Tìm hiểu hiện trạng nhiễm mầm bệnh vi rút trên tôm thẻ chân trắng nuôi ở ĐBSCL

Phần ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) đồng châu thổ lớn, có hệ thống sơng ngòi chằng chịt, bờ biển dài với điều kiện khí hậu thuận lợi cho việc phát triển thủy sản trở thành nơi sản xuất thủy sản chủ lực, chiếm 80% sản lượng thủy sản nước Nuôi trồng thủy sản ngày phát triển, thành phần nuôi đa dạng Hiện tôm thẻ chân trắng nuôi phổ biến tỉnh ĐBSCL như: Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng… Thẻ chân trắng đối tượng có giá trị kinh tế cao thị trường tiêu thụ rộng, thời gian sinh trưởng ngắn (3 – 3,5 tháng), suất cao (trên tấn/ha), thâm canh đạt đến 20 tấn/ha Nhờ có giá trị dinh dưỡng cao mà tôm chân trắng người tiêu dùng thị trường lớn ưa chuộng Mỹ thị trường tiêu thụ tôm chân trắng lớn sau Châu Âu Nhật Bản (Ts Trần Viết Mỹ, 2009) Tuy khơng có lịch sử lâu đời tôm sú TTCT đối tượng ni có nhiều triển vọng Tuy nhiên TTCT tiềm ẩn nhiều nguy bộc phát dịch bệnh nguy hiểm vi-rút gây như: vi-rút gây bệnh hoại tử vỏ quan tạo máu (IHHNV), vi-rút gây Hội chứng Taura (TSV), vi-rút gây bệnh hoại tử (IMNV), …gây thiệt hại lớn đến sản lượng (tỉ lệ chết cao 40-90%) Để đưa thẻ chân trắng vào hệ thống nuôi thủy sản vùng ĐBSCL cách an tồn hiệu phải kiểm sốt dịch bệnh cách chặt chẽ từ giai đoạn đầu chọn giống, nhằm phát sớm mầm bệnh đề biện pháp phòng ngừa hiệu cho hệ thống ni Do đề tài: “Tìm hiểu trạng nhiễm mầm bệnh vi-rút tôm thẻ chân trắng nuôi ĐBSCL” thực 1.2 Mục tiêu đề tài Tìm hiểu diện số mầm bệnh vi-rút tôm thẻ chân trắng nuôi ĐBSCL 1.3 Nội dung nghiên cứu Xác định diện số loại vi rút (WSSV, TSV, IHHNV, MBV) TTCT giai đoạn giống Xác định diện số loại vi rút (WSSV, TSV, IHHNV, MBV) TTCT giai đoạn nuôi thương phẩm Phần LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tình hình dịch bệnh tôm thẻ chân trắng 2.1.1 Trên giới Sản lượng ngành nuôi trồng Thủy Sản không ngừng tăng qua thập niên gần Trong đó, nghề ni tơm giới phát triển mạnh từ năm 1970 Năm 1975, Ecuador dẫn đầu sản lượng tôm nuôi Tây Bán Cầu Đài Loan Sản lượng tôm nuôi giới tiếp tục tăng từ 50.000 năm 1975 lên đến 450.000 năm 1988 Theo FAO, đến năm 1990 sản lượng tôm nuôi giới đạt 900.000 tấn/năm Năm 1992, Thái Lan trở thành nước có sản lượng tơm ni đứng đầu giới (Trần Ngọc Hải, 2004) Tuy nhiên, với phát triển nghề ni dịch bệnh bùng phát ngày nhiều hơn, vòng chưa đầy 15 năm dịch bệnh gây thiệt hại 100.000 tôm nuôi, làm sản lượng tôm nuôi giới từ 733.000 năm 1993 giảm xuống 600.000 năm 2007 (Nguyễn Văn Hảo, 2002) Vào năm 1984 Bệnh hoại tử vỏ quan tạo máu (IHHNV) lần đầu phát Hawaii gây chết hàng loạt tôm P stylirostris (90%) Sau phát Mỹ vùng ni ven bờ biển Thái Bình Dương Khi nhiễm IHHNV, tơm thẻ chân trắng thường bị dị chũy biến dạng mất, thân bị cong, chậm lớn làm tỉ lệ tôm nhỏ cao thu hoạch Trong đó, tơm sú lại khơng biểu triệu chứng nhiễm IHHNV có khả mang mầm bệnh suốt thời gian sống chúng Do vậy, khả lây lan mầm bệnh IHHNV sang tơm thẻ chân trắng có điều kiện thuận lợi cao (Flegel, 2002) Tiếp theo bệnh đốm trắng (WSSV) loại vi rút gây bệnh nguy hiểm tôm sú tôm thẻ chân trắng với tỉ lệ chết lên đến 90% Lần bệnh công bố Nhật Bản năm 1993 Sau vi rút nhanh chóng lây lan nhanh khắp vùng nuôi tôm Châu Á Năm 1995, WSSV nhiễm gây ảnh hưởng tôm thẻ chân trắng Ngồi WSSV lây nhiễm đến số lượng lớn lồi tơm giáp xác khác P merguiensis, Metapenaeus ensis, Metapenaeus monoceros, Macrobrachium rosenbergiii, Palaemon setiferus, Euphausia superba ký chủ nguyên nhân lây truyền WSSV (Flegel, 1997; Hossain, 2001) Theo tổ chức thú y giới, hội chứng Taura xảy Ecuador vào năm 1992 gần sông Taura làm thiệt hại gần 90% sản lượng tôm thẻ chân trắng, giảm 15-25% sản lượng giới Đồng thời bùng phát Honduran làm giảm 18% sản lượng năm 1994 31% năm 1995 (Corral et al.,1999) Sau bệnh lan nhanh khu vực Châu Mỹ Latinh : Colombia, CostaRica, Salvado, Guatemale, Brazil,…Bệnh xảy Châu Á vào năm 1999 Trung Quốc Đài Loan lan sang quốc gia khác như: Thái Lan, Malaysia, Indonesia,… Theo cơng bố OIE vùng Châu Á- Thái Bình Dương có nhiều báo cáo xuất TSV số quốc gia : Myanma, Trung Quốc, Indonesia, Thái Lan Việt Nam (OIE, 2009) Gần bệnh hoại tử (IMNV) phát năm 2002 ao nuôi tôm thẻ chân trắng miền Đông Bắc Braxin Sau bệnh lây lan sang nước khác thuộc khu vực Châu Á Indonesia, Thái Lan tỉnh Hải Nam, Trung Quốc Đây loại virus có khả phát dịch đối tượng tôm nuôi tôm thẻ chân trắng, tôm sú tôm xanh Khi xảy bệnh, ao tơm bị thiệt hại từ 40 -70% Quá trình lây lan IMNV qua châu lục khác ghi nhận nhập chuyển tôm bố mẹ P.vannamei Vi rút đưa vào danh sách cần theo dõi NACA/FAO/OIE vào tháng năm 2006 (Poulos et al., 2006) 2.1.2 Ở Việt Nam Tôm thẻ chân trắng du nhập vào Việt Nam từ năm đầu kỷ 21, Quảng Ngãi địa phương có nghề ni tơm thẻ chân trắng sớm tỉnh có diện tích, suất, sản lượng kỹ thuật ni cao nước Từ vài nuôi tôm thẻ chân trắng năm 2003, đến diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng địa bàn tỉnh Quảng Ngãi đạt đến gần 600 Năng suất nuôi bình qn đạt khoảng 7tấn/ha/vụ, đặt biệt vùng ni tôm cát suất đạt 18tấn/ha/vụ, sản lượng tơm thẻ chân trắng ni năm 2008 tồn tỉnh đạt 5.440 (http://www.quangngai.gov.vn) Từ tháng năm 2002, tôm thẻ chân trắng thức Bộ Thủy sản cấp phép nuôi với qui mô nhỏ thử nghiệm tìm hiểu ảnh hưởng tích cực tiêu cực đến môi trường nghề nuôi tôm Trong thời gian đầu, chín cơng ty thương mại Bộ Thủy sản cấp phép nhập 48 triệu tôm P vannamei bột, 5900 tôm bố mẹ từ Hawaii Trung Quốc, kiểm dịch nghiêm ngặt để đảm bảo nguồn tôm không mang mầm bệnh Tuy nhiên, thời gian gần tôm thẻ chân trắng nuôi tương đối phổ biến nên nguồn tôm giống nhập vào Việt Nam lớn quan quản lý khó quản lý tất nguồn tốm giống nhập vào nước ta Theo Báo cáo kết Nuôi Trồng Thủy Sản năm 2003: nước có 546.757 ni tơm nước lợ thương phẩm, diện tích có tơm ni bị bệnh chết 30.083 Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ni tơm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tơm bị chết nước Chủ yếu bệnh đốm trắng (WSSV) bệnh MBV (Monodon Baculovirus), bệnh vi khuẩn Vibrio, bệnh ký sinh trùng, dinh dưỡng gần xuất thêm bệnh phân trắng, teo gan vài nơi (Hà Anh, 2004) Đầu năm 2008, Bộ NN&PTNT thức cho phép tỉnh Nam Bộ ni thâm canh tơm TCT khẳng định vị quan trọng cấu sản xuất, xuất tôm Việt Nam (Năm 2010, XK tôm đạt tỉ USD, chiếm 1/3 tổng kim ngạch xuất thủy sản nước (5 tỉ USD), tơm TTCT đóng góp 26% giá trị xuất khẩu) Năm 2010, Phú Yên dịch bệnh tôm thẻ chân trắng bùng phát nhanh chóng làm thiệt hại 238,6 ha, chiếm 61,2% diện tích thả ni, dịch bệnh xảy chủ yếu tập trung huyện Tuy An 3,6 huyện Đơng Hòa 235 (Ngun Lưu, 2010) Theo thống kê tổng cục thủy sản Việt Nam năm 2011, tỉnh ĐBSCL thiệt hại diện tích thả tơm có đến 66.593ha (trong 64.758ha tôm sú 1.835ha tôm thẻ chân trắng), tăng gấp 2,3 lần so với thời điểm năm 2010 Cụ thể, địa phương có diện tích ni tơm bị thiệt hại nặng Sóc Trăng 20.514ha, Bạc Liêu 13.536ha, Kiên Giang 11.252ha, Cà Mau 9.933ha, Trà Vinh 7.628ha, Long An 2.072ha,…đã làm ảnh hưởng đến sản lượng chung nước Theo ghi nhận chung tơm sau thả nuôi chết phổ biến giai đoạn từ 15-40 ngày tuổi (www.agroviet.gov.vn) 2.2 Sơ lược số bệnh vi rút tôm 2.2.1 Bệnh đốm trắng 2.2.1.1 Tác nhân gây bệnh Bệnh đốm trắng White spot syndrome virus (WSSV) gây ra, có dạng hình trứng Thuộc giống Whispovirus, họ Nimaviridae Có dòng vi rút giải mã hồn chỉnh trình tự gen, vi rút có DNA mạch đơi (dsADN), đường kính 120 – 150 nm, chiều dài 270 – 290 nm WSSV tồn 30 ngày 300C nước biển phòng thí nghiệm Trong ao ni WSSV tồn – ngày Vi rút đốm trắng bất hoạt 500C (dưới 120 phút) 600C (dưới phút) Một chu kỳ chép vi rút 20h nhiệt độ 250C 2.2.1.2 Dấu hiệu bệnh lý Tôm bị bệnh đốm trắng thường có dấu hiệu tiêu thụ thức ăn giảm sút rõ ràng, đặc biệt có trường hợp tăng cường độ bắt mồi bình thường, sau vài ngày có tượng bỏ ăn Tôm bệnh dạt vào bờ, lờ đờ, tôm yếu tầng mặt với dấu hiệu đặc trưng xuất đốm trắng tròn lớp vỏ kitin đường kính 0,5 – nm, đặc biệt đốm trắng tập trung giáp đầu ngực Tôm bệnh có chuyển sang màu đỏ Hiện tượng chết xảy sau đó, tỷ lệ chết cao lên tới 100% vòng – 10 ngày Hình 2.1: Những đốm trắng vỏ đầu ngực thân tôm nhiễm WSSV Khi tôm bị bệnh WSSV, mô số quan như: mang, dày, biểu mô vỏ kitin, quan tạo máu có biến đổi đặc thù Những tế bào bị nhiễm vi-rút thể phình to nhân tế bào, chứa thể vùi (Inclusion bodies), hình cầu, hình trứng bắt màu tím hồng Haematoxylin Eosin Khi bệnh nặng, thể vùi thường chiếm hết thể tích nhân tế bào phình to Hình 2.2 Mang tơm bị nhiễm WSSV ( T.W Flegel) 2.2.1.3 Phân bố lan truyền bệnh Bệnh đốm trắng lần phát khu vực Đài Loan – Trung Quốc vào năm 1991 – 1992 Ở Nhật phát vào 1993 từ tơm nhập Trung Quốc Sau phát bệnh số nơi khác như: Hàn Quốc, Đông Nam Á, Nam Á, Ấn Độ, Địa Trung Hải, Trung Đông số nước Châu Mỹ (OIE,2008) Bệnh xảy từ tôm giống đến tôm trưởng thành khu vực nuôi thâm canh quảng canh Bệnh phát nhiều động vật giáp xác tự nhiên lồi tơm he, tơm nước ngọt, cua, tôm hùm, chân bèo ấu trùng, côn trùng Động lực hầu hết với lồi tơm có giá trị kinh tế (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004) WSSV truyền theo hai đường: Truyền dọc: từ bố mẹ bị nhiễm bệnh Nỗn bào tơm nhiễm vi rút đốm trắng khơng thành thục được,nhưng q trình tơm mẹ đẻ trứng có thẻ thải mơi trường có vi rút đốm trắng ấu trùng tôm nhiễm vi rút Truyền ngang: vi rút từ tôm bệnh, vật chủ trung gian (giun nhiều tơ,artermia…) mang mầm bệnh truyền sang mầm bệnh sẵn có nước truyền sang cho tôm khỏe 2.2.1.4 Phương thức chẩn đoán Theo tài liệu FAO Hướng dẫn chẩn đốn bệnh thủy sản Châu Á có phương pháp để chẩn đoán WSSV: Dự chẩn Các quan sát chung (Mức độ 1) Bệnh đốm trắng thường báo hiệu trước việc tôm ngừng ăn vài ngày, tôm chết bơi gần mặt nước bờ ao ni Những tơm vùi màu trắng lẫn biểu bì thân tôm thường hay biến đỏ Các thể vùi lớp vỏ thay đổi từ chấm nhỏ thành đĩa có đường kính vài mm chúng liên kết lại với thành mãng lớn Chúng dễ nhận thấy nhờ việc bóc lớp vỏ kitin khỏi giáp đầu ngực, loại bỏ mô bám vỏ kitin soi ánh sáng Sự xuất đốm trắng lớp vỏ kitin vài nguyên nhân khác tạo Riêng trường hợp mà Wang cộng sự, 2000 thông báo gọi Hội chứng vi khuẩn đốm trắng (BWSS) dễ nhầm lẫn với bệnh đốm trắng (WSSV) Do đó, kiểm tra mô bệnh học cần thiết để chẩn đoán khẳng định Làm tiêu ép nhanh (Mức độ 2) Hai kiểu làm tiêu nhanh dùng để dự chẩn bệnh đốm trắng: (i) mẫu tôm tươi, không nhuộm màu, cố định Formalin 10%, soi tối kính hiển vi với kính tụ quang ướt, (ii) mô cố định nhuộm màu H&E Mô bệnh học (Mức độ 3) Tôm nghi bị bệnh đốm trắng chết cần cố định dung dịch Davidson’s nhuộm màu Heamatoxylin Eosin (H&E) Mô bệnh học bệnh đốm trắng rõ rệt cho phép chẩn đoán khẳng định Tơm chết vi-rút đốm trắng có biểu hủy hoại mơ trung bì ngoại bì Nhân tế bào bệnh bị phình to nhuộm màu với H&E nhìn thấy thể vùi trung tâm bắt màu thuốc nhuộm kiềm từ nhạt đến sẫm bao chất nhiễm sắc Cũng nhìn thấy thể vùi nội nhân mẫu ép mang mô lớp kitin lát cắt mô Những mô biểu hiên rõ để xét nghiệm mô lớp kitin dày, giáp đầu ngực mô mang Kiểm khẳng định Việc chẩn đoán bệnh trọn vẹn hồn thành kỹ thuật PCR, kỹ thuật lai chỗ, , Phương pháp kính hiển vi điện tử Các mơ thích hợp cho việc kiểm tra kính hiển vi điện tử mơ lớp kitin, mang chân bò kiểm tra trước mơ học nhuộn ép nhanh thấy rõ nhân bị phồng với thể vùi Cowdry type A chất nhiễm sắc bao quanh thể vùi bắt màu kiềm Cố định mô 24 chất cố định Kính hiển vi điện tử nhuộm màu âm Các tiêu huyết tương cuả tơm nhuộm âm cho thấy virion có phần phụ dạng bên tế bào bệnh có nhân trương phồng, khơng thấy rõ vùi 2.2.2 Bệnh hoại tử vỏ quan tạo máu 2.2.2.1 Tác nhân gây bệnh Bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biểu mô vi rút Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus – IHHNV gây ra, họ Parvoviridae, acid nucleic ADN đơn mạch, chiều dài 4,1kb, đường kính 22nm IHHNV có nhân tế bào tuyến anten, tế bào hệ bạch huyết, tế bào mang, tế bào dây thần kinh, tồn nhiều dòng vi rút khác phân bố theo địa lý (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004) 2.2.2.2 dấu hiệu bệnh lý Tôm nhiễm bệnh IHHNV thường lờ đờ, hoạt động yếu, chủy biến dạng (hình 2.4) Tùy lồi tơm khác mà có dấu hiệu bệnh lý khác Đặc trưng như: Tôm sú (Penaeus monodon) bị bệnh lúc chết thường chuyển màu xanh, phần bụng màu đục Còn Tơm chân trắng (P vannamei) thể hội chứng dị hình còi cọc, tơm giống (Juvenile) chủy biến dạng, sợi anten quăn queo, vỏ kitin xù xì biến dạng Tuy vi rút không gây chết cho tôm sú lại tác nhân gây chậm lớn, dị hình, đặc biệt nguy hiểm cho tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) gây chết hang loạt tôm Penaeus stylirostris (Flegel, 1997) Hệ số còi cọc đàn tơm giống chân trắng bị bệnh IHHNV thường từ 10-30%, bị bệnh nặng hệ số còi cọc lớn 30% có tới 50% Tơm P stylirostris bị bệnh dạng cấp tính, tỷ lệ chết cao (có thể lên đến 90%) (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004) Khi tôm nhiễm bệnh, IHHNV tìm thấy nhiều phận mang, biểu bì ruột trước, tuyến râu, dây thần kinh Hình 2.3: Vi rút IHHNV đường kính 22nm hệ bạch huyết tôm sú nuôi ao ương (DV Lightner) 2.2.2.3 Phân bố lan truyền bệnh Năm 1984 IHHNV lần phát hiên Hawai gây chét hàng loạt tơm Penaeus stylirostris (90%) Sau phát Mỹ vùng nuôi ven bờ biển Thái Bình Dương (OIE,2009) Những lồi tơm bị nhiễm IHHNV: (theo V.A.Graindorge & T.W Flegel, 1999) P.Vannamei, P Mondon, P.Stylirostris, P.Occidentalis, P Californiensis, P Semisalcatus, P Japonicus Bệnh IHHNV lan truyền chiều dọc chiều ngang lồi tơm (P stylirostris, P.vannamei) Vi rút truyền từ tôm bố mẹ sang tôm ấu trùng lây nhiễm giai đoạn sớm ấu trùng tơm Có khả lây qua nguồn nước ăn xác tôm nhiễm IHHNV Vi rút bệnh lây từ mẹ sang ấu trùng (phương dọc) không phát bệnh, thường đến postlarvae 35 dấu hiệu bệnh quan sát tỷ lệ chết cao, vi rút lây lan theo chiều ngang tôm giống ảnh hưởng mãnh liệt, tôm trưởng thành đơi có dấu hiệu bệnh chết (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004) 10  Cho 24 µl hỗn hợp vừa trộn vào ống eppendorf 0,5ml ghi tên  Thêm µl ADN khn mẫu dối chứng vào phản ứng  Thực phản ứng PCR theo chu kỳ nhiệt Điện di: Quá trình điện di thực với dung dịch TAE 0,5X thạch chứa 1% agarose Chuẩn bị thạch (gel): Pha 1% agarose 40ml dung dịch đệm TAE 0,5X, sau đun nóng dung dịch agarose lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn Để thạch nguội nhiệt độ phòng 10 phút, lúc nhiệt độ thạch giảm xuống khoảng 50 – 600C cho 2µl Ethidium bromide (nồng độ 10mg/ml) vào lắc nhẹ cho Ethidium bromide hòa tan vào thạch Chuẩn bị khn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, đỗ thạch vào khuôn cho đạt bề dày mong muốn (< 8mm), để thạch nguội nhiệt độ phòng Khi thạch đặc, gỡ lược dặt khuôn thạch vào bồn điện li, đỗ dung dịch TAE 0,5X cho ngập mặt thạch Quá trình điện di: dùng micropipette lấy 10 µl mẫu cần điện di trộn với giọt dung dịch nạp mẫu ( thay đầu tip sau lần sử dụng) cho mẫu vào giếng theo thứ tự, kèm theo giếng chứa thang ADN Chạy điện di 40 phút dòng điện 90 Volt Sau điện di (thấy vệt màu xanh cách giếng khoảng 22,5cm) lấy khuôn khỏi bồn điện di quan sát kết với thiết bị chụp xử lý ảnh gel Đọc kết quả: Kết điện di ghi nhận máy đọc gel Dựa vào thang ADN 1kb plus để xác định trọng lượng phân tử sản phẩm khuếch đại Sản phẩm khuếch đại IHHNV vạch tương ứng với vạch 703 bp Mẫu đối chứng âm khơng vạch 3.2.2.3 Qui trình PCR phát WSSV (Trần Thị Tuyết Hoa, 2011) Qui trình nested-PCR sử dụng đoạn mồi P1, P2, P3, P4 (Kimura et al., 1996) để phát WSSV cặp mồi deca-20a2, deca-20s9 phát gen nhóm giáp xác mười chân (CSIRO, 2008) Qui trình thiết kế bao gồm hai bước với thành phần phản ứng bước sau: 29 Bảng 3.2: Thành phần hóa chất tham gia trình khuếch đại phản ứng PCR phát WSSV Tổng thể tích bước 20μ Bước Dung dịch hóa chất Nước Bước Nồng độ Dung dịch hóa chất Nước - PCR buffer 1X PCR buffer Nồng độ 1X MgCl2 1,5mM MgCl2 1,0mM dNTPs mix 200μM dNTPs mix 200μM mồi deca-20s9 10pmol mồi deca-20s9 10pmol mồi deca-20a2 10pmol mồi deca-20a2 10pmol mồi P1 20pmol mồi P3 20pmol mồi P2 20pmol mồi P4 20pmol Taq ADN Polymerase ADN khuôn 1,5U Taq ADN Polymerase Sản Phẩm bước - Điều kiện phản ứng: ( chu kỳ nhiệt) 940C phút 940C 30giây 560C 30 giây lặp lại 30 lần 720C phút Và 720C phút kết thúc 30 1,5U - Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng phản ứng PCR bước bước Trình tự mồi Tên mồi P1 5’-ATC-ATG-GCT-GCT-TCA-CAG-AC-3’ P2 5’-CGC-TGG-AGA-GGA-CAA-GAC-AT-3’ P3 5’-TCT-TCA-TCA-GAT-GCT-ACT-GC-3’ P4 5’-TAA-CGC-TAT-CCA-GTA-TCA-CG-3’ Deca-20a2 5’-ACT-TCC-CCC-GGA-ACC-CAA-AGA-CT- 3’ Deca-20s9 5’-GGG-GGC-ATT-CGT-ATT-GCG-A- 3’ Điện di ( tương tự mục 3.2.2.1) Kết  vạch vị trí 240bp ADN chiết tách tốt  vạch vị trí 982 bp mẫu nhiễm WSSV (sản phẩm PCR bước 1)  vạch vị trí 570 bp mẫu nhiễm WSSV (sản phẩm PCR bước 2) 31 3.2.2.4 Quy trình PCR phát MBV (Belcher ADN Young, 1998) Khuếch đại Bảng 3.4: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình PCR phát MBV Hóa chất/dung dịch Nước Nồng độ Thể tích 13,75 µl Dung dịch đệm (5X) 1X µl MgCl2 (25 mM) 1.5 mM 1.5 µl dNTPs (10 Mm) 0.2 mM 0.5 µl Taq DNA polymerase (5 UI/ µl) 2.5 UI 0.25 µl Mồi MBV F (10 µM) 0.4 µM µl Mồi MBV R (10 µM) 0.4 µM µl ADN khn 400 ng µl 25 µl Tổng thể tích Điều kiện phản ứng 950C phút 950C 30 giây Sau 600C phút Lặp lại chu kỳ 35 lần 720C phút 720C phút Điện di: ( tương tự mục 3.2.2.1) Đọc kết quả: Mẫu vạch vị trí 361 bp mẫu dương tính với MBV 3.2.2.5 Quy trình RT-PCR phát hiệnTSV ( Lê Phước Hiện, 2012) Ly trích ARN với Trizol - Cho 50-100 mg mẫu (5-10 tơm post) vào ống eppendorf 1,5ml có chứa 1000µl Trizol (lượng mẫu khơng vượt q 10% trizol) - Nghiền mẫu giữ nhiệt độ phòng phút 32 - Ly tâm 12000 vòng 10 phút 40C để tạo phần viên - Chuyển phần dịch sang ống eppendorf 1,5ml - Thêm 200µl chloroform/1ml Trizol Lắc cẩn thận tay 15 giây - Ủ 15-300 C 2-3 phút - Ly tâm 12000vòng/phút 40C 15 phút - Chuyển phần dịch phía sang ống eppendorf 1,5 - Thêm 500µl isopropanol/1ml Trizol Ủ 15-300C 10 phút - Ly tâm 12000 vòng/phút 10 phút 40C, sau rút bỏ isopropanol - Rửa phần viên ethanol 75% (1ml ethanol 75%/ 1ml Trizol) - Trộn vortex ly tâm 7500 vòng/phút 40C phút Cẩn thận rút bỏ hoàn toàn Ethanol - Làm khô phần viên 5-10 phút (air dry Vaccumn) Lưu ý không làm khô phần viên máy ly tâm chân khơng – vacumn centrifuge) - Hòa tan phần viên với 40 µl TE buffer, trữ -800C Tạo cDNA ( Complementary DNA) Sử dụng mồi Random Hexamers: Trộn hỗn hợp A: Bảng 3.5: Thành phần hóa chất hỗn hợp A Hóa chất/ dung dịch Thể tích dNTP (10mM) 0,5µl Mồi Random Hexamers ( 50ng/µl) 0,5µl Mẫu RNA (200ng/µl) 5µl Nước 0,5µl Vortex nhẹ hỗn hợp ủ 650C phút Sau ủ hỗn hợp đá phút Sau ly tâm nhẹ hổn hợp Trộn hỗn hợp B: 33 Bảng 3.6: Thành phần hóa chất hỗn hợp B Hóa chất/ dung dịch Thể tích Dung dịch đệm 5X 2µl DTT 0,5µl SuperScript III Reverse transcriptase 0,5µl Hỗn hợp B ủ 420C phút Giữ nhiệt độ phòng khoảng phút Trộn hỗn hợp B vào hỗn hợp A: Điều kiện phản ứng: 250C phút 550C 50 phút 700C 15 phút Giữ 250C Khuếch đại cDNA Bảng 3.7: Thành phần hóa chất phản ứng khuếch đại (qui trình phát TSV Navarro et al., 2009) Hóa chất Nồng độ Nước Dung dịch đệm 1X MgCl2 2,5mM dNTPs 300µM Taq DNA polymerase 2,5U Mồi 7171F (10 µM) 0,62µM Mồi 7511R (10 µM) 0,62µM Hàm lượng cDNA 1µl 34 Điều kiện phản ứng: 600C 30 phút 950C phút Sau đó: 950C 45 giây 600C 45 giây Lặp lại 35 chu kỳ Kết thúc: 600C phút Giữ sản phẩm 160C phút Điện di Quá trình điện di thực với dung dịch TAE 0,5X thạch chứa 1,5% agarose Chuẩn bị thạch (gel): đung nóng dung dịch agarose lò vi sóng agarose tan hồn tồn Sau để dung dịch nguội khoảng 50-60oC cho Ethium Bromide vào đổ agarose vào khy chuẩn bị trước Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ khay đựng gel khoảng 0,8cm Điện di: Dùng pipette hút 10µl cho mẫu cần phân tích trộn với giọt 6X Loading Dye cho vào giếng Sử dụng thang AND để xác định khối lượng phân tử sản phẩm PCR Sau đó, nối bồn điện di với nguồn điện 90V (dòng điện từ 80-150V, khơng vượt q 150V) để chạy gel 30-45 phút Ngừng điện di màu xanh đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel Đặt gel lên bàn UV để đọc kết Đọc kết quả: Mẫu vạch 341 bp mẫu dương tính với TSV 35 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát khả nhiễm mầm bệnh vi rút tôm thẻ chân trắng phương pháp PCR Ứng dụng phương pháp PCR phát nhanh tác nhân gây bệnh dạng tiềm ẩn giúp cho trình chọn lọc giống tốt cho q trình ương ni Do vậy, đề tài thử nghiệm phân tích tổng số 43 mẫu tơm thẻ chân trắng bao gồm: 35 mẫu tôm giống mẫu tôm thịt (Bảng 4.1) Các mẫu tôm thẻ chân trắng hai giai đoạn thu ba tỉnh Bạc Liêu, Cà Mau Sóc Trăng Tại Cà Mau, tổng số 15 mẫu tôm giống thu vào đợt thả giống vụ nuôi năm 2011 Tại Bạc Liêu, tổng số 20 mẫu tôm giống thu vào đợt thả giống vụ nuôi 1, dự thả vào khoảng tháng năm 2012 Tại Sóc Trăng, tổng số mẫu tôm thẻ chân trắng giai đoạn nuôi thịt thu ngày 27/3/2012 Đây mẫu thu thu từ ao tôm thẻ chân trắng có bệnh bộc phát Bảng 4.1 Tỉ lệ nhiễm mầm bệnh vi rút mẫu phân tích Mầm bệnh Số mẫu nhiễm Tỉ lệ nhiễm % IHHNV 0/43 0% WSSV 0/43 0% MBV 5/43 11,6% TSV 14/43 32,6% Nhiễm kép MBV, TSV 5/43 11,6% TSV, IHHNV vi rút có khả gây thiệt hại cho nghề nuôi tôm thẻ chân trắng (OIE, 2009) Kết phân tích PCR cho thấy, số 43 mẫu tôm thẻ chân trắng thả nuôi ba vùng ni tơm trọng điểm ĐBSCL phát nhiễm hai loài vi rút nêu với tỷ lệ tương đối cao (14/43 mẫu phân tích) Ngồi ra, tượng nhiễm kép TSV MBV phát với 5/43 mẫu chiếm tỉ lệ 11,6% Tuy vậy, số 43 mẫu khảo sát điểm khả quan cho thấy chưa phát nhiễm lồi vi rút nguy hiểm cho nghề ni tơm thẻ chân trắng tôm sú IHHNV WSSV 36 4.1.1 Kết phát IHHNV phương pháp PCR Khi tôm thẻ chân trắng bị nhiễm IHHNV thường dạng mãn tính thể số đặc điểm còi cọc, dị dạng hay gọi “hội chứng dị hình còi cọc” Chính vậy, IHHNV nhiễm tôm thẻ chân trắng đáng ý kiểm tra nhằm phát bệnh sớm để giảm thất sản lượng cho người ni tơm IHHNV kiểm tra nhiễm tổng số 43 mẫu thu Bạc Liêu, Cà Mau Sóc Trăng IHHNV kiểm tra với qui trình PCR bước (Dương Thị Kim Loan, 2009) (Hình 4.1) Hàm lượng ADN sử dụng phản ứng khuếch đại phát IHHNV pha lỗng với nồng độ 200 (ng/ µl) M (-) (+) 10 703 bp Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm PCR phát IHHNV Giếng M: Thang đo, Giếng (-): đối chứng âm, Giếng (+): đối chứng dương, Giếng 1: mẫu 05, Giếng 2: mẫu 20, Giếng 3: mẫu 26, Giếng 4: mẫu 35, Giếng 5: mẫu 37, Giếng 6: mẫu 44, Giếng 7: mẫu 45, Giếng 8: mẫu 46, Giếng 9: mẫu 47, Giếng 10: mẫu 48 Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy tất mẫu tơm giống tơm thịt âm tính với IHHNV Đối chứng dương vạch 703 bp đối chứng âm không vạch chứng tỏ qui trình chạy tốt Như vậy, mẫu tơm thẻ chân trắng giai đoạn giống giai đoạn nuôi thịt chọn thu ngẫu nhiên vụ nuôi năm 2011 2012 ba tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu Cà Mau chưa phát thấy mầm bệnh IHHNV Do vậy, số lượng mẫu cần tăng lên để khẳng định thêm diện mầm bệnh khu vực nghiên cứu 37 4.1.2 Kết phát WSSV phương pháp PCR WSSV có khả bộc phát mạnh, lây lan nhanh vùng ni tơm trọng điểm chưa có phương pháp điều trị hữu hiệu Do đó, việc phát sớm bệnh để kịp thời xử lý nhằm giảm thiệt hại cho người nuôi tôm WSSV kiểm tra nhiễm tổng số 43 mẫu thu Bạc Liêu, Cà Mau Sóc Trăng WSSV kiểm tra với qui trình PCR hai bước (Trần Thị Tuyết Hoa, 2011) (Hình 4.2) M 10 11 12 13 14 982bp 240bp 570bp Hình 4.2 : Kết điện di sản phẩm PCR hai bước phát WSSV Giếng 1: đối chứng âm b1, Giếng 2: đối chứng dương b1, Giếng 3: mẫu 05 b1, Giếng 4: mẫu 20 b1, Giếng 5: mẫu 26 b1, Giếng 6: mẫu 35 b1, Giếng 7: mẫu 37 b1, Giếng M: Thang đo, Giếng 8: mẫu 05 b2, Giếng 9: mẫu 20 b2, Giếng 10: mẫu 26 b2, Giếng 11: mẫu 35 b2, Giếng 12: mẫu 37 b2, Giếng 13: đối chứng âm b2, Giếng 14: đối chứng dương b2 Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy tất mẫu tôm giống tôm thịt âm tính với WSSV Đối chứng dương vạch 982bp cho bước ; 570bp cho bước đối chứng âm khơng vạch chứng tỏ qui trình chạy tốt Như vậy, mẫu tôm thẻ chân trắng giai đoạn giống giai đoạn nuôi thịt chọn thu ngẫu nhiên vụ nuôi năm 2011 2012 ba Tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu Cà Mau chưa phát thấy mầm bệnh WSSV Điều có khả mẫu tôm thẻ chân trắng nhiễm WSSV tỉ lệ thấp nên cần tăng số lượng mẫu phân tích để tăng khả phát 4.1.3 Kết phát MBV phương pháp PCR MBV vi rút không làm tôm chết hàng loạt, làm tôm chậm lớn giảm giá trị thương phẩm Do vậy, thu hoạch sản lượng tôm thấp nên vấn đề nan 38 giải cho người nuôi tôm tỉnh ven biển (Bùi Quang Tề ctv, 1997) MBV kiểm tra nhiễm tổng số 43 mẫu thu Bạc Liêu, Cà Mau Sóc Trăng MBV kiểm tra với qui trình PCR bước (Belcher and Young,1998) (Hình 4.3) Kết điện di sản phẩm PCR phát có mẫu vạch 361bp, sản phẩm khuếch đại PCR MBV (+) (-) M 630 bp 361 bp 330 bp Hình 4.3 : Kết điện di sản phẩm PCR phát MBV Giếng 1: mẫu CM1, Giếng 2: mẫu CM2, Giếng 3: mẫu CM3, Giếng 4: mẫu CM4, Giếng 5: mẫu CM5, Giếng 6: mẫu CM6, Giếng M: Thang đo, Giếng (-): đối chứng âm, Giếng (+): đối chứng dương Khi tôm nhiễm vi rút MBV thường khơng có dấu hiệu bệnh rõ ràng Khi tơm nhiễm bệnh nặng phát bệnh có biểu số dấu hiệu tơm có màu tối xanh tái, xanh sẫm tôm ăn, hoạt động yếu sinh trưởng, phần phụ vỏ kitin có tượng hoại tử, có nhiều sinh vật bám, tỷ lệ chết dồn tích, cao tới 70% tôm chết hầu hết ao (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004) Với phát MBV nhiễm mẫu tôm thẻ chân trắng thả nuôi vùng nuôi tôm trọng điểm ĐBSCL, người nuôi cần lưu ý trình kiểm dịch mầm bệnh trước thả nuôi 4.1.4 Kết phát TSV phương pháp RT-PCR TSV loại vi rút có độc lực cao cho tôm thẻ chân trắng, thời gian ủ bệnh cao khả gây chết tôm lên tới 95% Bệnh có khả gây chết tơm cấp tính nhiễm mãn tính làm cho tơm mềm vỏ, đốm đen vỏ kitin làm giá trị thương phẩm tơm (OIE, 2009) TSV kiểm tra với qui trình RT-PCR (Lê Phước Hiện, 2012) (Hình 4.4) Kết điện di sản phẩm RT-PCR phát có 14 mẫu vạch 341bp, sản phẩm khuếch đại PCR TSV 39 M (-) (+) 341 bp 330bp Hình 4.4: Kết điện di sản phẩm RT - PCR phát TSV Giếng M: Thang đo, Giếng (-): đối chứng âm, Giếng (+): đối chứng dương, Giếng 1: mẫu 48, Giếng 2: mẫu 49, Giếng 3: mẫu 61, Giếng 4: mẫu 62, Giếng 5: mẫu ST1, Giếng 6: mẫu ST3, Giếng 7: mẫu ST5, Giếng 8: mẫu ST7 Theo Navarro et al., (2009), việc tạo trình tự đoạn mồi (7171F/7511R) để phát bệnh TSV tôm thẻ chân trắng giúp đánh giá khả nhiễm TSV tôm mức độ thấp giai đoạn mãn tính Nguyên nhân phản ứng phát mầm bệnh mức độ nhiễm thấp từ 20-200 Kết kiểm tra cho thấy tôm thẻ chân trắng thả ni khu vực ĐBSCL có tỉ lệ nhiễm TSV cao Với kết ghi nhận cho thấy người nuôi cần lưu ý trình kiểm dịch mầm bệnh trước thả ni tôm thẻ chân trắng 4.2 Khả nhiễm mầm bệnh vi rút tôm thẻ chân trắng giai đoạn khác Tổng số 35 mẫu tôm giống mẫu tôm thịt kiểm tra nhiễm mầm bệnh vi rút Kết từ bảng 4.2 cho thấy số 35 mẫu tôm giống thu ba tỉnh ĐBSCL vào năm 2011 2012 khơng có mẫu nhiễm mầm bệnh IHHNV WSSV Theo Sở Thủy Sản Cà Mau (2006) tháng 8/2006 tất tơm bố mẹ khai thác từ vùng biển Rạch Gốc kiểm dịch, bệnh đưa vào trại sản xuất giống Như vậy, công tác phần giúp hạn chế lây nhiễm mầm bệnh từ bố mẹ cho tơm giống (trích dẫn Châu Tài Tảo ctv., 2008) 40 Bảng 4.2: Sự nhiễm vi rút giai đoạn khác - tôm giống tôm thịt Mầm Bệnh Tôm Giống Tôm Thịt IHHNV 0/35 0/8 WSSV 0/35 0/8 MBV 5/35 0/8 TSV 10/35 4/8 Mặc dù, số lượng mẫu tôm thịt nhiễm TSV 4/8 mẫu, đại diện cho tỷ lệ cảm nhiễm đánh giá phần tình trạng nhiễm bệnh tơm thẻ chân trắng ni Sóc Trăng Tỉ lệ nhiễm cao (4/8 mẫu phân tích) mẫu tơm thịt thu ao tơm tình trạng thu hoạch khẩn cấp bệnh Khảo sát đánh giá nhiễm mầm bệnh vi rút tôm thẻ chân trắng cung cấp thông tin cho việc đánh giá khả lây nhiễm chéo mầm bệnh gây hại cho nghề nuôi tôm sú tôm thẻ chân trắng Theo ơng Phạm Hồng Giang, Chi cục trưởng Chi cục NTTS tỉnh Bạc Liêu khuyến cáo: “ Tôm thẻ chân trắng phải theo dõi, quản lý chặt chẽ, 100% tơm giống phải kiểm dịch, lồi lây truyền bệnh Taura cho tôm sú (Báo Bạc Liêu) Theo danh sách tổ chức thú y giới cho thấy có sáu loại vi rút ảnh hưởng nghiệm trọng tôm bao gồm WSSV, TSV, IHHNV, vi rút gây bệnh đầu vàng (yellow head virus - YHV), vi rút gây hoại tử (Infectious myonecrosis virus - IMNV) Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNV) Trong đó, vi rút gây nguy hiểm cho tôm thẻ chân trắng WSSV, TSV, IMNV IHHNV Khi nhiễm bệnh tôm thẻ chân trắng hồn tồn có khả gây lây nhiễm đến lồi tơm tự nhiên khác phân bố vùng nuôi (Overstreet, 1997; JSA, 1997) Ngược lại, tôm sú xem sinh vật có khả lây lan dịch bệnh cao đến lồi tơm khác mang vi rút: WSSV, YHV, GAV, IHHNV, MBV Baculoviral midgut gland necrosis virus - BMNV, Lymphoid organ virus - LPV (Lightner, 1993; Flegel, 2003) Khi nhiễm IHHNV, tơm thẻ chân trắng thường bị dị chũy biến dạng, chân bị cong, chậm lớn làm tỷ lệ tơm nhỏ cao thu hoạch Trong tơm sú lại không biểu triệu chứng nhiễm 41 IHHNV có khả mang mầm bệnh suốt thời gian sống chúng Do vậy, khả lây lan mầm bệnh IHHNV sang tôm thẻ chân trắng có điều kiện thuận lợi cao (Flegel, 2002) Trong chế lan truyền TSV chưa làm rõ theo lý thuyết trình truyền bệnh lây nhiễm từ tôm mẹ ấu trùng mang mầm bệnh TSV gây nguy hiểm cho tôm thẻ chân trắng tôm xanh Nam Mỹ Penaeus stylirostris (Lightner, 1996; Brock, 1997 Overstreet, 1997) 4.3 Khả nhiễm vi rút tôm thẻ chân trắng vùng nuôi tôm khác Bảng 4.3 Sự nhiễm vi rút vùng nuôi khác - Tỉnh thuộc ĐBSCL Mầm bệnh Bạc Liêu Cà Mau Sóc Trăng IHHNV 0/20 0/15 0/8 WSSV 0/20 0/15 0/8 MBV 0/20 5/15 0/8 TSV 4/20 6/15 4/8 Tổng số 20 mẫu, 15 mẫu, mẫu tôm thu ba Tỉnh Bạc Liêu, Cà Mau, Sóc Trăng kiểm tra nhiễm mầm bệnh vi rút Kết từ bảng 4.3 cho thấy tỉnh thu mẫu tôm thẻ chân trắng để phân tích Cà Mau tỉnh có số lượng mẫu nhiễm bệnh nhiều Cụ thể, mẫu nhiễm MBV mẫu nhiễm TSV tổng số 15 mẫu phân tích Trong đó, mẫu thu Sóc Trăng có 4/8 mẫu nhiễm TSV Bạc Liêu có 4/20 mẫu nhiễm TSV Theo Sở Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn (NN&PTNT) Cà Mau, tính đến thời điểm này, tồn tỉnh có 550 tơm bị chết, tập trung nhiều huyện Đầm Dơi (234 ha) huyện Phú Tân (215 ha) (www.baomoi.com) 42 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Qua kết phân tích 43 mẫu tơm thẻ chân trắng thu Cà Mau, Sóc Trăng, Bạc Liêu cho thấy có mẫu nhiễm MBV 14 mẫu nhiễm TSV 5.2 Đề xuất Tiếp tục thu phân tích mẫu tơm thẻ chân trắng bệnh nhiều địa phương khác để so sánh đối chiếu xuất mầm bệnh vi rút Tiếp tục nghiên cứu mầm bệnh vi rút tơm thẻ chân trắng để có biện pháp phòng bệnh hữu hiệu 43 ... chứng nhiễm IHHNV có khả mang mầm bệnh suốt thời gian sống chúng Do vậy, khả lây lan mầm bệnh IHHNV sang tôm thẻ chân trắng có điều kiện thuận lợi cao (Flegel, 2002) Tiếp theo bệnh đốm trắng. .. tôm thẻ chân trắng ni năm 2008 tồn tỉnh đạt 5.440 (http://www.quangngai.gov.vn) Từ tháng năm 2002, tơm thẻ chân trắng thức Bộ Thủy sản cấp phép nuôi với qui mơ nhỏ thử nghiệm tìm hiểu ảnh hưởng... phát dịch đối tượng tôm nuôi tôm thẻ chân trắng, tôm sú tôm xanh Khi xảy bệnh, ao tơm bị thiệt hại từ 40 -70% Quá trình lây lan IMNV qua châu lục khác ghi nhận nhập chuyển tôm bố mẹ P.vannamei