Sán lá phổi paragonimus heterotremus và paragonimus westermani ở việt nam hình thái, phân tử, sinh học và chuẩn đoán miễn dịch tt

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LẦM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LƢU ANH TÚ SÁN LÁ PHỔI PARAGONIMUS HETEROTREMUS VÀ PARAGONIMUS WESTERMANI Ở VIỆT NAM: HÌNH THÁI, PHÂN TỬ, SINH HỌC VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH Chuyên ngành: Ký sinh trùng học Mã số: 62.42.01.05 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2018 Luận án hoàn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Phạm Ngọc Doanh TS Bùi Khánh Linh Ngƣời phản biện 1: Ngƣời phản biện 2: Ngƣời phản biện 3: Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp Học Viện Họp tại: Học viện Khoa học Công nghệ Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia - Thƣ viện Học viện Khoa học cơng nghệ MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Sán phổi (SLP) thuộc giống Paragonimus gây bệnh SLP có ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người động vật Nguyên nhân nhiễm bệnh ăn phải metacercaria vật chủ trung gian thứ hai (VCTG 2) sán non từ vật chủ chứa Triệu chứng bệnh SLP dễ bị chẩn đoán nhầm với lao phổi bệnh phổi khác, gây khó khăn cho chẩn đoán trị bệnh (Blair et al., 1999) Ở Việt Nam, SLP bệnh SLP quan tâm nghiên cứu 20 năm qua (Cao Văn Viên cs., 1994; Nguyễn Văn Đề cs., 1998-2003; Doanh et al., 2005-2013) Đến nay, loài SLP phát (Doanh et al., 2013), số có lồi P heterotremus phổ biến tỉnh miền Bắc loài P westermani phổ biến tỉnh Bắc Trung Bộ, loài gây bệnh cho người Nhiều vấn đề loài SLP chưa nghiên cứu Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu “Sán phổi Paragonimus heterotremus Paragonimus westermani Việt Nam: hình thái, phân tử, sinh học chẩn đoán miễn dịch” Mục tiêu đề tài: Mục tiêu chung đề tài hiểu biết hai loài SLP P heterotremus P westermani, cung cấp sở khoa học cho việc chẩn đốn phòng trị bệnh SLP, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng Với mục tiêu cụ thể sau: Xác định phương pháp xét nghiệm cua suối tốt để thu metacercaria xác định tình hình nhiễm metacercaria SLP cua suối tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Quảng Trị Xác định đa dạng hình hình thái metacercaria đa dạng di truyền phân tử hai loài P heterotremus P westermani Xác định số đặc điểm sinh học hai loài P heterotremus P westermani Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh SLP thực địa, giúp điều trị bệnh kịp thời Nội dung nghiên cứu 3.1 Xác định phương pháp xét nghiệm cua tốt để thu metacercaria điều tra tình hình nhiễm metacercaria cua suối Lào Cai, Yên Bái Quảng Trị 3.2 Nghiên cứu đa dạng hình thái metacercaria di truyền phân tử loài P heterotremus P westermani 3.3 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học hai loài sán phổi - Xác định vật chủ trung gian vật chủ ngồi tự nhiên - Sự phát triển sán phổi vật chủ vật chủ chứa - Nghiên cứu sức sống metacercaria 3.4 Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán bệnh sán phổi - Xác định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng dot-ELISA - Xác định nồng độ kháng nguyên phản ứng - Xác định thời gian phản ứng điều kiện nhiệt độ khác Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học: Đề tài cung cấp thơng tin khoa học hình thái metacercaria, di truyền phân tử số đặc điểm sinh học loài P heterotremus P westermani Việt Nam 4.2 Ý nghĩa thực tiễn: Đề tài cung cấp sở khoa học khuyến cáo phòng tránh nhiễm bệnh SLP thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đốn nhanh bệnh SLP thực địa, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng Những đóng góp đề tài 5.1 Phát metacercaria P heterotremus miền Trung P westermani miền Bắc Mô tả đa dạng hình thái metacercaria lồi SLP 5.2 Phân tích đa dạng di truyền P heterotremus P westermani Xác định P westermani Việt Nam dạng 2n 5.3 Xác định xác VCTG ấu trùng cercaria loài SLP nghiên cứu Ngoài ra, xác định VCTG loài P proliferus 5.4 Xác định vật chủ ngồi tự nhiên SLP Da Krong mèo rừng (Prionailurus bengalensis) 5.5 Xác định chó nhà khơng bị nhiễm P westermani Mèo nhà bị nhiễm P westermani với mức độ mẫn cảm thấp so với P heterotremus 5.6 Xác định chuột đóng vai trò vật chủ chứa vòng đời loài P heterotremus P westermani Việt Nam 5.7 Sức sống metacercaria SLP không phụ thuộc vào dung dịch ni, nhiệt độ, mà phụ thuộc vào mật độ metacercaria 5.8 Thiết lập kỹ thuật dot-ELISA, xác định thời gian thực điều kiện nhiệt độ khác áp dụng để chẩn đoán nhanh bệnh SLP thực địa Cấu trúc luận án Luận án gồm 111 trang, mở đầu trang, tổng quan tài liệu 21 trang, đối tượng, vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu 15 trang, kết nghiên cứu thảo luận 54 trang, kết luận kiến nghị 03 trang, đóng góp danh mục cơng trình cơng bố trang, tài liệu tham khảo 13 trang Luận văn có 21 bảng, 56 hình ảnh biểu đồ, 132 tài liệu tham khảo CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan sán phổi Đến nay, 50 lồi SLP thuộc giống Paragonimus mơ tả Vòng đời phát triển SLP cần đến vật chủ Vật chủ thú hoang động vật ni, đặc biệt họ mèo chó VCTG ốc nước VCTG cua số lồi tơm nước (Blair et al., 1999) Vật chủ chứa (Paratenic host) động vật ăn cua Các phương pháp chẩn đốn bệnh SLP bao gồm bốn nhóm: ký sinh trùng học, huyết học/miễn dịch học, chẩn đốn hình ảnh phương pháp phân tử 1.2 Tình hình nghiên cứu hai lồi Paragonimus heterotremus Paragonimus westermani giới 1.2.1 Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus heterotremus Loài P heterotremus phân bố nước Nam Á, Đơng Nam Á, phía Nam Trung Quốc, gây bệnh cho người vùng phân bố VCTG ốc thuộc họ Assimineidae Pomatiopsidae VCTG loài cua thuộc họ Potamidae Vật chủ mèo sóc Thái Lan, động vật thí nghiệm chó, mèo, chuột thỏ Chuột đóng vai trò vật chủ chứa lồi P heterotremus (Blair et al 1999) 1.2.2 Tình hình nghiên cứu lồi Paragonimus westermani Paragonimus westermani phân bố rộng châu Á, đa dạng hình thái, di truyền phân tử, sinh học P westermani chủ yếu có dạng triploid (3n) diploid (2n) Vòng đời cần 3-4 lồi vật chủ VCTG ốc thuộc giống Brotia Semisulcospirus VCTG lồi tơm 40 lồi cua Vật chủ nhiều lồi động vật có vú Sự mẫn cảm động vật với P westermani khác rõ rệt quần thể địa lý Đáng ý, người bị nhiễm loài P westermani giới hạn Đông Á Philiipines Vật chủ chứa tự nhiên lợn, lợn rừng, hươu (Blair et al 1999; Yoshida et al 2016) 1.3 Tình hình nghiên cứu sán phổi Việt Nam Bệnh SLP quan tâm nghiên cứu từ năm 1994, sau phát bệnh SLP 10 tỉnh phía Bắc Đến nay, loài SLP phát tỉnh miền Bắc Trung Trong số đó, lồi (P heterotemus, P westermani P skrjabini) có khả gây bệnh cho người Lồi P skrjabini tìm thấy cua suối Thanh Hóa với tỷ lệ nhiễm thấp; lồi P heterotremus phổ biến miền Bắc; loài P westermani phổ biến miền Trung (Doanh et al 2013) Nhiều vấn đề loài P heterotremus P westermani chưa làm sáng tỏ (Doanh et al., 2013) Hơn nữa, ca bệnh SLP tiếp tục phát Vì vậy, cần có nghiên cứu chẩn đốn nhanh, đơn giản chẩn đốn thực địa để trị bệnh kịp thời, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng Đề tài giải vấn đề CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng địa điểm nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: SLP P heterotremus P westermani 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu - Xã Lương Sơn (huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai) An Lạc (huyện Lục Yên, tỉnh Yên Bái) - nơi có tỷ lệ nhiễm metacercaria P heterotremus cao xã thuộc huyện Quảng Trị là: Hướng Sơn Tân Thành (huyện Hướng Hóa), xã Da Krong Tà Long (huyện Da Krong) - nơi có tỷ lệ nhiễm P westermani vật chủ trung gian cao 2.1.3 Thời gian nghiên cứu: từ 10/2014 đến 10/2017 2.2 Phƣơng pháp tiếp cận thiết kế thí nghiệm Metacercaria VCTG2 thị nhanh xác để xác định vùng phân bố SLP Vì vậy, điểm nghiên cứu, đề tài xét nghiệm cua suối trước để xác định địa điểm có tỷ lệ nhiễm metacercaria lồi P heterotremus P westermani cao để tiếp tục điều tra xác định vật chủ chính, VCTG ngồi tự nhiên Kết hợp phương pháp định loại hình thái phân tử để định danh loài SLP vật chủ VCTG SLP Đồng thời thu metacercaria để sử dụng cho nội dung nghiên cứu khác hình thái, di truyền sinh học 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Xét nghiệm cua thu metacercaria SLP Xác định thời gian lắng cặn phương pháp giã lọc cua: Lấy cá thể cua suối bắt vùng không nhiễm SLP Loại bỏ mai cua, dùng chày giã nhuyễn cối giã cua Đếm 50 metacercaria loài P westermani nhỏ vào cối cua giã nhuyễn, cho thêm 250 ml nước, khuấy lọc qua lưới lọc kích thước x mm vào cốc nhựa thể tích 300 ml Để lắng thời gian thử nghiệm, sau gạn ½ phần dung dịch phía sang cốc khác Tiếp tục cho thêm đầy nước vào phần cặn Tiến hành gạn-lọc đến phần cặn xem kính hiển vi soi Thử nghiệm thời gian lắng cặn lần lọc là: phút, phút phút cách dùng đồng hồ bấm Thí nghiệm với thời gian lắng cặn lặp lại lần Đem phần cặn cuối kiểm tra kính hiển vi soi tìm metacercaria SLP Thời gian lắng cặn thích hợp thời gian ngắn thu lại đủ 50 metacercariae phần cặn lần lọc cuối Làm tương tự với metacercaria loài P heterotremus - So sánh phương pháp giã-lọc cua ép cua kính thời gian xét nghiệm số lượng metacercaria thu 2.3.2 Điều tra tỷ lệ cường độ nhiễm metacercaria sán phổi Bắt cua khe suối, địa điểm xét nghiệm 50 cua suối Định loại cua dựa vào hình thái theo khóa định loại cua Việt Nam theo Đặng Ngọc Thanh Hồ Thanh Hải, 2012 Xét nghiệm cua theo phương pháp tốt xác định, từ xác định tỷ lệ cường độ nhiễm 2.3.3 Nghiên cứu hình thái metacercaria: dựa vào hình dạng, kích thước độ dày vỏ Định loại theo Doanh et al., 2013 2.3.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử SLP Chọn gen nghiên cứu: loài P heterotremus chọn đoạn chèn ITS2 gen ty thể CO1, loài P westermani chọn đoạn chèn ITS2 gen 16S, gen phân biệt dạng 2n hay 3n loài P westermani Tách chiết DNA tổng số, thực phản ứng PCR để nhân trình tự đích với cặp mồi lựa chọn, tinh khiết sản phẩm PCR, đọc trình tự trực tiếp So sánh trình tự thu vẽ phát sinh chủng loại phần mềm MEGA6 2.3.5 Gây nhiễm cho vật chủ chứa vật chủ chính: Gây nhiễm lồi SLP cho 10 cá thể chuột nhắt trắng với số lượng 50 metacercaria/chuột Sau 1-2 tháng, mổ khám chuột thí nghiệm thu sán non, gây nhiễm chuyển tiếp cho mèo nhà 10 Gây nhiễm lồi P westermani cho chó mèo nhà với số lượng 30-50 metacercaria/vật chủ Theo dõi động vật thí nghiệm, định kỳ xét nghiệm phân để tìm trứng sán phương pháp gạn lọc, xác định thời gian phát triển sán động vật 2.3.6 Nghiên cứu hình thái SLP trưởng thành: Làm tiêu cố định cách nhuộm carmine alumine Đo vẽ kích thước sán quan (giác bụng, giác miệng, tinh hoàn, buồng trứng) 2.3.7 Xác định vật chủ tự nhiên loài SLP - Xác định VCTG 1: Thu loài ốc nơi cua nhiễm metaceracria cao, định tên loài ốc theo Đặng Ngọc Thanh cs, 2006 Sheding ép ốc kính để thu cercaria SLP, định loài cercaria phân tích trình tự ITS2 Vật chủ ốc bị nhiễm ấu trùng SLP thẩm định lại phân tích trình tự gen CO1 - Xác định vật chủ chính: Xét nghiệm phân chó nhà phân động vật hoang tìm trứng SLP Mẫu trứng định loài phân tích trình tự ITS2 Những mẫu phân vật chủ có trứng SLP định lồi vật chủ qua phân tích trình tự vùng D-Loop hệ gen ty thể 2.3.8 Nghiên cứu sức sống metacercaria: - Metacercaria lồi ni nước sinh lý, điều kiện nhiệt độ khác nhau: nhiệt độ phòng 4oC mật độ 5, 50, 100, 200 metacercaria/ 2ml Định kỳ quan sát kính hiển vi soi để xác định thoát nang sống metacercaria 2.3.9 Thiết lập phản ứng dot-ELISA - Kháng nguyên chất tiết P heterotremus P westermani - 30 mẫu huyết bệnh nhân nhiễm SLP, 30 mẫu bệnh nhân nhiễm sán gan lớn, sán gan nhỏ, lao phổi huyết người bình thường sử dụng để kiểm tra mức độ phản ứng chéo 13 3.2 Đa dạng hình thái metacercaria di truyền phân tử 3.2.1 Loài Paragonimus westermani Metacercaria P westermani thu từ Yên Bái tương đối đồng hình thái Metacercaria từ tỉnh Quảng Trị khác hình dạng kích thước (P0,05) Redia lồi có kích thước tương tự (P>0,05) Tuy nhiên, chúng phân biệt với chiều dài ruột số lượng cercaria redia Redia P westermani có ruột dài 70% thể, lồi lại có ruột ngắn 20% chiều dài thể (P