hà Nội, ngày24tháng5 năm 2016 Sinh viên Phạm Mai Hương Phạm Mai Hương ii Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NẤM MEN MONILIELLA 1.1.1 Giới thiệu chung nấm men Moniliella 1.1.2 Moniliella sp SS4.2 1.2 ZYMOCIN 1.2.1 Khái quát zymocin 1.2.2 Đặc điểm zymocin 1.2.3 Bản chất cấu trúc zymocin 10 1.2.4 Vai trò ứng dụng zymocin 11 1.2.5 Tình hình nghiên cứu zymocin giới 12 1.2.6 Tình hình nghiên cứu zymocin Việt Nam 14 1.3 THU HỔI VÀ TINH CHẾ PROTEIN 15 1.3.1 Phương pháp kết tủa 15 1.3.1.1 Kết tủa muối ammonium sulfate 16 1.3.1.2 Kết tủa dung môi hữu 16 1.3.2 Phương pháp sắc ký 17 1.3.2.1 Sắc ký lọc gel 17 1.3.2.2 Sắc ký trao đổi ion 18 1.3.2.3 Sắc ký tương tác kỵ nước 18 Phạm Mai Hương iii Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 1.3.2.4 Sắc ký lực 18 1.3.2.5 Sắc ký lỏng cao áp 19 1.3.3 Phân tách protein điện di SDS-PAGE 19 PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU 21 2.1.1 Đối tượng 21 2.1.2 Vật liệu 21 2.1.2.1 Hóa chất 21 1.2.2 Dụng cụ trang thiết bị, máy móc 22 1.2.3 Thành phần môi trường dùng nghiên cứu 22 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Nghiên cứu tinh chế zymocin 24 2.2.1.1 Cô đặc mẫu 24 2.2.1.2 Kết tủa phân đoạn ammonium sulfate 24 2.2.1.3 Sắc ký tương tác kỵ nước 25 2.2.1.4 Sắc ký trao đổi ion 25 2.3.2 Phương pháp phân tích 26 2.3.2.1 Thử hoạt tính zymocin phương pháp đục lỗ thạch 26 2.3.2.2 Phương pháp điện di SDS-PAGE 26 2.3.3 Khả bền nhiệt zymocin sau tinh chế 28 2.3.4 Khả bền pH zymocin sau tinh chế 29 2.3.5 Khả chịu kháng sinh chủng Saccharomyces cerevisiae SBY 2576 theo thời gian 31 PHẦN 3: KẾT QUẢ 32 3.1 TINH CHẾ ZYMOCIN TỪ MONILIELLA sp SS4.2 32 3.1.1 Cô đặc mẫu 32 3.1.2 Kết tủa phân đoạn (NH4)2SO4 32 3.1.3 Sắc ký tương tác kỵ nước 34 3.1.4 Sắc ký trao đổi ion 37 Phạm Mai Hương iv Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 3.2 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ZYMOCIN DO CHỦNG MONILIELLA sp SS4.2 SINH RA 40 3.2.1 Khả bền nhiệt zymocin sau tinh chế 40 3.2.2 Khả bền pH zymocin sau tinh chế 45 3.2.3 Khả chịu kháng sinh chủng Saccharomyces cerevisiae SBY 2576 theo thời gian 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 Phạm Mai Hương v Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid ITS: Internal transcribed spacer DEAE Diethylaminoethyl FPLC Fast Protein Liquid Chromatography Rpm Revolutions per minute (tốc độ quay phút) SDS- PAGE Sodium docetyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis APS Ammonium persulfate TEMED N,N,N’,N’-tetramethylene-ethylenediamine YPD Yeast peptone dextrose kDa Kilo Dalton Phạm Mai Hương vi Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng Những loài nấm men mà hoạt tính zymocin cơng bố Bảng Lượng muối (NH4)2SO4 cần bổ sung để đạt nồng độ bão hòa từ 30-50 % Bảng Thể tích dung dịch acid citric 1M/ HCl M/ KOH M cần bổ sung vào 500 µl dịch zymocin gốc Bảng Thể tích dung dịch acid citric 1M/ HCl 1M/ KOH M cần bổ sung vào 500 µl dịch zymocin sau tinh chế Bảng Một số hình ảnh khả chịu kháng sinh zymocin Moniliella sp SS4.2 sinh chủng mẫn cảmSaccharomyces cerevisiae SBY 2576 mốc thời gian khảo sát Phạm Mai Hương vii Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1:Cây phả hệmơ tả mối quan hệ Moniliellasp SS4.2 nhóm phân loại chi Hình 3.1: Hoạt tính zymocin sau lọc cross flow qua màng kDa Hình 3.2: Hoạt tính dịch zymocin gốc phân đoạn sau kết tủa muối (NH4)2SO4 Hình 3.3: Điện di SDS-PAGE gel acrylamide 12% phân đoạn sau kết tủa zymocin muối (NH4)2SO4 Hình 3.4: Sắc ký đồ tương tác kỵ nước cột HIC pH mẫu zymocin phân đoạn kết tủa muối nồng độ 30%, 40%, 50% bão hòa Hình 3.5: Hoạt tính mẫu E1 E2 thu sau tinh chế sắc ký tương tác kỵ nước cột HIC Hình 3.6: Điện di SDS-PAGE gel acrylamide 12 % mẫu E1 E2 thu sau tinh chế sắc ký tương tác kỵ nước cột HIC Hình 3.7: Sắc ký đồ trao đổi ion cột DEAE pH mẫu zymocin sau tinh chếtrên cột HIC Hình 3.8: Hoạt tính mẫu E1 E2 thu sau tinh chế sắc ký trao đổi ion cột DEAE Hình 3.9: Điện di SDS-PAGE gel acrylamide 12 % mẫu E1 E2 thu sau tinh chế sắc ký trao đổi ion cột DEAE Hình 3.10:Độ bền nhiệt zymocin gốc nhiệt độkhác Hình 3.11: Điện di SDS-PAGE gel acrylamide 12% khả bền nhiệt zymocin gốc nhiệt độ khác Hình 3.12:Độ bền nhiệt zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tử nhiệt độ khác Phạm Mai Hương viii Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học Hình 3.13: Điện di SDS-PAGE gel acrylamide 12% khả bền nhiệt zymocin zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tử Hình 3.14:Độ bền nhiệt hai cấu tử sau gia nhiệt nhiệt độ khác trộn theo tỷ lệ 1:1 Hình 3.15: Điện di SDS-PAGE gel acrylamide 12% cấu tử – 20,7 kDa gia nhiệt nhiệt độ khác Hình 3.16: Điện di SDS-PAGE gel acrylamide 12% cấu tử hai – 16,6 kDa gia nhiệt nhiệt độ khác Hình 3.17:Độ bền pH zymocin gốc Hình 3.18:Độ bền pH zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tử Phạm Mai Hương ix Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 3.2 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ZYMOCIN DO CHỦNG MONILIELLA sp SS4.2 SINH RA Bên cạnh việc tìm zymocin nghiên cứu tinh chế zymocin chủng Moniliellasp SS4.2 sinh việc ứng dụng loại kháng sinh vào phẩm thực nghiệm cụ thể quan trọng.Zymocin biết đến với tiềm ứng dụng lớn công nghệ bảo quản sản phẩm lên men, nước đồ uống chế biến từ trái Các sản phẩm có tính acid q trình chế biến phải trải qua bước gia nhiệt trùng, để ứng dụng hiệu zymocin vào sản phẩm tiến hành nghiên cứu khả bền nhiệt, khả bền pH zymocin chủng Moniliellasp SS4.2 sinh sau tinh chế 3.2.1 Khả bền nhiệt zymocin sau tinh chế Để nghiên cứu kiểm tra khả bền nhiệt zymocin sau tinh chế tiến hành gia nhiệt mẫu zymocin gốc mẫu zymocin gồm hai cấu tử nhiệt độ khác Mẫu zymocin gốc gia nhiệt nhiệt độ 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C 30 phút, 90°C 100°C 15 phút Sau đem để đá lạnh Tiến hành kiểm tra khả bền nhiệt zymocin phương pháp đục lỗ thạch điện di SDS-PAGE gel acrylamide 12% Hoạt tính zymocin thể thơng qua việc xuất vòng kháng quanh giếng Kết thu sau: 1G140150160 Phạm Mai Hương 40 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 1701801901100 Hình 3.10: Độ bền nhiệt zymocin gốc nhiệt độ khác Hình 3.11: Điện di SDS-PAGE gel acrylamide 12% khả bền nhiệtcủa zymocin gốc nhiệt độ khác M- marker, 1G- mẫu không gia nhiệt, 140- mẫu gia nhiệt 40°C, 150- mẫu gia nhiệt 50°C, 160- mẫu gia nhiệt 60°C, 170- mẫu gia nhiệt 70°C, 180- mẫu gia nhiệt 80°C, 190- mẫu gia nhiệt 90°C, 1100- mẫu gia nhiệt 100°C Kết thử hoạt tính phương pháp đục lỗ thạch cho thấy zymocin gốc Moniliellasp SS4.2 sinh bền nhiệt Khi gia nhiệt 100°C 15 phút hoạt tính có giảm khơng bị hồn hồn tồn.Tuy nhiên 60°C, 70°C zymocin bị hoạt tính, kết điện di cho thấy 60°C băng bị phân hủy nhiều mờ so với băng khác Điều giải thích Moniliellasp SS4.2 sinh protease hoạt động pH thấp nhiệt độ phân hủy zymocin sinh Song song với việc xử lý nhiệt độ mẫu zymocin gốc, mẫu zymocin gồm hai cấu tửđược tiến hành kiểm tra khả bền nhiệt nhiệt độ 40°C, Phạm Mai Hương 41 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 50°C, 60°C, 70°C, 80°C 30 phút, 90°C 100°C 15 phút Sau đem để đá lạnh Tiến hành kiểm tra khả bền nhiệt zymocin phương pháp đục lỗ thạch điện di SDS-PAGE gel acrylamide 12% Kết thu sau: 2G240250260 2702802902100 Hình 3.12: Độ bền nhiệt zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tửtại nhiệt độ khác Hình 3.13: Điện di SDS-PAGE gel acrylamide 12% khả bền nhiệt zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tử M- marker, 2G- mẫu không gia nhiệt, 240- mẫu gia nhiệt 40°C, 250- mẫu gia nhiệt 50°C, 260- mẫu gia nhiệt 60°C, 270- mẫu gia nhiệt 70°C, 280- mẫu gia nhiệt 80°C, 290- mẫu gia nhiệt 90°C, 2100- mẫu gia nhiệt 100°C Phạm Mai Hương 42 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Kết cho thấy zymocin sau tinh chế bao gồm hai cấu tử bền nhiệt Khi gia nhiệt nhiệt độ khác zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tử có hoạt tính, 60°C, 70°C, 80°C, 90°C 100°C hoạt tính có giảm khơng bị hoàn toàn Với mẫu zymocin gốc gia nhiệt 60°C 70°C hoạt tính zymocin bị hoàn toàn với zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tử có hoạt tính Điều cho thấy zymocin sau tinh chế khơng protease canh trường nên khôngbị phân hủy Kết điện di SDS-PAGE cho thấy nhiệt độ 60°C, 70°C, 80°C, 90°C 100°C băng lên đậm, điều giải thích zymcocin sau gia nhiệt để thử khả bền nhiệt lại tiếp tục gia nhiệt lần hai 100°C sau trộn sample buffer (để làm giãn mạch protein) làm biến tính protein Sau tách riêng biệt hai cấu tử phương pháp sắc ký trao đổi ion cột DEAE, hai cấu tử riêng biệt gia nhiệt nhiệt độ 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C 30 phút, 90°C 100°C 15 phút Sau đem để đá lạnh Tiến hành kiểm tra khả bền nhiệt phương pháp đục lỗ thạch trộn hai cấu tử lại với theo tỷ lệ 1:1 điện di SDS-PAGE gel acrylamide 12% cấu tử sau gia nhiệt Kết thu sau: TGT40T50T60 Phạm Mai Hương 43 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học T70T80T90T100 Hình 3.14: Độ bền nhiệt hai cấu tử sau gia nhiệt nhiệt độ khác vàđược trộn theo tỷ lệ 1:1 TG- mẫu không gia nhiệt, T40- mẫu gia nhiệt 40°C, T50- mẫu gia nhiệt 50°C, T60- mẫu gia nhiệt 60°C, T70- mẫu gia nhiệt 70°C, T80- mẫu gia nhiệt 80°C, T90- mẫu gia nhiệt 90°C, T100- mẫu gia nhiệt 100°C Hình 3.15: Điện di SDS-PAGE gel acrylamide 12% cấu tử – 20,7 kDa gia nhiệt nhiệt độ khác M- marker, 3G- mẫu không gia nhiệt, 340- mẫu gia nhiệt 40°C, 350- mẫu gia nhiệt 50°C, 360- mẫu gia nhiệt 60°C, 370- mẫu gia nhiệt 70°C, 380- mẫu gia nhiệt 80°C, 390- mẫu gia nhiệt 90°C, 3100- mẫu gia nhiệt 100°C Kết điện di SDS-PAGE cấu tử lại lên băng rõ, giải thích trình gia nhiệt diễn hai lần làm biến tính protein Phạm Mai Hương 44 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học Hình 3.16: Điện di SDS-PAGE gel acrylamide 12% cấu tử hai – 16,6 kDa gia nhiệt nhiệt độ khác M- marker, 4G- mẫu không gia nhiệt, 440- mẫu gia nhiệt 40°C, 450- mẫu gia nhiệt 50°C, 460- mẫu gia nhiệt 60°C, 470- mẫu gia nhiệt 70°C, 480- mẫu gia nhiệt 80°C, 490- mẫu gia nhiệt 90°C, 4100- mẫu gia nhiệt 100°C Qua kết cho thấy trộn hai cấu tử theo tỷ lê 1:1 có mẫu gốc mẫu gia nhiệt 40°C tạo vòng kháng nhiệt độ lại khơng có hoạt tính Điều chứng tỏ zymocin không bền nhiệt với riêng cấu tử khả bền nhiệt zymocin lại biểu rõ có liên kết hai cấu tử 3.2.2 Khả bền pH zymocin sau tinh chế Các nghiên cứu trước Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm cho thấy zymocin chủng Moniliellasp SS4.2 sinh bền pH có dải pH hoạt động rộng [2] Tuy nhiên dịch zymocin chưa qua tinh chế, chúng tơi tiến hành kiểm tra độ bền pH zymocin sau tinh chế đồng thời với dịch zymocin gốc pH: 2; 5; 7; 9; 11 phương pháp đục lỗ thạch Sau 24h nuôi cấy 28°C đem quan sát đo bán kính vòng kháng (mm) Kết thể hình Phạm Mai Hương 45 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Mẫu test (12.0- mẫu pH 2, 15.0- mẫu pH 5, 17.0- mẫu pH 7, 19.0- mẫu pH 9, 111.0- mẫu pH 11) Mẫu đối chứng (1’2.0- mẫu đối chứng pH 2, 1’5.0- mẫuđối chứng pH 5, 1’7.0- mẫuđối chứng pH 7, 1’9.0- mẫuđối chứng pH 9, 1’11.0- mẫuđối chứng pH 11) Bán kính vòng kháng mm mẫu test đối chứng 2 11 pH Hình 3.17.Độ bền pH zymocin gốc xử lý pH Kết hình 3.17 cho thấy zymocin chủng Moniliella sp SS4.2 sinh bền pH(từ 2-11).Tuy nhiên độ bền pH dịch zymocin gốc chưa qua tinh chế, chúng tơi tiến hành thử khả bền pH zymocin sau Phạm Mai Hương 46 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học tinh chế gồm hai cấu tử đểxem sau tinh chế zymocin giữ đặc tính bền pH khơng Kết thể hình 3.18 Mẫu test (22.0- mẫu pH 2, 25.0- mẫu pH 5, 27.0- mẫu pH 7, 29.0- mẫu pH 9, 211.0- mẫu pH 11) Mẫu đối chứng (2’2.0- mẫu đối chứng pH 2, 2’5.0- mẫuđối chứng pH 5, 2’7.0- mẫuđối chứng pH 7, 2’9.0- mẫuđối chứng pH 9, 2’11.0- mẫuđối chứng pH 11) Bán kính vòng kháng mm mẫu test đối chứng 2 11 pH Hình 3.18.Độ bền pH zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tử Kết hình 3.18 cho thấy zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tửbền pH.Độ bền zymocin so với mẫu đối chứng pH 2,0 đạt 84%, pH 5,0 pH 7,0 đạt 78%, pH 9,0 pH 11,0 93% Vì thế, zymocin thích hợp Phạm Mai Hương 47 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học sử dụng bảo quản loại thực phẩm có mơi trường acid sản phẩm lên men, đồ uống có nồng độ cồn thấp nước trái 3.2.3 Khả chịu kháng sinh chủng Saccharomyces cerevisiae SBY 2576 theo thời gian Để bước đầu tìm hiểu khả chịu kháng sinh zymocin tế bào mẫn cảm, tiến hành xử lý chủng mẫn cảm với dịch zymocin sau tinh chế baogồm hai cấu tửqua thời gian khác nhausau nhuộm tế bào chủng mẫn cảm xanh methylen quan sát kính hiển vi Màng tế bào tế bào sống có tính thấm chọn lọc, tế bào chết màng tế bào thấm tuyệt đối phụ thuộc hoàn toàn vào độ chênh lệch nồng độ chất tế bào ngồi dung dịch Vì vậy, xanh methylen từ dung dịch vào tế bào bên có nồng độ cao hơn, tế bào chết quan sát kính hiển vi có màu xanh methylen ta dễ dàng phân biệt tế bào sống tế bào chết Dịch tế bào chủng mẫn cảm SBY 2576 xử lý đệm phosphate citrate 50 mM pH 3,5 dùng làm mẫu đối chứng, dịch tế bào chủng mẫn cảm xử lý zymocin gồm hai cấu tử mẫu thí nghiệm Khảo sát mốc thời gian sau giờ, giờ, giờ, 24 để quan sát khả chịu kháng sinh zymocin chủng SBY 2576 Kết thu sau Phạm Mai Hương 48 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Bảng 5: Một số hình ảnh khả chịu kháng sinh zymocin Moniliellasp SS4.2 sinh chủng mẫn cảmSaccharomyces cerevisiae SBY 2576 mốc thời gian khảo sát Thời gian khảo sát Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm Tỷ lệ tế bào chết 1% Tỷ lệ tế bào chết 5% Tỷ lệ tế bào chết 0% Tỷ lệ tế bào chết 8% Sau Sau Phạm Mai Hương 49 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Sau Tỷ lệ tế bào chết 0,9% Tỷ lệ tế bào chết 29% Tỷ lệ tế bào chết 0,5% Tỷ lệ tế bào chết 35% Tỷ lệ tế bào chết 5% Tỷ lệ tế bào chết 88% Sau Sau 24 Phạm Mai Hương 50 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Kết cho thấy số lượng tế bào bắt màu xanh methylen mẫu thí nghiệm tăng dần theo mốc thời gian khảo sát từ đến 24 Tiến hành đếm số tế bào chết tổng số ảnh chụp qua kính hiển vi, sau chia trung bình tính tỷ lệ tế bào chết, thu kết sau: Mẫu đối chứng qua thời điểm khảo sát số tế bào bắt màu xanh methylen chiếm từ 0-1%, đến 24 số tế bào bắt màu tăng lên 3% số tế bào sống có giảm đinhưng khơng đáng kể Với mẫu thí nghiệm tỷ lệ tăng lên qua thời điểm rõ rệt đặc biệt sau 24 giờ, thời điểm sau 6%, sau 8,6%, sau 30% ,sau 36,9% sau 24 là81% Như sau 24 khả chịu kháng sinh chủng Saccharomyces cerevisiae SBY 2576kém nhiều lần, số tế bào chết tăng lên rõ rệt Qua kết kiểm tra khả chịu kháng sinh zymocin Moniliella sp SS4.2 sinh chủng mẫn cảmSaccharomyces cerevisiae SBY 2576 mốc thời gian khảo sát, nhận thấy tế bào chủng mẫn cảm chết dần dần, phải sau 24 có khác biệt rõ rệt Và thấy đa số tế bào nảy chổi tế bào diễn trình trao đổi chất bị chết sớm so với tế bào khác Điều lý giải tế bào nảy chồi diễn trình trao chất phải tiêu tốn nhiều lượng dẫn đến khả bị ức chế bị giết zymocin tác động lên lớn Chính tượng mở hướng nghiên cứu chế tác động zymocin sinh Moniliellasp SS4.2 lên chủng mẫn cảm SBY 2576 Phạm Mai Hương 51 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau trình nghiên cứu thu kết sau: Đã tinh chế riêng rẽ hai cấu tửcó khối lượng phân tử 16,6 kDa 20,7 kDa mang hoạt tính zymocin chủng Moniliella sp SS4.2 sinh phương pháp sau: phương pháp siêu lọc, kết tủa muối phân đoạnbằng muối (NH4)2SO4 , sắc ký tương tác kỵ nước cột Butyl Sepharose High Performance pH 7, sắc ký trao đổi ion cột DEAE Sepharose Fast Flow pH Zymocin sau tinh chế bền nhiệt (gia nhiệt 100°C 15 phút zymocin có hoạt tính) có dải pH hoạt động rộng (từ 2-11) Bước đầu nghiên cứu khả chịu kháng sinh zymocin tế bào mẫn cảm Saccharomyces cerevisiae SBY 2576 Kiến nghị Trên nghiên cứu bước đầu đặc tính zymocin chủng Moniliella sp SS4.2 sinh Cần nghiên cứu thêm về: - Cơ chế tác động zymocin sinh MoniliellaSS4.2 lên chủng mẫn cảm - Xác định chế tác động cấu tử hình thành lên hoạt tính zymocin - Xác định chất cấu tử Phạm Mai Hương 52 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đinh Đoàn Long Đỗ Lê Thăng (2008), “Cơ sở di truyền học phân tử tế bào” Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Phan Tố Nga, Vũ Nguyên Thành cộng (2003), “ Nghiên cứu sinh tổng hợp chế phẩm sinh học zymocin nhằm mục đích bảo quản sơ chế nông sản thực phẩm” Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật tháng 11 – 2003 Tài liệu tiếng Anh Bevan E.A., Makower M., (1963) “The physiological basis of the killer character in yeast”, Proc XI Int Congr Genet 1: 202- 203 De Hoog G.S (1999), “Ecology and evolution of black yeast and their relative”, the Royal NetherlDNAs Academy of Arts and Sciences Dooms L, Hennebert G.L, Verachtert H (1971), “Polyol synthesis and taxonomic characters in the genus Moniliella”, Antoni van Leeuwenhoek, 37, p 107-118 Hodgson V.J., Button D and Walker G.M (1995), “Anti-candida activity of a novel killer toxin from the yeast Williopsis mrakii” Microbiology, 141, pp 2003-2021 Lionel B., Edskes H., Ribas J.C and Wickner R.B (2000), “Yeast RNA Viruses (Totivirideae)”, Academic Press Encyclopedia of Virology Middelbeek E.J, Hermans J.M.H and Stumm C (1979), “Production, purification and properties of a Pichia kluyveri killer toxin”, Antonie van Leeuwenhoek, 45, pp 437-450 Q.-M Wang, B Theelen, M Groenewald, F.-Y Bai, T Boekhout (2014), “Moniliellomycetes and Malasseziomycetes, two new classes in Ustilaginomycotina”,Persoonia 33, 41–47 Phạm Mai Hương 53 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 10 Seki T., Choi E and Ryu D (1985), “Construction of killer yeast strain”, App Environ Microbiol, 49, pp 1211-1215 11 Sónia da Silva, Sílvia Calado, Cândida Lucas, Cristina Aguiar (2007) “Unusual properties of the halotolerant yeast Candida nodaensis Killer toxin”, CnKT Microbiological Research, Volume 163, Issue 2, 243251 12 United States Patent (1998), “Cloning of the zymocin gene and use of zymocin in beverages”, #57831 13 Vondrejs V and Palkova Z (1997), “Chemical Warfare among the Yeasts: the "killer" phenomenon, genetics and Applications” In: (Eds Spencer J.F.T andSpencer D.M.), Yeasts in natural and artificial habitats,Springer-Verlag Berlin Heidelberg 14 Wen-Bao Chen (2000), “Isolation, purification and characterisetion of a killer protein from Schwanniomycesoccidentalis”, Appl Environ Microbiol., 66, pp 53485352 Tài liệu Internet 15 “Các kỹ thuật sắc ký” http://dulieu.tailieuhoctap.vn/books/khoa-hoc-ky-thuat/cong-nghe-sinhhoc/file_goc_779730.pdf 16 “Công nghệ protein” http://www.hiast.edu.vn/dbt/attachments/article/147/Bai%20giang%20Co ng%20nghe%20protein.pdf Phạm Mai Hương 54 Niên khóa: K19 – Lớp 1203 ... 1.1 NẤM MEN MONILIELLA 1.1.1 Giới thiệu chung nấm men Moniliella 1.1.2 Moniliella sp SS4.2 1.2 ZYMOCIN 1.2.1 Khái quát zymocin 1.2.2 Đặc điểm zymocin. .. Sinh học làm nên khác biệt mẻ zymocin chủng Moniliellasp SS4.2 sinh ra.Do đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài: Nghiên cứu đặc tính zymocin nấm men Moniliella sp SS4.2 với mục đích tiếp tục tinh... Phẩm bước đầu tiến hành nghiên cứu tinh chế zymocin chủng Moniliella sp SS4.2 sinh ra .Nghiên cứu cho thấy zymocin gốc chủng Moniliella sp SS4.2sinh có khả ức chế nấm men có mặtNaCl, bền nhiệt