Khóa luận tốt nghiệp Nghiên cứu định danh Potyvirus hại cây hoa loa kèn

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPĐỀ TÀI:Nghiên cứu định danh Potyvirus hại cây hoa loa kènMỤC LỤCLời cảm ơniMục lụciiDanh mục chữ viết tắtvDanh mục bảngviDanh mục hìnhviiTóm tắtixPHẦN I: MỞ ĐẦU11.1Đặt vấn đề11.2Mục đích và yêu cầu của đề tài21.2.1Mục đích21.2.2Yêu cầu2PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU32.1Sơ lược về hoa loa kèn32.2Sơ lược về họ Potyviridae32.2.1Giới thiệu32.2.2Cấu trúc32.3Sơ lược về chi Potyvirus42.3.1Giới thiệu42.3.2Cấu trúc phân tử42.3.3Genome52.3.4Chức năng các protein62.3.5Sự tái bản62.3.6Phương thức lan truyền62.4Sơ lược về bệnh virus trên họ loa kèn62.5Chẩn đoán virus bằng kỹ thuật RTPCR62.6Kỹ thuật xác định trình tự6PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU163.1Đối tượng nghiên cứu163.2Địa điểm và thời gian nghiên cứu163.2.1Địa điểm nghiên cứu163.2.2Thời gian nghiên cứu 163.3Vật liệu nghiên cứu163.4Phương pháp nghiên cứu173.4.1Điều tra bệnh173.4.2Thu mẫu và xử lý mẫu173.4.3Tách chiết RNA tổng số từ mẫu bệnh183.4.4Các mồi sử dụng trong nghiên cứu183.4.5Phân lập gen bằng kỹ thuật RTPCR183.4.6Điện di sản phẩm RTPCR trên agarose gel 1% 183.4.7Giải trình tự gen virus183.4.8Phân tích trình tự gen virus193.4.9Xác định bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo.193.4.10Kỹ thuật nuôi cấy meristem19PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN214.1Bệnh virus trên cây hoa loa kèn214.1.1Mô tả triệu chứng214.1.2Điều tra tình hình bệnh virus trên hoa loa kèn năm 2015224.1.3Điều tra mức độ ảnh hưởng của bệnh virus đến khả năng sinh trưởng của cây hoa loa kèn224.1.4Khả năng lan truyền bệnh virus qua củ giống 224.2Xác định virus bằng RTPCR 244.2.1Xác định virus hại hoa loa kèn trắng224.2.2Xác định virus hại hoa loa kèn đỏ224.3Kết quả giải trình tự gen Potyvirus gây bệnh khảm lá hoa loa kèn đỏ254.4Kết quả xác định phổ ký chủ của virus284.4.1Xác định phổ ký chủ của LMoV224.4.2Xác định phổ ký chủ của virus mới hại cây hoa loa kèn đỏ224.5Kết quả nuôi cấy meristem314.6Xác định virus hại cây hoa lay ơn22PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ525.1Kết luận525.2Kiến nghị53TÀI LIỆU THAM KHẢO54PHỤ LỤC58

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: Nghiên cứu định danh Potyvirus hại hoa loa kèn Sinh viên thực : Hoàng Ngọc Anh Mã sinh viên : 560770 Lớp : CNSHA - K56 Giáo viên hướng dẫn : TS Hà Viết Cường “ Khóa luận đệ trình khoa CNSH, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội phần u cầu trình độ đại học ngành Cơng nghệ sinh học”, năm học 2014-2015 HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực đề tài thực tập tốt nghiệp, đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ động viên từ các thầy cô, gia đình bạn bè Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Hà Viết Cường - người đã trực tiếp hướng dẫn đóng góp những ý kiến quan cho tơi tồn quá trình thực đề tài tớt nghiệp Tơi cũng xin chân thành cảm ơn đến tập thể các anh chị cán Trung tâm nghiên cứu bệnh nhiệt đới, các thầy cô giáo môn Công Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tơi có thể hồn thành tớt đề tài tớt nghiệp Ći cùng tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè đã giúp rất nhiều về mặt kinh tế cũng tinh thần giúp tơi trì được trạng thái tớt nhất śt quá trình thực đề tài Một lần nữa xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Hoàng Ngọc Anh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .v DANH MỤC BẢNG .vi DANH MỤC HÌNH .vii TÓM TẮT viii PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đê 1.2 Mục đích yêu cầu của đê tài .10 1.2.1 Mục đích 10 1.2.2 Yêu cầu .10 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 2.1 Sơ lược vê hoa loa kèn 11 2.2 Sơ lược vê họ Potyviridae 11 2.2.1 Giới thiệu 11 2.2.2 Cấu trúc 12 2.3 Sơ lược vê chi Potyvirus 12 2.3.1 Giới thiệu 12 2.3.2 Cấu trúc phân tử .12 2.3.3 Genome 13 2.3.4 Chức các protein 13 2.3.5 Sự tái bản 16 2.3.6 Phương thức lan truyền 17 2.4 Sơ lược vê bệnh virus họ loa kèn 17 2.4.1 Hippeastrum mosaic virus (HiMV) 17 2.4.2 Vallota speciosa virus .18 2.4.3 Lily mottle virus (LMoV) 18 2.4.4 Lily symptomless virus (LSV) 19 2.4.5 Tulip breaking virus (TBV) 19 ii 2.4.6 Lily virus X (LVX) 20 2.4.7 Narcissus mosaic virus (NMV) 20 2.5 Chẩn đoán virus kỹ thuật RT-PCR 20 Các bước chẩn đoán bệnh RT-PCR: 20 1.Thiết kế mồi: tự thiết kế hoặc lựa chọn mồi từ nghiên cứu được công bố 20 2.Tách chiết RNA tổng số từ mô 20 3.Tiến hành phản ứng RT-PCR 20 4.Kiểm tra, đánh giá kết điện di 20 Có loại mồi được sử dụng cho chẩn đoán bệnh cây: .20 Mồi chung (degenerate primers): được thiết kế vùng bảo thủ cao, có khả phát đối tượng khác hẳn (thường đối tượng họ, chi) 20 Mồi đặc hiệu (specific primers): được thiết kế vùng phân biệt được lồi, chí lồi chủng, nòi… 20 2.6 Kỹ thuật xác định trình tự .21 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Đối tượng nghiên cứu .22 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 22 3.2.2 Thời gian nghiên cứu: .22 Từ 01/2015 đến 06/2015 22 3.3 Vật liệu nghiên cứu 22 Bảng 3.2 Thành phần môi trường MS .24 3.4 Phương pháp nghiên cứu 24 3.4.1 Điều tra bệnh 24 3.4.2 Thu mẫu xử lý mẫu 25 3.4.3 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu bệnh 25 3.4.4 Các mồi sử dụng nghiên cứu 25 3.4.5 Phân lập gen bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction) 26 iii 3.4.6 Điện di sản phẩm RT-PCR Agarose gel % .27 3.4.7 Giải trình tự gen virus 27 3.4.8 Phân tích trình tự gen virus 28 3.4.9 Xác định bệnh bằng nhiễm nhân tạo 28 3.4.10 Kỹ thuật nuôi cấy Meristem 29 3.4.10.1 Cách pha chế .29 3.4.10.2 Nuôi cấy meristem .29 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Bệnh virus hoa loa kèn 30 4.1.1 Mô tả triệu chứng .30 4.1.2 Điều tra tình hình bệnh virus hoa loa kèn năm 2015 31 4.2 Xác định virus RT-PCR 33 4.2.1 Xác định virus gây bệnh khảm hoa loa kèn trắng 34 36 37 4.2.2 Xác định virus gây bệnh khảm hoa loa kèn đỏ 37 4.3 Kết quả giải trình tự gen Potyvirus gây bệnh khảm lá hoa loa kèn đỏ 39 4.4 Kết quả xác định phổ ký chủ virus 4.4.1 Xác định phổ ký chủ LMoV Cây lây Lần .1 Lần .1 Triệu chứng tuần 18 ngày 4.4.2 Xác định phổ ký chủ virus mới hại hoa loa kèn đỏ .2 Cây lây Lần .3 Lần .3 Triệu chứng tuần 18 ngày TÀI LIỆU THAM KHẢO .7 Bảng 3.2 Thành phần môi trường MS .10 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Bp CTAB cDNA CNSH dNTP DNA dNTP HVNNVN Kb NCBI LKĐ LKT L PCR RT-PCR RNA TTBCNĐ TS TAE Taq β- ME Từ viết tắt Base pair Cetryl Ammonium Bromide Complementary DNA Công Nghệ Sinh học Deoxynucleoside triphosphate Deoxyribonucleic acid Deoxynucleoside triphosphate Học viên Nông nghiệp Việt Nam Kilo base National Center for Biotechnology Information Loa kèn đỏ Loa kèn trắng Lay ơn Polymerase Chain Reaction Reverse transcription - Polymerase Chain Reaction Ribonucleic acid Trung tâm Bệnh nhiệt đới Tiến sĩ Tris – acetate – EDTA Thermus aquatic Beta- Mercaptoethanol v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.3 Các mồi dùng nghiên cứu 26 Bảng 4.1 Triệu chứng bệnh giớng bị nhiễm virus hai loại hoa loa kèn 30 Bảng 4.2 Tỷ lệ bệnh virus hoa loa kèn 31 Chúng tiến hành kiểm tra Potyvirus bằng phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi chung cho Potyvirus CIFor CIRev mẫu LKT: mẫu LKT (LKT-35 LKT-39) biểu triệu chứng khảm lá điển hình mẫu LKT đới chứng (LKT-ĐC9) khơng xuất triệu chứng (Hình 4.7 Bảng ) Các mẫu được chiết bằng phương pháp CTAB/LiCl Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR cho thấy cả mẫu LKT mang triệu chứng khảm lá đều cho phản ứng dương tính với băng sản phẩm ~ 0.7kb còn mẫu đới chứng cho kết quả âm tính (Bảng 4.4 Hình 4.8) Kết quả chứng tỏ rằng, bệnh khảm lá hoa loa kèn trắng Potyvirus gây 34 35 Hình 4.7 Các mẫu lá: LKT-35 (1), LKT-39 (2), LKT-ĐC9 (3) 35 Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra RT-PCR các mẫu hoa loa kèn trắng 35 Để xác định virus gây bệnh khảm lá hoa loa kèn đỏ, chúng đã tiến hành thí nghiệm với mẫu LKĐ LKĐ-ĐC5, LKĐ-17, LKĐ-18 (Bảng 3.1 Hình 4.10) .37 38 Hình 4.10 Các mẫu lá: LKĐ-ĐC5 (1), LKĐ-17 (2), LKĐ-18 (3) .38 Giớng thí nghiệm với LKT, đầu tiên, chúng tơi cũng kiểm tra xem các mẫu LKĐ có nhiễm Potyvirus hay không bằng kỹ thuật RT-PCR sử dụng cặp mồi chung CIFor/CIRev Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR (Hình 4.11) cho thấy, mẫu LKĐ-17 LKĐ-18 đều xuất băng sản phẩm ~ 0.7kb còn mẫu LKĐ-ĐC5 khơng Kết quả cho ta thấy, triệu chứng khảm lá hoa LKĐ cũng Potyvirus gây Trường hợp mẫu lá LKĐ-18 khơng có triệu chứng khảm lá vẫn cho băng sản phẩm ~ 0.7kb chứng tỏ rằng, mẫu lá LKĐ thu từ phương pháp tách vảy củ có mang Potyvirus chưa biểu thành triệu chứng khảm 38 Sau khẳng định bệnh khảm lá loa kèn đỏ Potyvirus gây ra, chúng tiếp tục kiểm tra RT-PCR sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/LMoV-CP3R với các mẫu cho kết quả dương tính với Potyvirus: LKĐ-17 LKĐ-18 Tuy nhiên, cả mẫu đều cho kết quả âm tính (Bảng 4.5 Hình 4.11) 38 Từ các kết quả trên, chúng kết luận rằng, các mẫu loa kèn đỏ đã nhiễm loại Potyvirus khác mà không phải virus LMoV hoa loa kèn trắng 38 Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra RT-PCR các mẫu hoa loa kèn đỏ 38 Bảng 4.: Kết quả lây nhiễm nhân tạo virus LMoV Bảng 4.13: Kết quả lây nhiễm nhân tạo bệnh virus hoa loa kèn đỏ Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra RT-PCR rên các mẫu hoa Lay ơn vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Mơ hình cấu trúc phân tử các potyvirus 13 Hình 2.2 Sơ đồ tở chức genome potyvirus 13 Hình 4.1 Bệnh khảm lá hoa loa kèn trắng (1, 2), khảm lá hoa loa kèn đỏ (3) (nguồn Hoàng Ngọc Anh, 2015) 31 Hình 4.5 Sơ đồ gen potyvirus vị trí tương đối .34 cặp mồi CIFor CIRev 34 Hình 4.6 Vị trí cặp mồi đặc hiệu LMoV gen potyvirus 34 Hình 4.8 Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát potyvirrus loa kèn trắng dùng cặp mồi chung CIFor/CIRev M: thang DNA kb (hãng Fermentas) 1,2,3: sản phẩm RT-PCR các mẫu LKT-35, LKT-39, 36 LKT-ĐC9 36 Hình 4.9 Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát LMoV các mẫu loa kèn trắng bị bệnh khảm lá sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoVCP3-R M: thang DNA kb (hãng Fermentas) 1,2: sản phẩm RT-PCR .37 các mẫu LKT-35, LKT-39 37 Hình 4.11 Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát Potyvirus LMoV các mẫu loa kèn đỏ M: thang DNA kb (hãng Fermentas) .39 1,2,4: sản phẩm RT-PCR các mẫu LKĐ-ĐC5, LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng cặp mồi CIFor/CIRev 3, 5: sản phẩm RT-PCR các mẫu LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R .39 Hình : Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát LMoV sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R các mẫu loa kèn trắng M: thang DNA kb (hãng Fermentas) 1,2: sản phẩm RT-PCR các mẫu LKĐ-ĐC5, LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng cặp mồi CIFor/CIRev 3, 5: sản phẩm RT-PCR các mẫu LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R Hình 4.6 Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát Potyvirus LMoV các mẫu hoa lay ỏn M thang DNA kb (Fermentas) Các giếng 1,2,4 tương ứng với các mẫu L1, L2, L3 sử dụng cặp mồi chung CIFor/CIRev Các giếng 3, tương ứng với các mẫu L2, L3 sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R vii TÓM TẮT Vụ mùa 2009, sự xuất bệnh lùn sọc đen SRBSDV gây nhiều tỉnh thành miền bắc Việt Nam đã gây hậu quả nghiêm trọng, lúa bị lùn, lá xoắn vặn xanh thẫm, lúa không trỗ hoặc trỗ không thoát gây mất sản lượng phải tiêu hủy Hậu quả đã dẫn đến thiệt hại hàng nghìn tỉ đồng cho sản x́t nơng nghiệp nước ta Nguyên nhân gây bệnh đã được xác định bằng sinh học phân tử Chúng đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân dòng gen S10 SRBSDV từ tiến hành tạo plasmid tái tở hợp giải trình tự tồn ORF gen S10 clone Kết quả giải trình tự phân tích các ch̃i tương đồng tìm kiếm ngân hàng gen đã cho thấy quan hệ giữa bốn chuỗi Việt Nam với các chuỗi cùng chi Fijivirus cùng họ Reoviridae Chúng đã xây dựng thành công cấu trúc biểu gen S10 vector biểu pET-28a (+) Việc biểu protein tái tổ hợp cũng đã được tiến hành nhiên vẫn chưa thu được kết quả khả quan viii PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đê Trong những năm gần đây, nền kinh tế phát triển mạnh mẽ, người không chỉ quan tâm về đời sống vật chất mà còn quan tâm rất nhiều đến đời sống tinh thần Trong đời sống tinh thần đó, người ta khơng thể khơng kể đến giá trị các lồi hoa Nước ta có khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm tạo nên các vùng sinh thái đa dạng thích hợp cho việc trồng trọt nhiều chủng hoa đẹp Việt Nam thế giới Hiện tại, nước ta có khoảng 5000 sản xuất hoa, cảnh với tởng sản lượng ước tính khoảng tỷ cành hoa Năm 2001, cả nước có 8000 đất trồng hoa, chủ yếu tập trung các tỉnh thành Lâm Đồng (1254 ha), Hà Nội (867 ha), Hưng Yên (867 ha)…, với doanh thu 291 tỷ đồng, giá trị xuất khẩu đạt tỷ đồng Về mặt kinh tế, nghề trồng hoa đem lại lợi nhuận cao trồng lúa Chính vậy, nghề trồng hoa ngày được phát triển với quy mơ, diện tích chủng loại hoa ngày tăng lên Cùng với các loài hoa như: lan, hồng, lay ơn, cúc…, hoa loa kèn cũng loài hoa rất được ưa chuộng chúng có màu sắc đẹp, tươi lâu, chủng loại vơ cùng đa dạng Hiện nước ta, hoa loa kèn được trồng khá phở biến Tuy nhiên, quá trình gieo trồng, sản xuất hoa loa kèn thấy xuất nhiều triệu chứng virus gây Hầu hết các virus gây bệnh thuộc chi Potyvirus – chi lớn nhất tám chi họ Potyviridae Bệnh Potyvirus gây những ảnh hưởng không nhỏ đến giá trị thẩm mỹ hoa Chi virus xuất phổ biến các nước nhiệt đới cận nhiệt đới Việt Nam Virus có thể gây nhiều triệu chứng khác ký chủ khảm, đốm, sáng gân, lùn cây, héo, còi cọc… Trong đó, hoa loa kèn triệu chứng khảm lá chủ ́u Tại Việt Nam, chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu về Potyvirus hoa loa kèn Vì vậy, để có thể góp phần cung cấp thêm thơng tin về lồi virus này, từ đề các biện pháp phòng trừ hợp lý, đạt hiệu quả cao, dưới sự hướng dẫn TS Hà Viết Cường, chúng tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu định danh Potyvirus hại hoa loa kèn” Hình 4.8 Kết chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát potyvirrus loa kèn trắng dùng cặp mồi chung CIFor/CIRev M: thang DNA kb (hãng Fermentas) 1,2,3: sản phẩm RT-PCR của mẫu LKT-35, LKT-39, LKT-ĐC9 Sau đã biết được virus gây bệnh khảm lá hoa loa kèn trắng Potyvirus lần kiểm tra RT-PCR tiếp thep, chúng chỉ thực với mẫu LKT biểu triệu chứng khảm Trong lần chạy RT-PCR này, chúng sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R đặc hiệu cho virus LMoV Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR cho thấy cả mẫu đều tạo sản phẩm có kích thước mong ḿn ~ 1kb (Bảng 4.4 Hình 4.9) Như vậy, bệnh khảm lá loa kèn trắng virus LMoV gây 36 Hình 4.9 Kết chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát LMoV mẫu loa kèn trắng bị bệnh khảm sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoVCP3-R M: thang DNA kb (hãng Fermentas) 1,2: sản phẩm RT-PCR của mẫu LKT-35, LKT-39 4.2.2 Xác định virus gây bệnh khảm hoa loa kèn đỏ Để xác định virus gây bệnh khảm lá hoa loa kèn đỏ, chúng tơi đã tiến hành thí nghiệm với mẫu LKĐ LKĐ-ĐC5, LKĐ-17, LKĐ-18 (Bảng 3.1 Hình 4.10) 37 Hình 4.10 Các mẫu lá: LKĐ-ĐC5 (1), LKĐ-17 (2), LKĐ-18 (3) Giớng thí nghiệm với LKT, đầu tiên, chúng cũng kiểm tra xem các mẫu LKĐ có nhiễm Potyvirus hay khơng bằng kỹ thuật RT-PCR sử dụng cặp mồi chung CIFor/CIRev Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR (Hình 4.11) cho thấy, mẫu LKĐ-17 LKĐ-18 đều xuất băng sản phẩm ~ 0.7kb còn mẫu LKĐĐC5 khơng Kết quả cho ta thấy, triệu chứng khảm lá hoa LKĐ cũng Potyvirus gây Trường hợp mẫu lá LKĐ-18 triệu chứng khảm lá vẫn cho băng sản phẩm ~ 0.7kb chứng tỏ rằng, mẫu lá LKĐ thu từ phương pháp tách vảy củ có mang Potyvirus chưa biểu thành triệu chứng khảm Sau khẳng định bệnh khảm lá loa kèn đỏ Potyvirus gây ra, chúng tiếp tục kiểm tra RT-PCR sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/LMoV-CP3-R với các mẫu cho kết quả dương tính với Potyvirus: LKĐ-17 LKĐ-18 Tuy nhiên, cả mẫu đều cho kết quả âm tính (Bảng 4.5 Hình 4.11) Từ các kết quả trên, chúng kết luận rằng, các mẫu loa kèn đỏ đã nhiễm loại Potyvirus khác mà không phải virus LMoV hoa loa kèn trắng Bảng 4.5 Kết kiểm tra RT-PCR mẫu hoa loa kèn đỏ STT Ký hiệu mẫu CI-F/CI-R 38 LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R LKĐ-ĐC5 LKĐ-17 LKĐ-18 + + KT - Ghi chú: KT: không thử, (-): âm tính, (+): dương tính Hình 4.11 Kết chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát Potyvirus LMoV mẫu loa kèn đỏ M: thang DNA kb (hãng Fermentas) 1,2,4: sản phẩm RT-PCR của mẫu LKĐ-ĐC5, LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng cặp mồi CIFor/CIRev 3, 5: sản phẩm RT-PCR của mẫu LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R 4.3 Kết giải trình tự gen Potyvirus gây bệnh khảm hoa loa kèn đỏ 39 4.4 Kết quả xác định phổ ký chủ virus 4.4.1 Xác định phổ ký chủ LMoV LMoV Potyvirus rất phổ biến, chủ yếu gây hại các loài thực vật lá mầm, với ký chủ điển hình các thuộc họ Hành tỏi (Liliaceae) hoa Ly, hoa Tulip…Vì vậy, để xác định sớ lồi thực vật có thuộc phở ký chủ cúa virus LMoV không, chúng đã lây nhiễm nhân tạo bằng tiếp xúc học hoa loa kèn trắng nhiễm virus số chỉ thị thuốc lá (Nicotiana tabacum var Xanthi), phong huệ đỏ (Zephyranthes rosea), ly (thu từ phương pháp tách vảy củ; nguồn: Viện nghiên cứu Rau quả), cỏ lan chi (Chlorophytum bichetii), lơ hội Sau lây nhiễm, thí nghiệm được để nơi thoáng mát quan sát trong vòng tuần Kết quả theo dõi cho thấy các thí nghiệm chỉ có thuốc lá biểu triệu chứng khảm lá (7/9 cây) (Bảng Và Hình ) Bảng 4.: Kết lây nhiễm nhân tạo virus LMoV Cây lây Lần Lần tuần 18 ngày N.tabacum var Xanthi 0/9 0/9 7/9 Ly 0/9 0/9 0/9 Cỏ lan chi 0/6 0/6 0/6 Tóc tiên 0/6 0/6 0/6 Lơ hội 0/6 0/6 0/6 Ghi chú: (-) là các không biểu triệu chứng Triệu chứng Khảm lá - Hình Cây thuốc lá: đối chứng (1,2), biểu triệu chứng khảm sau lây nhiễm 18 ngày (3,4) Mũi tên xuất triệu chứng khảm 4.4.2 Xác định phổ ký chủ virus hại hoa loa kèn đỏ Virus gây hại hoa loa kèn đỏ, vẫn chưa được nghiên cứu nhiều, đó, để xác định phở ký chủ virus này, chúng cũng tiến hành lây nhiễm nhân tạo bằng tiếp xuc học hoa loa kèn đỏ nhiễm virus tương tự đối với loa kèn trắng Một số chỉ thị được sử dụng thuốc lá (Nicotiana tabacum var Xanthi), hoa loa kèn đỏ (Hippeastrum sp.)(bộ môn Thực vật – khoa CNSH), phong huệ đỏ (Zephyranthes rosea), ly (thu từ phương pháp tách vảy củ; nguồn: Viện nghiên cứu Rau quả), cỏ lan chi (Chlorophytum bichetii) Sau tuần theo dõi, kết quả thí nghiệm được trình bày bảng Bảng 4.13: Kết lây nhiễm nhân tạo bệnh virus hoa loa kèn đỏ Cây lây Lần Lần tuần 18 ngày N.tabacum var Xanthi 0/9 0/9 7/9 Ly 0/9 0/9 0/9 Cỏ lan chi 0/6 0/6 0/6 Tóc tiên 0/6 0/6 0/6 Loa kèn đỏ nhân nhanh 0/4 0/6 0/6 Ghi chú: (-) là các không biểu triệu chứng Triệu chứng Khảm lá - 4.5 Kết nuôi cấy Meristem Theo nghiên cứu ThS Nguyễn Thị Thu (2011), các hoa loa kèn trắng được sử dụng các chất kích kháng : Bion, Salicylic acid, Exin để phòng chống bệnh khảm lá LMoV gây ra, có xuất dấu hiệu phục hồi hiệu quả còn thấp khơng kéo dài Chình vậy, đề tài này, chúng tiến hành nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoa loa kèn trắng bị bệnh khảm lá, nhằm mục đích có thể tạo loa kèn trắng bệnh điều kiện nuôi cấy invitro Các loa kèn trắng được lựa chọn để ni cấy những có triệu chứng khảm lá điển hình, sinh trưởng tớt (Hình 4.) Tuy nhiên, Meristem đích thực quá nhỏ, khó có thể tách xác Vì vậy, để dễ dàng hơn, chúng tơi vẫn giữ lại 23 lớp lá bao phía ngồi mẫu ni cấy Trong quá trình theo dõi, chúng thấy rằng, với môi trường nuôi cấy thông thường MS, các mẫu ni cấy Meristem vẫn có khả sớng sinh trưởng tớt (hình thành rễ sau tháng ni cấy) (Hình 4.) Tuy nhiên, sau …ngày rễ, mẫu bắt đầu có biểu triệu chứng khảm lá Do đó, chúng tơi tiến hành kiểm tra RT-PCR mẫu lá LKT thu từ phương pháp nuôi cấy Meristem cùng với phần Meristem (vẫn giữ vài lớp lá bao, tương tự nuôi cấy) LKT cũng bị bệnh khảm lá (Bảng ), sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho virus LMoV Kết quả cho thấy, các mẫu lá LKT ni cấy Meristem đều cho phản ứng dương tính với băng sản phẩm ~ 1kb, còn đối với phần Meristem lại cho kết quả âm tính Điều chứng tỏ, mục đích tạo bệnh từ kỹ thuật ni cấy Meristem có sở, nhiên, đề tài này, phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng lại không đem lại hiệu quả Nguyên nhân có thể virus đã bị lây lan quá trình tách mẫu cấy Hình : Quá trình sinh trưởng của mẫu ni cấy Meristem Hình Cây loa kèn trắng từ kỹ thuật nuôi cấy Meristem, với nguồn LKT-3 (1), LKT-6 (2) Hình : Kết chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát LMoV sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R mẫu loa kèn trắng M: thang DNA kb (hãng Fermentas) 1,2: sản phẩm RT-PCR của mẫu LKĐ-ĐC5, LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng cặp mồi CIFor/CIRev 3, 5: sản phẩm RT-PCR của mẫu LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R 4.6 Xác định virus hại hoa lay ơn Trong quá trình điều tra, chúng tơi đã phát thấy số hoa Lay ơn cũng xuất triệu chứng khảm lá tương tự hoa Loa kèn đỏ (Hình ) Cây hoa Lay ơn thuộc chi Gladiolus, họ Iridaceae, loại thân dài kiếm nhỏ, có hoa (nhiều màu thường màu đỏ hay hồng) nở dọc theo thân Giống Loa kèn trắng Loa kèn đỏ, Lay ơn những hoa được trồng bằng củ Củ hoa Lay ơn cũng tương tự củ hoa Loa kèn đỏ, thân củ hình tròn, đối xứng, bao xung quanh bằng các lớp vỏ màu nâu Bảng 4.5 Kết kiểm tra RT-PCR rên mẫu hoa Lay ơn STT Ký hiệu mẫu CI-F/CI-R LKT LKT LKT + + - LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R KT Hình 4.6 Kết chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát Potyvirus LMoV mẫu hoa lay ỏn M thang DNA kb (Fermentas) Các giếng 1,2,4 tương ứng với mẫu L1, L2, L3 sử dụng cặp mồi chung CIFor/CIRev Các giếng 3, tương ứng với mẫu L2, L3 sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Thị Thu (2011) Nghiên cứu bệnh Potyvirus gây hoa trồng bằng củ Hà Nội Báo cáo thực tập tốp nghiệp, chuyên ngành Bảo vệ thực vật Hà Viết Cường (2010) Bài giảng môn Virus thực vật Hà Viết Cường (2011) Các virus thực vật phát Hiện Việt Nam Hội thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt nam lần thứ 10, 2011 Tài liệu tiếng anh Adams, M J., Antoniw, J F & Beaudoin, F (2005) a Overview and analysis of the polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae Mol Plant Pathol 6, 471–487 Asjes, C J., De Vos, N.P., Van Slogteren, D.H.M (1973) Brown ring formation and streak mottle, two distinct syndrome in lilies associated with complex infections of lily symptomless virus and tulip breaking virus Plant pathology 79, 23-35 Brunt, A.A (1973) CMI/AAB Descr Pl Viruses No 117, pp Brunt, A.A (1973) Rep Glasshouse Crops Res Inst 1972, p 103 Brunt, A.A., Barton, R.J., Tremaine, J.H and Stace-Smith, R (1975) J gen Virol 27: 101 Brierley, P and Smith, F.F (1944) Study on lily virus diseases: the mottle group, Phytopathology 34: 718 Brierley & Smith, Phytopathology 34: 718, 1944, Brunt, A., Crabtree, K., Dallwitz, M.J., Gibbs, A., Wastson, L and Zurcher, E (1996a) Plant Viruses CAB International Descriptions and Lists from the VIDE Database, CAB International Dekker, E L., Derks, A.F.L.M., Asjes, C.J., Lemmers, M.C., Bol, J.F and Langeveld, S.A (1993) Characterization of potyvirus from tulip and lily wHich cause flower-breaking JGenVirology 74 FAO, 1991 Viroid purification and characterization Handbook for detection and diagnosis of graft-transmissible diseases of citrus, Ch22 10 Cuong Ha, S Coombs, P A Revill1, R M Harding, M Vu, J L Dale (2008b) Design and application of two novel degenerate primer pairs for the detection and complete genomic characterization of potyviruses Archives of virology Vol 153:25-36 11 Cuong Ha, S Coombs, P A Revill1, R M Harding, M Vu, J L Dale (2008c) Identification and sequence analysis of potyviruses infecting crops in Vietnam Archives of virology Vol.153:45-60 12 Hari, V (1981) The RNA of tobacco etch virus: further characterisation and detection of protein linked to RNA Virology 112, 391-399 13 Hari, V., Siegel, A., Rozek, D & Timberlake, W.E (1979) The RNA of tobacco etch virus contains poly(A) Virology 92, 568-571 14 Kunkel, L.O (1922) Science 55: 73.Stevens, P.F (2001), Angiosperm Phylogeny Website: Asparagales: Amaryllidoideae 15 M Benschop (2010) THE gLOBAL flower bulb industry: Production, Utilization, Research Horticultural Reviews, Volume 36 16 Mowat, Rep Scott hort Res Inst for 1964 & 1965: 51, 1966 17 Narayanasamy (2010) Microbial Plant Pathogens-Detection and Disease Diagnosis:: Viral and Viroid Pathogens, Volume 18 Shukla, D D., Ward, C.W., Brunt, A A., and Berger, P H (1998) Potyviridae family Description of plant viruses No.366 19 TakahasHi, Y., TakahasHi, T & Uyeda, I (1997) A cDNA clone to clover yellow vein potyvirus genome is Highly infectious Virus Genes 14(3), 235-243 20 Wei,T., Pearson,M.N and Cohen,D (2006) Novel sequence wHich related to potyvirus was found from ornamental plant in New Zealand School of Biological Sciences, The University of Auckland, 3a Symonds Street, Thomas Building, Auckland 1001, New Zealand 21 Wylie,S.J., Nouri,S., Coutts,B.A and Jones,M.G (2010) Narcissus late season yellows virus and Vallota speciosa virus found infecting domestic and wild populations of Narcissus species in Australia Arch Virol 155 (7), 1171-1174 State Agricultural Biotechnology Centre, Murdoch University, South Street, Perth, WA 6150, Australia Website http://www.fao.org/docrep/T0601E/T0601E0m.htm#Viroid%20purification %20and%20characterization http://www.ictvdb.org/ICTVdB/00.056.0.04.019.htm http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://pvo.bio-mirror.cn/famly079.htm http://www.pacificbulbsociety.org/pbswiki/index.php/Virus Bảng 3.2 Thành phần môi trường MS Ký hiệu DD mẹ Thành phần Số mg/ lít MT ni cấy Đa lượng MS1 MS2 MS3 NH4NO3 1650 KNO3 1900 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 CaCl2.2H2O 440 Vi lượng MnSO4.4H2O 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO2.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Na2EDTA 37,3 FeSO4 7H2O 27,8 Vitamin axit amin MS4 Thiamine HCl 0,1 Nicotinic axit 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glycine 10 Myo-inositol Sucrose (g/l) 100 30 11 ... hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu định danh Potyvirus hại hoa loa kèn 1.2 Mục đích yêu cầu của đê tài 1.2.1 Mục đích • Xác định trình tự gen Potyvirus gây bệnh khảm lá hoa loa kèn... điểm sinh học Potyvirus hại hoa loa kèn 1.2.2 Yêu cầu • Điều tra bệnh virus hoa loa kèn (loa kèn trắng loa kèn đỏ) Hà Nội • Kiểm tra RT-PCR số mẫu hoa loa kèn trắng loa kèn đỏ bị... PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Đối tượng nghiên cứu Potyvirus hại hoa họ loa kèn 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu Trung tâm bệnh nhiệt đới –