Công nghệ Sinh học Vi sinh là một ngành mũi nhọn của Công nghệ sinh học, tuy nó được hình thành muộn hơn so với nhiều môn sinh học khác nhưng do ý nghĩa quan trọng của nó về mặt lý luận cũng như thực tiễn nên đã phát triển hết sức nhanh chóng.
Công nghệ Vi sinh LỜI MỞ ĐẦU Công nghệ Sinh học Vi sinh là một ngành mũi nhọn của Công nghệ sinh học, tuy nó được hình thành muộn hơn so với nhiều môn sinh học khác nhưng do ý nghĩa quan trọng của nó về mặt lý luận cũng như thực tiễn nên đã phát triển hết sức nhanh chóng. Công nghệ Sinh học Vi sinh là môn khoa học nghiên cứu những hoạt động sống của vi sinh vật nhằm khai thác chúng tốt nhất vào các quy trình sản xuất ở quy mô công nghiệp. Những tiến bộ của công nghệ sinh học vi sinh ngày càng xâm nhập sâu trong mọi lĩnh vực hoạt động của con người. Từ những sản phẩm lên men truyền thống đã quen thuộc với con người từ lâu và được sử dụng hàng ngày: sữa chua, giấm, bia… đến các sản phẩm công nghệ cao: thực phẩm chức năng, prebiotic, probiotic, công nghệ sinh học nano… đều có sự góp mặt của công nghệ vi sinh. Sự phát triển mạnh mẽ của khoa học công nghệ và điện tử hóa các thiết bị cho sản xuất vi sinh đã đưa đến một bước nhảy vọt trong nuôi cấy vi sinh vật công nghiệp. Tuy nhiên, để khai thác tối đa tiềm năng của vi sinh vật phục vụ đời sống con người cũng như thiết kế được các quy trình công nghệ phù hợp với chúng, cần hiểu rõ các nguyên lí cơ bản trong Công nghệ sinh học vi sinh vật. Để từ đó đưa đến một cái nhìn tổng quan về các bước trong nguyên lí cũng như hiểu rõ vai trò của từng khâu trong quá trình sản xuất. Qua đó, tùy trong điều kiện cụ thể sản xuất, có thể thiết kế thiết bị phù hợp, đưa ra các biện pháp khắc phục sự cố và tập trung vào khâu có vai trò quyết định đến sản phẩm nhằm tạo ra sản phẩm có chất lượng tốt nhất. -1- Công nghệ Vi sinh Một quy trình lên men cổ điển được tiến hành theo 5 giai đoạn chính sau: Một số khâu chính trong quy trình lên men: I. Giống Vi sinh vật Trong lên men công nghệ, ngoài điều kiện cần có một quy trình công nghệ hợp lý thì vấn đề giống là khâu quan trọng, quyết định giá trị kinh tế của một quy trình sản xuất. Trong công nghệ lên men, người ta sử dụng một phổ rộng gồm nhiều loại vi sinh vật thuộc nhóm Prokaryote (vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam) và Eukaryote (nấm men, nấm mốc, tảo). Hình 1. Một số hình ảnh về các chủng giống vi sinh vật a . Nấm men b. Nấm mốc 1. Tiêu chuẩn của giống Một chủng vi sinh vật được coi là chủng giống tốt phải hội tụ nhiều đặc điểm ưu việt. Trước hết chủng phải có năng suất sinh tổng hợp một chất -2- 2. Chế tạo môi trường 1. Giống vi sinh vật Khử trùng môi trường 4. Kiểm tra sự tạo thành sản phẩm 5. Thu hồi sản phẩm Nhân giống (cấp 1,2,3…) 3. Lên men a b Công nghệ Vi sinh nào đó hay tạo sinh khối với hiệu suất cao, đồng thời phải có thêm một số đặc điểm sau: - Có khả năng sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm như các phu phẩm, các nguyên liệu thô… - Trong quá trình lên men không tạo các sản phẩm phụ không mong muốn đôi với nhà sản xuất. - Ít mẫn cảm với sự tạp nhiễm do vi sinh vật khác và phage - Có sản phẩm hay sinh khối dễ dàng tách dễ dàng khỏi môi trường dinh dưỡng. Tuy nhiên không phải các tiêu chuẩn trên luôn gắn liền với nhau và cùng tồn tại ở cùng một đối tượng vi sinh vật nào đó. Các vi sinh vật thuộc nhóm Eukaryote hầu hết có kích thước tế bào lớn hay đa bào dạng sợi, do đó dễ tách chúng khỏi môi trường dinh dưỡng rất dễ dàng bằng phương pháp lọc, ly tâm thông thường, song ở chúng thường tồn tại kích thước tế bào tỉ lệ nghịch với hoạt tính trao đổi chất. Việc chọn giống vi sinh vật cho một quy trình công nghệ là điều hết sức quan trọng. Để có một giống vi sinh vật có hoạt tính cao, người ta phải hoàn thiện genotype với các phương pháp: chọn lọc, lai tạo, gây đột biến trong vật chất di truyền của tế bào hoặc trong hệ thống trao đổi chất. Trong vài thập niên gần đây, con người đã sử dụng các phương pháp kỹ thuật di truyền hiện đại để tạo các chủng giống có những tính chất mong muốn một cách chủ động. Rõ ràng việc hoàn thiện genotype của chủng giống là một việc làm không có điểm dừng và phải làm thường xuyên. Chính vì vậy các chủng giống dùng trong sản xuất có tính chất ngày một hoàn hảo hơn, đáp ứng ngày một tốt hơn các yêu cầu của con người. 2. Các công việc chủ yếu của công tác giống trong sản xuất Trong sản xuất, việc hoạt hóa giống, thường xuyên kiểm tra chất lượng của giống là quan trọng. Phòng kĩ thuật của xí nghiệp lên men phải làm những phần việc sau đây: -3- Công nghệ Vi sinh - Kiểm tra độ thuần khiết của giống trong lên men - Kiểm tra khả năng hồi biến của giống. - Hoạt hóa giống sau một thời gian sử dụng. Để hoạt hóa giống người ta thường dùng môi trường có thành phần giàu chất kích thích sinh trưởng như dịch cao nấm men, nước chiết cà chua, hỗn hợp vitamin, acid béo (Tween- 80) Hầu hết các chủng vi sinh vật dùng trong sản xuất là những chủng đột biến (chủng sản hay “khủng hoảng thừa”). Ở các chủng đột biến, khả năng hồi biến (trở về tính chất của chủng gốc) là hiện tượng rất hay xảy ra đặc biệt là các chủng vi sinh vật thuộc Prokaryote như vi khuẩn, xạ khuẩn (do hệ gen trần), ở vi sinh vật nhân thực, khả năng hồi biến là thấp hơn (do hệ gen ổn định hơn). - Giữ giống bằng những phương pháp thích hợp để có thể duy trì những tính chất cần có của chủng giống. Hiện có các phương pháp chính để giữ giống vi sinh vật như sau: 2.1. Bảo quản trên môi trường thạch, định kì cấy truyền Đây là phương pháp bảo quản đơn giản. Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định (thông thường từ 1-6 tháng), đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản này như: Staphylococci, Coliform . có thể sống được vài năm. Là phương pháp khá phổ biến được dùng trong các cơ sở nghiên cứu và sử dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt là các chủng đang dùng cho nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau: Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc. -4- Hình 2: Cấy chuyển Công nghệ Vi sinh Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo quản. Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản. Tốn nhiều công sức để cấy truyền. Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp. Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền. Các bước tiến hành: Thuần khiết chủng VSV trên môi trường agar ở đĩa petri, chọn các khuẩn lạc điển hình và cấy lên môi trường thạch nghiêng thích hợp, sau đó nuôi cấy trong tủ ấm để VSV phát triển bình thường, lấy các ống giống ra và cho vào tủ lạnh giữ ở 4 0 C. Nên cho thêm vào môi trường 0,1 M citrat natri hoặc 0,3M Oxalat để chống nhiễm Bacteriophage; 1% dầu thực vật như dầu lạc, dầu dừa. Để khắc phục nhược điểm của phương pháp cấy chuyền thường xuyên, cụ thể là hạn chế sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian bảo quản, tránh cho lớp thạch chứa môi trường bị khô, người ta thường phủ lên môi trường thạch đã có vi sinh vật phát triển một lớp dầu khoáng như paraphin lỏng. Lớp parafin này sẽ hạn chế sự tiếp xúc của vi sinh vật đối với oxygen không khí và hạn chế sự thoát hơi nước của môi trường thạch. Do vậy, ống giống có thể bảo quản một năm mà giống không bị thoái hóa và tạp nhiễm. Với phương pháp này giống có thể bảo quản ở tủ lạnh ở nhiệt độ 4 – 6 0 C hay ở nhiệt độ phòng đều được. Phương pháp này được A.Lumière và J.Chevotier đề nghị đầu tiên năm 1914 và hiện nay đang được sử dụng để bảo quản 73% nấm mốc, 100% xạ khuẩn, 80% nấm men và 73% vi khuẩn. Tuy nhiên có một số VSV không thích hợp với cách bảo quản dưới lớp dầu khoáng như Aerobacter, Alcaligens, Leuconostoc, Pseudomonas, Streptococcus, Vibrio. -5- Công nghệ Vi sinh Cách thực hiện: Cho môi trường agar thích hợp vào 1/3 ống nghiệm thanh trùng ở 121 o C/30 phút, lấy ra để nghiêng thạch 45 0 chờ thạch đông, cấy giống và nuôi trong tủ ấm để VSV phát triển tốt (tuỳ giống). Đổ parafin lỏng vào ống nghiệm (parafin được thanh trùng 121 0 C/30ph, để nguội) cách bề mặt thạch khoảng 0.5 cm và cách miệng ống 1-2cm. Sau đó dùng parafin đặc đun chảy đổ trên nút bông đem bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8 0 C. 2.2. Bảo quản trong nước cất Làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật trên thạch. Nuôi cấy vi sinh vật trong thời gian phù hợp. Cắt phần thạch chứa vi sinh vật nuôi cấy ra thành miếng sau đó được chuyển vào trong các ống nhựa hoặc lọ thủy tinh có chứa sẵn nước muối sinh lý vô trùng để bảo quản vi sinh vật Phương pháp này có thể bảo quản vi sinh vật trong nhiều năm 2.3. Bảo quản trong glycerol 15% Nuôi cấy vi sinh vật trong các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng hay trên môi trường thạch đĩa Sau khi vi sinh vật đã phát triển ở một thời gian nhất định tạo thành các khuẩn lạc tương đối lớn tiến hành phủ một lớp dầu Glycerol 15% đã vô trùng lên trên ngập khối thạch. Sự có mặt của glycerol làm tăng áp suất thẩm thấu của môi trường, do đó nước được rút từ trong tế bào ra ngoài, do đó, tế bào mất nước song vẫn được bảo quản một cách an toàn trên môi trường. Phương pháp này có thể bảo quản vi sinh vật trong nhiều năm 2.4. Giữ giống trong cát hoặc đất sét vô trùng Do cấu trúc hóa lí, cát và đất sét là những cơ chất tốt mang các tế bào vi sinh vật – chủ yếu là các bào tử. Cát hoặc đất sét được xử lý qua các khâu làm sạch, sàng lọc qua rây, xử lý bằng hóa chất để bảo đảm đạt độ trung tính, sấy khô và khử trùng để có đọ vô trùng tuyệt đối. Sau đó bằng thao tác vô trùng trộn bào tử của giống vi sinh vật cần bảo quản vào cát hay đất sét vô trùng trong các ống nghiệm. -6- Công nghệ Vi sinh Dùng paraphin nóng chảy phết lên nút bông của ống nghiệm để giúp cho ống giống không bị ẩm trở lại Phương pháp giữ giống này chủ yếu áp dụng cho các nhóm vi sinh vật sinh bào tử như nấm mốc hoặc xạ khuẩn 2.5. Giữ giống trên silicagel - Dùng để bảo quản nấm sợi có bào tử: - Các bước : Silicagel: Loại trong suốt, không có màu, kích thước và số lượng hạt silicagel đưa vào không quá 1/3 thể tích của lọ, thanh trùng ở nhiệt độ 170 ° C trong 3 giờ. Đựng trong lọ có nắp chịu nhiệt Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng (115 O C/20 phút). Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng, môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày). Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau). Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel. Chú ý silicagel hút nước và sinh nhiệt do đó việc đưa dịch bào tử vào phải được thực hiện trong chậu nước đá. Lượng dịch bào tử đưa vào không vượt quá 1/3 thể tích hạt silicagel trong lọ. Sau đó dùng tay lắc đều đảm bảo các hạt silicagel đều dính dịch bào tử nấm sợi. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp . Lọ silicagel được đậy nắp cẩn thận nhưng không vặn chặt (nới 1,5 vòng) sau đó giữ trong bình hút ẩm (độ ẩm 35 - 40%), 25 0 C/1 tuần. Vặn chặt nút và quấn giấy parafil giữ trong 4 0 C. 2.6. Giữ giống trên gelatin -7- Công nghệ Vi sinh 2.7. Giữ giống bằng phương pháp lạnh sâu Giữ giống theo phương pháp này dựa trên nguyên tắc ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách đưa chúng vào điều kiện lạnh sâu ở -25 0 đến -70 0 C. Để bảo đảm rằng tế bào vi sinh vật không bị chết khi bị làm lạnh sâu, người ta cần trộn sinh khối của giống cần bảo quản với dung dịch bảo vệ (dung dịch nhũ hóa) như glyxerin 15% , huyết thah ngựa (loại không cho chất bảo quản). dung dịch glucose hoặc lactose 10 % .Việc làm lạnh được tiến hành một cách từ từ. Khi độ lạnh đạt -20 0 C, việc tiếp tục làm lạnh cần đạt tốc độ 1 - 2 0 C/ phút. Hình 3: Giữ giống trong tủ lạnh sâu Với phương pháp này cũng cần cấy chuyền và làm lại, nhưng thời gian giữa các lần cấy chuyền được kéo dài hơn phương pháp 1. Thời gian cấy chuyền như sau: Nếu giữ ở t = -15 0 đến -20 0 C: 6 tháng cấy chuyền và làm lại một lần Nếu giữ ở t = -30 0 C : 9 tháng cấy chuyền và làm lại một lần Nếu giữ ở t = -40 0 C : 1 năm cấy chuyền và làm lại một lần Nếu giữ ở t = -50 0 đến -60 0 C: 3 năm cấy chuyền và làm lại một lần Nếu giữ ở t = -70 0 C : 10 năm cấy chuyền và làm lại một lần -8- Công nghệ Vi sinh Phương pháp bảo quản giống này khá đơn giản và tiện lợi, lại cho hiệu quả bảo quản khá cao. Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C và -196° C. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30° C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut. Hiện nay nó là một trong những phương pháp được sử dụng khá phổ biến để bảo quản giống vi sinh vật. Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro cháy nổ . Phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô. Hình 4: Giữ giống bằng Nito lỏng A. Bình chứa Nito lỏng B. Ống nhựa nút xoáy đựng giống trong giữ giống bằng Nito lỏng -9- A B Công nghệ Vi sinh 2.8. Giữ giống bằng phương pháp đông khô Về nguyên tắc, cách giữ giống này giống với giữ giống bằng lạnh đông, tức vi sinh vật trong quá trình xử lý sẽ được đưa vào nhiệt độ thấp (lạnh sâu) ở t = -60 0 đến -70 0 C một cách từ từ sự có mặt của chất bảo vệ như: Glutamat 3% hay lactose 1,25 + pepton 1,2% hay Saccharose 8% + sữa 5% + gelatin 1,5% Điều khác biệt với phương pháp lạnh đông là: để bảo đảm an toàn hơn cho sự sống của tế bào giống, người ta làm thăng hoa phần nước ở trong tế bào sống và môi trường có chất bảo vệ trong thiết bị đông khô ở áp suất 1.10 -4 mmHg. Hỗn hợp tế bào giống và dung dịch bảo vệ được chứa trong những ampul thủy tinh có đường kính 15 mm được hàn kín để bảo đảm độ khô và chân không cần thiết. Những ampul này được bảo quản ở nhiệt độ 4 - 6 0 hay ở nhiệt độ phòng. Phương pháp này được cho là tối ưu, cho hiệu suất bảo quản cao nhất vì có thể giữ giống vi sinh vật qua hàng chục năm vãn có tỷ lệ sống cao và không bị biến đổi về di truyền, đồng thời chiếm diện tích bảo quản ít nhất. Thời gian gần đây, cùng với sự phát triển cảu công nghệ gen, phương pháp giữ giống bằng ngân hàng gen cũng được nghiên cứu áp dụng. Tuy có tính ưu việt cao của phương pháp về việc lưu giữ những đặc tính quý hiếm của vi sinh vật nhưng phương pháp đòi hỏi phí tổn cho trang thiết bị và kỹ thuật còn quá cao. Kiểm tra độ sống sót sau khi đông khô: Đây là khâu quan trọng đánh giá khả độ an toàn cũng như hiệu quả của phương pháp giữ giống. Cách làm này được tiến hành như sau: -10- Hình 5:. Bảo quản giống bằng phương pháp đông khô . Công nghệ Vi sinh LỜI MỞ ĐẦU Công nghệ Sinh học Vi sinh là một ngành mũi nhọn của Công nghệ sinh học, tuy nó được hình thành. đến các sản phẩm công nghệ cao: thực phẩm chức năng, prebiotic, probiotic, công nghệ sinh học nano… đều có sự góp mặt của công nghệ vi sinh. Sự phát triển