Tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học các analog của bengamide a và e tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - PHÍ THỊ ĐÀO “TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC ANALOG CỦA BENGAMIDE A VÀ E” Chuyên ngành : Hóa hữu Mã số : 62 44 01 14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội - 2018 Cơng trình hồn thành tại: Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.Habil Phạm Văn Cường TS Đoàn Thị Mai Hương Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Thi Dao Phi, Huong Doan Thi Mai, Van Hieu Tran, Bich Ngan Truong, Tuan Anh Tran, Van Loi Vu, Van Minh Chau, Van Cuong Pham Design, synthesis and cytotoxicity of bengamide analogues and their epimers Med Chem Commun, 2017,8, 445-451 Thi Dao Phi, Huong Doan Thi Mai, Van Hieu Tran, Van Loi Vu, Bich Ngan Truong, Tuan Anh Tran, Van Minh Chau and Van Cuong Pham Synthesis of bengamide E analogues and their cytotoxic activity Tetrahedron Letters 2017, 58, 1830-1833 Phi Thi Dao, Doan Thi Mai Huong, Le Thi Phuong, Chau Van Minh, Pham Van Cuong Synthesis of 8-methyl-2-O-methyl-3,5-O-(1methyl ethylidene)-6,7,8,9-tetradeoxy-D-gulo-6-nonenonic acid (6E)- lactone Vietnam Journal of Chemistry, 2015,53 (2e), 154-157 Phi Thi Dao, Doan Thi Mai Huong, Vu Van Loi, Chau Van Minh, Pham Van Cuong Microwave-assisted synthesis of lactams from amino acids Vietnam Journal of Chemistry, 2015, 53 (2e), 198-201 Phi Thi Dao, Vu Van Loi, Nguyen Thi Bich, Doan Thi Mai Huong, Nguyen Hien, Chau Van Minh, Pham Van Cuong Synthesis of N-alkyl amino lactam derivatives Journal of Science and Technology, 2016, 54 (2C), 291-298 Phí Thị Đào, Đồn Thị Mai Hương, Vũ Văn Lợi, Châu Văn Minh, Phạm Văn Cường Nghiên cứu quy trình tổng hợp hoạt tính gây độc tế bào hợp chất (2R,3R,4S,5R,6E)-3,4,5-trihydroxy-2methoxy-8,8-dimetyl-N-((S)-2-oxoazepan-3-yl)non-6-enamide Tạp chí Hóa học, 2016, 54 (6e2),62-65 Phí Thị Đào, Đoàn Thị Mai Hương, Vũ Văn Lợi, Nguyễn Thị Huệ, Phạm Văn Cường In vitro cytotoxic and antimicrobial activities of some bengamide derivatives Tạp chí Hóa học 2017 55(3), 342-347 Giải pháp hữu ích Phương pháp tổng hợp dẫn xuất bengamit Đã chấp nhận đơn hợp lệ I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Các hợp chất thiên nhiên phân lập từ loài thực vật đất liền nghiên cứu từ lâu thu nhiều thành công Tuy nhiên, nghiên cứu hợp chất thiên nhiên biển khoảng kỷ trước Hiện nay, hợp chất thiên nhiên biển biết đến nguồn dược liệu đầy triển vọng nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao với cấu trúc phức tạp phát từ loài sinh vật biển khác Khó khăn việc thu mẫu lượng lớn đòi hỏi kinh phí cao trở ngại nghiên cứu lĩnh vực hóa học hợp chất thiên nhiên biển Chính vậy, tổng hợp hữu phương án lựa chọn hiệu việc tạo nguồn hoạt chất với lượng lớn để phục vụ nghiên cứu hoạt tính sinh học, việc đảm bảo khả ứng dụng chúng Nhiều hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên biển đóng vai trò chất dẫn đường để từ nhà khoa học tạo dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao Lớp chất bengamides phân lập từ hải miên biển biết đến có hoạt tính chống ung thư tiềm Tuy nhiên, độ ổn định mặt cấu trúc nguyên nhân hạn chế khả ứng dụng lớp chất Nhằm khắc phục hạn chế lớp chất bengamides, khuôn khổ luận án này, lựa chọn đề tài nghiên cứu: “Tổng hợp khảo sát hoạt tính sinh học analog bengamide A E” Mục tiêu luận án Xây dựng quy trình tổng hợp analog bengamide A E, tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học analog tổng hợp Ý nghĩa khoa học đóng góp luận án 3.1 Ý nghĩa khoa học - Luận án đóng góp tổng hợp analog bengamide A E - Ứng dụng phương pháp chiếu xạ vi sóng tổng hợp hữu 3.2 Những đóng góp luận án Đã tổng hợp 30 analog bengamide A E có 16 analog bengamide E, analog bengamide A 10 hợp chất có chứa flo Đã xây dựng quy trình tổng hợp lập thể analog bengamide A E Đã sử dụng phương pháp chiếu xạ vi sóng phản ứng đóng vòng nội phân tử acid amine, phản ứng bảo vệ nhóm chức amine bậc phản ứng kết nối chuỗi ketide aminolactam giúp rút ngắn thời gian phản ứng, nâng cao hiệu suất phản ứng Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào analog tổng hợp dòng tế bào ung thư thử nghiệm (Lu, NCI-H1975, A549, MCF7, MDA-MB-231, HepG2, Hep3B, KB, HL60 Hela) nhiều analog thể hoạt tính mạnh với IC50 < 1µM Đã khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định số analog chủng gram (+), gram (-) nấm men Kết cho thấy số analog có hoạt tính với chủng gram (+) Bố cục luận án Luận án dày 153 trang với 25 bảng số liệu, 65 hình 57 tài liệu tham khảo bố cục sau: Mở đầu: trang Chương 1: Tổng quan 32 trang Chương 2: Thực nghiệm phương pháp nghiên cứu 64 trang Chương 3: Kết thảo luận 41 trang Kết luận, kiến nghị: trang Ngoài ra, luận án có phần phụ lục gồm phổ analog bengamide tổng hợp II NỘI DUNG LUẬN ÁN ĐẶT VẤN ĐỀ Đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng nhiệm vụ nghiên cứu luận án CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan gồm 32 trang, tổng kết tài liệu bengamide phân lập từ tự nhiên Các phương pháp tổng hợp analog bengamide hoạt tính sinh học chúng CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM Phương pháp nghiên cứu gồm trang mô tả phương pháp tổng hợp hữu cơ, phương pháp xác định cấu trúc hóa học phương pháp thử hoạt tính sinh học Thực nghiệm gồm 64 trang mơ tả chi tiết quy trình tổng hợp analog bengamide Các tính chất vật lý số liệu phổ chất tổng hợp Chúng đưa phương pháp tổng hợp dãy chất sau: - Tổng hợp chuỗi ketide - Tổng hợp dẫn suất N-ankyl aminolactam vòng vòng - Tổng hợp analog bengamide A E - Tổng hợp analog bengamide chứa flo Đã thử hoạt tính gấy độc tế bào 30 analog tổng hợp 10 dòng tế bào (Lu1, NCI-H1975, A549, MCF7, MDA-MB-231, HepG2, Hep3B, KB, HL60 Hela) Đã thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng gram (+), gram âm (-) nấm men CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Các nghiên cứu cơng bố tổng hợp đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư analog bengamide cho thấy biến đổi cấu trúc khung bengamide ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính sinh học Đặc biệt, nghiên cứu rằng, có mặt nhóm hydroxyl cấu hình C-3, C-4 C-5 chuỗi ketide đóng vai trò đặc biệt quan trọng hoạt tính gây độc tế bào lớp chất Nhằm nghiên cứu mối tương quan cấu trúc – hoạt tính gây độc tế bào analog bengamide, khuôn khổ luận án này, việc biến đổi cấu trúc khung bengamide thực theo hướng sau: i) thay nhóm isopropyl nhóm nhóm tert-butyl tạo chất có cấu trúc ổn định tránh dịch chuyển nối đơi từ C-7/C-8 sang vị trí C-8/C-9 (isomer hóa); ii) thay đổi cấu hình cacbon C-2’ vòng lactam tạo cặp đồng phân diastereomer, qua đánh giá ảnh hưởng cấu hình C-2’ đến hoạt tính; iii) N-alkyl hóa nhóm amide vòng lactam, iv) tổng hợp số analog với nhóm hydroxyl C-5’; v) thay đổi kích cỡ vòng lactam; vi) thay phần olefin cuối mạch nhóm FCH2-CH(OH)- nhằm đánh giá vai trò phần cấu trúc olefin cuối mạch (Hình 3.1) Hình 3.1 Định hướng biến đổi khung bengamide Quy trình tổng hợp analog bengamide thực từ chất thương mại α-D-glucoheptonic γ-lactone acid amine (Lornithine monohydrochloride, D-ornithine monohydrochloride, L-lysine, D-lysine D,L-5-hydroxylysine hydrochloride) qua giai đoạn 3.1 Tổng hợp chuỗi ketide Quá trình tổng hợp ketide BG5 thực với việc sử dụng hợp chất đầu thương mại hóa, α-D-glucoheptonic γ-lactone (Hình 3.2) Phản ứng acetonide hóa tạo BG1 sử dụng tác nhân acetone với xúc tác acid sulphuric cho hiệu suất 67,8 % Hình 3.2 Sơ đồ phản ứng tổng hợp ketide BG5 Thủy phân chọn lọc nhóm isopropylidene BG2 acid acetic thu hợp chất BG3 với hiệu suất phản ứng đạt 85% Nghiên cứu phản ứng oxy hóa cắt mạch diol với tác nhân NaIO4 hỗn hợp loại dung môi khác cho thấy với việc sử dụng 1,2 eq NaIO4 hỗn hợp dung môi MeCN H2O tỷ lệ 4/1 (v/v) thu sản phẩm aldehyde BG4 với hiệu suất phản ứng cao (91%) Phản ứng cuối trình olefin hóa aldehyde BG4 Phản ứng nghiên cứu việc sử dụng tác nhân (P(t-Bu)3HBF4) (1,5 - eq) với có mặt TEA, potassium t-butoxide ((CH3)3COK) với NaH (1,5 eq) dung môi THF nhiệt độ phòng thời gian từ – 24 h Tuy nhiên phản ứng không tạo thành sản phẩm BG5 Phản ứng sau thực thành công theo phương pháp Takai (Takai reaction) với việc sử dụng tác nhân 1,1-diiodo-2,2 dimethylpropane CrCl2 Kết nghiên cứu cho thấy, phản ứng sử dụng tác nhân 1,1-diiodo-2,2 dimethylpropane từ hãng Aldrich, hợp chất ketide BG5 tạo thành với hiệu suất cao đạt 45% Trong đó, hợp chất ketide BG5 thu với hiệu suất cao nhiều (73%), phản ứng thực với tác nhân 1,1-diiodo-2,2 dimethylpropane tự tổng hợp Cơ chế phản ứng oxi hóa cắt mạch BG3 hình thành BG5 từ BG4 với việc sử dụng phản ứng Takai trình bày hình Hình 3.3: Cơ chế phản ứng tổng hợp BG5 Theo đó, phản ứng oxi hóa với NaIO4 mức oxi hóa iodine chuyển từ +7 (NaIO4) xuống +5 (NaIO3) Đối với phản ứng tổng hợp olefin theo Takai, kết hợp aldehyde dihaloalkan geminal để tạo thành olefin Trong phản ứng Cr (II) bị oxy hóa thành Cr (III) thay hai nguyên tử halogen Các geminal carbodianion hình thành phản ứng với aldehyde tạo thành anken Cơng thức cấu tạo chất xác định dựa vào số liệu phổ MS, H-NMR, 13C-NMR.và so sánh với tài liệu công bố 3.2 Phản ứng tổng hợp hợp chất 2-amino lactam 3.2.1 Phản ứng tổng hợp chất BG6a-b BG14a-b Cấu trúc vòng α-amino lactam tồn nhiều hợp chất thể hoạt tính sinh học cao Do việc tổng hợp α-amino lactam thu hút ý nhiều nhóm nghiên cứu Điển hình việc tổng hợp αaminocaprolactam từ L-lysine Theo cơng trình cơng bố G.Pifferi cộng sự, phản ứng đóng vòng tạo BG14a từ L-lysine điều kiện đun khuấy thông thường cho hiệu suất đạt 95% với thời gian thực phản ứng 48 h Trong nghiên cứu khác, Blade-Front công bố quy trình tổng hợp BG14a đạt hiệu suất 70% thời gian ngắn (20 h) với việc sử dụng tác nhân Al2O3 hỗn hợp toluene/pyridine Ngoài ra, phản ứng tổng hợp BG14a từ L-lysine thực điều kiện nhiệt độ áp suất cao với hiệu suất sản phẩm đạt 88% Để khắc phục nhược điểm sử dụng tác nhân đắt tiền, độc hại, thời gian thực phản ứng dài thực phản ứng điều kiện nhiệt độ áp suất cao, chúng tơi nghiên cứu phản ứng đóng vòng nội phân tử acid amine với trợ giúp vi sóng Theo đó, hợp chất α-aminocaprolactam (BG14a) đạt hiệu suất 79% từ L-lysine với điều kiện phản ứng thực ethylene glycone chiếu xạ vi sóng 284 W vòng h Trong đó, hiệu suất BG14a tạo thành thấp (48%) thực phản ứng dung môi butanol Áp dụng điều kiện phản ứng tương tự, hợp chất BG14b tổng hợp với hiệu suất 82% từ D-lysine Đối với việc tổng hợp hợp chất amino lactam vòng cạnh BG6a BG6b, chiếu xạ vi sóng 284 W khoảng thời gian 60 phút ethylene glycol với có mặt pyridine đạt hiệu suất 55,6% Khi thay pyridine dung dịch NaHCO3 10% thực phản ứng tương tự với trợ giúp vi sóng, hợp chất amino lactam BG6a thu đạt hiệu suất 78% Áp dụng quy trình tương tự, hợp chất amino lactam BG6b tổng hợp với hiệu suất 72% từ D-ornithine hydrochloride 3.2.2 Phản ứng tổng hợp chất rac-BG22a rac- BG22b (i): dd NaHCO3 10%, ethylen glycon, pyridine, MW, 284W, 1h (ii): (Boc)2O (1eq), TEA, THF, H2O, rt, 3h Do đồng phân quang học 5-hydroxylysine khơng thương mại hóa, nên đồng phân 6-hydroxycaprolactam điều chế từ hỗn hợp racemic đồng phân diastereomer hợp chất 5hydroxylysine Theo đó, phản ứng đóng vòng nội phân tử hỗn hợp D,L-5-hydroxylysine hydrochloride thực với chiếu xạ vi sóng cơng suất 284 W thời gian 60 phút tạo thành hỗn hợp racemic đồng phân diastereomer rac-BG22a rac-BG22b Hỗn hợp sản phẩm tinh chế cột silica gel với hệ dung môi acetone/H2O/NH4OH tỷ lệ 9/1/0,1 thu hợp chất racemic racBG22a (53%, Rf = 0,49) rac-BG22b (39%, Rf = 0,34) Do xác định trực tiếp cấu hình tương đối C-3 C-6 rac-BG22a rac-BG22b, nên hợp chất chuyển hóa thành dẫn xuất NBoc nhằm so sánh với liệu phổ NMR công bố Phản ứng hợp chất rac-BG22a rac-BG22b với tác nhân Boc2O thực hỗn hợp dung môi THF/H2O với có mặt TEA tạo 10 Hình 3.9 Phản ứng kết hợp BG5 LAF-A David công bố Phương pháp David D Xu cộng có ưu điểm sử dụng tác nhân rẻ tiền, điều kiện êm dịu, nhiên thời gian phản ứng kéo dài (15 - 20 giờ) Trong khuôn khổ luận án này, tiến hành nghiên cứu trợ giúp vi sóng nhằm rút ngắn thời gian phản ứng Phản ứng BG5 BG6a sử dụng để nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phản ứng Theo đó, với việc sử dụng sodium 2- ethyl hexanoate dung môi THF 1,4-dioxane, nhiệt độ từ 50 – 100 oC, 10 đến 24 giờ, hiệu suất sản phẩm BG24a thu từ 50 – 58% Trong đó, chiếu xạ vi sóng, thời gian phản ứng rút ngắn đáng kể hiệu suất sản phẩm BG24a thu đạt 87% Như thấy, phản ứng BG5 BG6a đạt hiệu suất cao sử dụng 1,2 – 1,5 eq sodium 2- ethyl hexanoate, chiếu xạ vi sóng 100 W Bảng 3.7 Điều kiện phản ứng tổng hợp BG24a Dung môi 1,4dioxane 1,4dioxane THF THF sodium 2ethyl hexanoate MW Nhiệt độ Thời gian Hiệu suất eq - 100 oC 10h 50% 1,5 eq - 100 oC 10h 50% 24h 30 phút 58% 55% 1,5 eq 1,5 eq 284 W o 50-60 C >100 oC 11 Dung môi THF THF THF sodium 2ethyl hexanoate 1,5 eq 1,2 eq eq MW Nhiệt độ Thời gian Hiệu suất 100 W 100 W 100 W 50-60 oC 50-60 oC 50-60 oC 1h 1h 1h 87% 87% 80% Sử dụng điều kiện phản ứng tương tự trình tổng hợp BG24a, sản phẩm BG24b, BG25a – BG31a BG25b – BG31b tổng hợp Hiệu suất phản ứng hợp chất thu khoảng 64 – 95% Cấu trúc sản phẩm BG24a - BG31a, BG24b - BG31b, khẳng định phân tích liệu phổ MS NMR Chẳng hạn hợp chất BG24a, pic ion giả phân tử m/z 421 [M+Na]+ quan sát thấy phổ ESI-MS Mặt khác, phổ 13C-NMR DEPT BG24a cho tín hiệu 20 ngun tử cacbon có nhóm cacbonyl C 171,1 (C-1´), 170,5 (C-1), nhóm methoxy C 59,8 (C12), nhóm metin sp2, nhóm methylene, nhóm metin sp3, nhóm methyl cacbon bậc 12 Hình 3.12 Phổ 13C-NMR giãn rộng hợp chất BG24a Trên phổ 1H-NMR BG24a xuất tín hiệu nhóm methyl H 1,03 (9H, s, Me-9,10,11), 1,47 (3H, s, Me-15), 1,49 (3H, s, Me-16), proton olefin H 5,77 (1H, dd, J = 0,5; 16,0 Hz, H-7), 5,55 (1H, dd, J = 7,0; 16,0 Hz, H-6) nhóm methoxy H 3,46 (3H, s) Hơn nữa, tín hiệu nhóm NH ghi nhận H 7,32 (1H, d, J = 5,5 Hz, NH-13), nhóm metin H 4,33 (1H, m, H-2´), nhóm methylen liên kết với nitơ H 3,36 (3H, m, CH2-5´ OH) nhóm oxymetin nằm khoảng H 3,91- 4,25 quan sát thấy phổ 1H-NMR Ngoài ra, phổ 1H-NMR cho tín hiệu proton nằm khoảng H 1,57-2,57 xác định thuộc nhóm methylene nhờ phân tích phổ HSQC Hình 3.13 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất BG24a 13 Như thấy, tín hiệu thu từ phổ 1D-NMR hoàn toàn phù hợp với cấu trúc hóa học BG24a Hơn nữa, gắn kết phần ketide với aminolactam thông qua liên kết C-1/N-13 khẳng định từ tương tác H-2´ H 4,33 với nhóm cacbonyl C-1 C 171,1 phổ HMBC Hình 3.14 Một số tương tác phổ COSY HMBC chất BG24a Giai đoạn cuối quy trình tổng hợp analog bengamide loại bỏ nhóm bảo vệ acetonide Q trình phân tách nhóm acetonide thực môi trường acid TFA nhiệt độ oC thời gian 1,5 h cho hiệu suất phản ứng đạt 35 - 69% Bảng 3.9 Phản ứng loại bỏ nhóm acetonide Cấu trúc analogue bengamide 32a-b – 39a-b khẳng định phương pháp phổ Phổ khối lượng thu phổ HRESI-MS hợp chất hoàn toàn phù hợp với cơng 14 thức phân tử dự kiến Ngồi ra, phổ 1D NMR các analogue 32a-b – 39a-b, khơng tín hiệu nhóm acetal so với hợp chất acetonide tương ứng Đồng thời cấu trúc hóa học analogue 32a-b – 39a-b chứng minh phổ NMR chiều Hinh 3.18 Phổ 13C-NMR chât BG32a Hinh 3.19 Phổ 1H-NMR chât BG32a Hinh 3.19 Phổ 1H-NMR chât BG32a 15 3.4 Tổng hợp analog bengamide A (a):MW,100W, 120 mn, 1,4-dioxan, sodiun-2 ethylhexanoate Áp dụng quy trình phản ứng mở vòng lactone ketide BG5 với aminolactam điều kiện chiếu xạ vi sóng trình bày phần trên, acetonide BG40a-d tổng hợp Hợp chất BG5 cho phản ứng với hỗn hợp racemic rac-BG22a (3S*,6S*) tạo thành đồng phần diastereomer BG40a BG40b Hai đồng phần diastereomer BG40a BG40b phân tách sắc ký lớp mỏng điều chế Cấu trúc hóa học hợp chất BG40a-d khẳng định thơng qua phân tích phổ, đặc biệt phổ NMR Sự hình thành liên kết amide chuỗi ketide phần aminolactam chứng minh tương tác cacbonyl C-1 với proton H-2’, tương tác proton amide (NH-13) với C-1 C-1’ phổ HMBC So sánh liệu phổ NMR độ quay cực với hợp chất bengamide Y [13], cho phép xác định cấu hình 2’S,5’S cho hợp chất BG40a Như cấu hình 2’R,5’R gán cho hợp chất BG40b 16 Tương tự, phản ứng BG5 với hợp chất hỗn hợp racemic rac-BG22b (3S*,6S*) thu đồng phần diastereomer BG40c BG40d, sau phân tách sắc ký lớp mỏng điều chế Cấu hình 2’S,5’R xác định cho BG40c cấu hình 2’R,5’S cho BG40d dựa vào so sánh liệu phổ NMR độ quay cực với cơng bố trước Hình 3.39 Một số tương tác phổ COSY HMBC BG40a Tương tự analog bengamide E, analog bengamide A tổng hợp thông qua phản ứng loại bỏ nhóm bảo vệ acetonide hợp chất BG40a-d dung mơi THF với có mặt TFA nhiệt độ – oC thời gian h So sánh liệu phổ NMR sản phẩm BG41a-d với hợp chất acetonide BG40a-d cho thấy tín hiệu nhóm methyl cacbon bậc điều chứng tỏ nhóm acetonide loại bỏ 17 3.5 Phản ứng tổng hợp analog bengamide chứa flo Để hiểu rõ vai trò phần olefinic cuối mạch hoạt tính lớp chất bengamide, hướng nghiên cứu tiến hành tổng hợp khảo sát hoạt tính sinh học analogue phần olefinic cuối mạch thay nhóm CH(OH)-CH2F Quy trình tổng hợp analoge thực miêu tả hình 3.45 Hình 3.45: Sơ đồ tổng hợp analog bengamide chứa flo Quá trình điều chế analoge có chứa flo thực trước tiên phản ứng flo hóa hợp chất BG3 với tác nhân diethylaminosulfur trifluoride (DAST) nhiệt độ phòng cho phép thu dẫn xuất flo BG3F với hiệu xuất 42% Trong điều kiện phản ứng này, trình flo hóa xảy chọn lọc nhóm hydroxyl bậc Cấu trúc sản phẩm tạo thành BG3F khẳng định qua phân tích liệu phổ Phổ khối lượng phân giải cao (HRESI-MS) cho pic ion giả phân tử [M-H]- m/z 263,0928 phù hợp với công thức dự kiến C11H16FO6 BG3F Ngoài ra, diện flo cấu trúc BG3F, thể qua tín hiệu kép gây 18 tương tác với nguyên tử flo C-7 [δC 83,7 (d, JC-F = 166,25 Hz)], C-6 [δC 68,6 (d, 2J C-F = 18,75 Hz)] C-5 [67,0 (d, 3J C-F = 6,25 Hz)] Dẫn xuất flo BG3F sau cho phản ứng với aminolactams điều chế trên, có mặt sodium 2ethylhexanoate điều kiện chiếu xạ vi sóng 100 W, thời gian thu hợp chất mở vòng lactone tương ứng Cấu trúc hóa học sản phẩm mở vòng khẳng định phương pháp phổ, đặc biệt phổ HMBC Trong đó, gắn kết vòng aminolactam chuỗi polyketide minh chứng qua tương tác C1, C-2 C2’ với proton NH nhóm amide hình thành Hình 3.50 Một số tương tác phổ HMBC, COSY chất BG4Fa BG4Fb Tương tự trình loại bỏ nhóm acetonide tổng hợp analogue bengamide A trình bày phần trên, phản ứng loại nhóm bảo vệ acetonide hợp chất BG4Fa thực với tác nhân acid TFA, dung môi THF điều kiện nhiệt độ 0oC đến nhiệt độ 19 phòng Tuy nhiên, điều kiện phản ứng này, hợp chất đầu bị phân hủy không thu sản phẩm mong muốn Các nghiên cứu sau cho thấy sử dụng tác nhân acid HCl 1N việc loại bảo acetonide hợp chất BG4Fa cho phép thu sản phẩm momg muốn Theo đó, sản phẩm BG4Fa thu với hiệu suất 33 – 50% điều kiện sử dụng HCl 1N dung môi THF với thời gian 24 Trong đó, sử dụng dung mơi MeOH thay cho THF, sản phẩm BG4Fa thu với hiệu suất cao (58 – 66%) thời gian ngắn (5 giờ) Có thể thấy, việc sử dụng dung dịch HCl 1N dung môi MeOH phù hợp phản ứng loại bỏ nhóm acetonide dãy analogue bengamide có chứa flo 3.6 Hoạt tính sinh học hợp chất tổng hợp 3.6.1 Hoạt tính gây độc tế bào Các analog bengamide tổng hợp, thử hoạt tính dòng tế bào ung thư (KB, HepG-2, LU-1, MCF-7, HL-60 Hela) Kết cho thấy analog có cấu hình C-2´R phi tự nhiên thể hoạt tính tốt epimer C-2´S dẫn xuất có cấu hình giống hợp chất phân lập từ tự nhiên (Bảng 3.13 ) Các analog có vòng aminolactam vòng thể hiện hoạt tính tốt analog vòng loại Đối với dòng tế bào ung thư thử nghiệm, hợp chất thể hoạt tính mạnh dòng tế bào ung thư biểu mơ KB, ung thư phổi 20 LU-1, ung thư gan HepG-2 ung thư vú MCF-7 so với dòng tế bào ung thư lại tế bào ung thư máu HL-60 ung thư cổ tử cung Hela Chín hợp chất, BG34b, BG35a, BG35b, BG36b, BG37b, BG38a, BG38b, BG39a BG39b thể hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư thử nghiệm Đặc biệt, hợp chất BG36b thể khả ức chế mạnh dòng tế bào ung thư KB, HepG-2, LU-1, MCF-7, HL-60 Hela với giá trị IC50 1,1; 1,1; 0,5; 0,2; 5,4 2,3 µM Mặt khác, hợp chất BG36a BG36b thể hoạt tính ức chế chọn lọc dòng tế bào ung thư vú MCF-7 với giá trị IC50 1,3 0,2 µM, hợp chất BG37b BG38b ức chế chọn lọc dòng tế bào ung thư KB, HepG-2 LU-1 với giá trị IC50 nằm khoảng 0,3-1,1 µM Ngoài ra, hợp chất BG39a BG39b thể hoạt tính chọn lọc dòng tế bào ung thư KB HepG-2 với với giá trị IC50 nằm khoảng 0,4-1,9 µM Bảng 3.13 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào analog bengamide tổng hợp IC50 (µM) Analog KB HepG-2 Lu-1 MCF-7 HL-60 Hela BG32a 22,1 >50 13,8 >50 >50 >50 BG32b 11,1 22,0 2,6 >50 >50 >50 BG33a 8,2 11,8 12,7 20,1 >50 >50 BG33b 2,4 6,6 2,6 8,8 >50 >50 BG34a 2,9 11,3 7,5 17,8 >50 39,7 BG34b 4,4 12,0 2,7 20,4 29,0 19,7 BG35a 2,3 6,6 5,8 4,3 36,8 36,8 BG35b 1,7 2,4 2,3 15,1 21,5 16,1 21 IC50 (µM) Analog KB HepG-2 Lu-1 MCF-7 HL-60 Hela BG36a 21,0 21,1 4,3 1,3 >50 >50 BG36b 1,1 1,1 0,5 0,2 5,3 2,1 BG37a 11,8 >50 17,1 >50 >50 >50 BG37b 0,4 1,0 0,3 10,4 19,5 39,1 BG38a 5,7 4,8 7,7 32,5 45,6 41,5 BG38b 1,0 1,9 1,1 8,6 10,6 16,2 BG39a 1,9 1,5 23,6 4,9 13,4 26,9 BG39b 1,1 0,4 25,1 2,7 8,9 9,5 BG41a 19,8 >50 10,0 >50 >50 >50 BG41b 5,1 21,3 17,2 >50 12,1 15,4 BG41c >50 >50 23,4 23,4 >50 >50 BG41d 23,7 >50 36,3 >50 >50 >50 BGF5a >50 >50 >50 >50 >50 >50 BGF5a >50 >50 >50 >50 >50 >50 Elipticine 1,2 1,6 1,2 2,4 2,0 1,6 Chất đối chứng dương: Elipticine Các hợp chất có nhóm OH vị trí 5´ thể hoạt tính thấp analog khơng chứa chóm OH vòng lactam Trong số hợp chất này, hai hợp chất BG41a BG41b thể hoạt tính đáng kể tương ứng tế bào ung thư Lu-1 KB Hai hợp chất lại khơng thể hoạt tính đáng kể dòng tế bào ung thư thử nghiệm Mặt khác, hai hợp chất chứa flo BG5Fa-b hoạt tính dòng tế bào ung thư thử nghiệm Hơn nữa, hợp chất 22 chứa flo lại (BG7Fa-b, BG9Fa-b, BG11Fa-b, BG13Fa-b) thử nghiệm sáu dòng tế bào ung thư khác ung thư phổi NCI-H1299, A549, ung thư vú MCF-7, MDA-MB-231, ung thư gan Hep3B ung thư cổ tử cung Hela Tuy nhiên, tất hợp chất khơng thể hoạt tính Điều cho thấy phần cấu trúc olefin cuối mạch ketide lớp chất bengamide dường đóng vai trò quan trọng hoạt tính gây độc tế bào Ngồi ra, để hiểu rõ ảnh hưởng tính linh hoạt chuỗi ketide nhóm hydroxy tự C-3, C-4 C-5 đến hoạt tính gây độc tế bào, số hợp chất acetonid BG24a-b, BG28a-b BG31a-b thử hoạt tính sáu dòng tế bào ung thư KB, HepG-2, LU-1, MCF-7, HL-60 Hela Tuy nhiên, hầu hết hợp chất khơng thể hoạt tính nhiều so với analog tương ứng bỏ bảo vệ acetonid Điều giả thiết có mặt nhóm acetonide nên hạn chế quay tự liên kết C-3/C-4/C-5, qua làm hạn chế tính linh hoạt chuỗi polyketide, đồng thời hai nhóm hydroxyl C-3 C-5 khơng trạng thái tự Điều hồn tồn phù hợp với nghiên cứu công bố trước nhóm tác giả Xu W cộng vai trò nhóm hydroxyl C-3, C-4 C-5 Theo đó, yếu tố quan trọng góp phần tạo hoạt tính lớp chất bengamide khả liên kết tạo phức bengamide với enzyme Methionine aminopeptidase thông liên kết tạo phức nhóm hydroxyl C-3, C-4 C-5 chuỗi polyketide với ion kim loại phân tử protein Methionine aminopeptidase 3.6.2.Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Một số analog bengamide lựa chọn thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng Gram (+) (Enterococcus faecalis, 23 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus), chủng Gram (-) (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica) chủng nấm (Candida albicans) Bảng 3.12 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật số analog Analog BG32a BG34b BG35b BG37a BG37b BG38a BG38b BG39a BG39b S T K C Gram (+) MIC (µg/ml) E.faecalis S.aureus B.cereus 64 128 32 128 256 32 32 64 64 32 128 64 64 32 32 16 256 256 128 16 64 128 - Gram (-) MIC (µg/ml) E.Coli P.aeruginosa S enterica 32 256 128 256 256 128 64 16 - Nấm men C.albicans 128 256 64 128 256 128 64 32 Chất đối chứng dương: S: Steptomycin; T: Tetramycin; K: Kanamycin; C: Cyclohexamide; (-): khơng có hoạt tính KẾT LUẬN  Với việc sử dụng phương pháp tổng hợp hữu khác nhau, 30 analog bengamide tổng hợp Trong có 16 analog bengamide E, analog bengamide A 10 hợp chất có chứa flo Trong trình tổng hợp hợp chất này, bước phản ứng nghiên cứu tối ưu hóa so với phương pháp công bố trước Cụ thể, ứng dụng chiếu xạ vi sóng lần thực giúp rút ngắn thời gian nâng cao hiệu suất phản ứng phản ứng sau: + Phản ứng tổng hợp aminolactam từ acid amine tương ứng + Phản ứng bảo vệ nhóm amine bậc với anhdric phthalic 24 + Phản ứng kết hợp aminolactam với chuỗi polyketide thơng qua q trình mở vòng lactone  Các hợp chất tổng hợp được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 10 dòng tế bào ung thư Kết cho thấy 20 hợp chất thể hoạt tính số dòng tế bào ung thư thử nghiệm Trong số hợp chất có hoạt tính mạnh với IC50 < 1µM Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn chủng nấm cho thấy số hợp chất có hoạt tính tốt chủng Gram (+) Ngồi ra, hợp chất BG35b BG39b thể hoạt tính tốt với chủng nấm Đây nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất thuộc lớp chất bengamide  Đánh giá mối tương quan cấu trúc – hoạt tính cho thấy, hợp chất có cấu hình C-2´R thể hoạt tính tốt cấu hình C-2´S Cho đến hợp chất bengamide phân lập từ tự nhiên có cấu hình C-2´S Đây lần analog bengamide với cấu hình C-2´R tổng hợp khảo sát hoạt tính sinh học Việc phát đồng phân diastereomer với cấu hình C-2´R có hoạt tính cao đồng phân diastereomer với cấu hình C-2´S tương ứng điều thú vị, tạo sở cho định hướng nghiên cứu nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học cao thuộc lớp chất  Quá trình thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào cho thấy, analog chứa flo khơng thể hoạt tính dòng tế bào ung thư thử nghiệm Đồng thời hợp chất chứa nhóm bảo vệ acetonide với cấu trúc cứng C-3/C-4/C-5 có hoạt tính nhiều so với hợp chất tương ứng có chứa nhóm hydroxyl tự C-3, C-4 C-5 Điều cho thấy phần cấu trúc olefin cuối mạch nhóm tert-butyl, có mặt nhóm hydroxyl tự C-3, C-4 C-5 tính linh động liên kết C-3/C-4/C-5 đóng vai trò quan trọng hoạt tính gây độc tế bào lớp chất bengamide ... góp luận án Đã tổng hợp 30 analog bengamide A E có 16 analog bengamide E, analog bengamide A 10 hợp chất có ch a flo Đã xây dựng quy trình tổng hợp lập thể analog bengamide A E Đã sử dụng phương... chất tổng hợp Chúng đ a phương pháp tổng hợp dãy chất sau: - Tổng hợp chuỗi ketide - Tổng hợp dẫn suất N-ankyl aminolactam vòng vòng - Tổng hợp analog bengamide A E - Tổng hợp analog bengamide ch a. .. môi MeOH phù hợp phản ứng loại bỏ nhóm acetonide dãy analogue bengamide có ch a flo 3.6 Hoạt tính sinh học hợp chất tổng hợp 3.6.1 Hoạt tính gây độc tế bào Các analog bengamide tổng hợp, thử hoạt