QC benh phanden luamy 159

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM QCVN 01 - 159 : 2014/BNNPTNT QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH PHẤN ĐEN LÚA MỲ Tilletia indica Mitra LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM National technical regulation on Procedure for identification of Karnal bunt of wheat (Tilletia indica Mitra) - Plant quarantine pest of Vietnam HÀ NỘI - 2014 QCVN 01 - 159 : 2014/BNNPTNT Lời nói đầu QCVN 01 - 159 : 2014/BNNPTNT Trung tâm Giám định Kiểm dịch thực vật biên soạn, Cục Bảo vệ thực vật trường trình duyệt, Bộ Nơng nghiệp & PTNT ban hành Thông tư số 16 /TT-BNNPTNT ngày 05 tháng năm 2014 QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH PHẤN ĐEN LÚA MỲ Tilletia indica Mitra LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM QCVN 01 - 159 : 2014/BNNPTNT National technical regulation on Procedure for identification of Karnal bunt of wheat (Tilletia indica Mitra) Plant quarantine pest of Vietnam I QUY ĐỊNH CHUNG 1.1 Phạm vi điều chỉnh Quy chuẩn quy định quy trình giám định bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra - dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I Việt Nam 1.2 Đối tượng áp dụng Quy chuẩn áp dụng tổ chức, cá nhân Việt Nam nước ngồi có hoạt động liên quan đến lĩnh vực bảo vệ kiểm dịch thực vật thực giám định bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra - dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) nhóm I thuộc Danh mục dịch hại KDTV Việt Nam 1.3 Giải thích từ ngữ Trong quy chuẩn này, từ ngữ hiểu sau: 1.3.1 Dịch hại kiểm dịch thực vật (plant quarantine pest): Là lồi dịch hại có nguy gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật vùng mà lồi sinh vật chưa xuất xuất có phân bố hẹp phải kiểm sốt thức 1.3.2 Thực vật (plant): Là phận sống, kể hạt giống sinh chất có khả làm giống 1.3.3 Mẫu (sample): Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật tàn dư sản phẩm thực vật lấy theo qui tắc định 1.3.8 Tiêu (specimen): Là mẫu vật điển hình tiêu biểu dịch hại xử lý để dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật trưng bày thành sưu tập 1.3.9 Phản ứng chuỗi trùng hợp phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction - PCR): Là kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo nhiều sao) đoạn DNA mà không cần sử dụng sinh vật sống II QUY ĐỊNH KỸ THUẬT 2.1 Phương pháp thu thập bảo quản mẫu 2.1.1 Thu thập mẫu Đối với hàng xuất, nhập khẩu, cảnh vận chuyển, bảo quản nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731:891 Trường hợp văn viện dẫn quy chuẩn sửa đổi, bổ sung thay thực theo quy định văn QCVN 01 - 159 : 2014/BNNPTNT “Kiểm dịch thực vật - phương pháp lấy mẫu”, quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-23:2010/BNNPTNT1 “Phương pháp kiểm tra loại hạt xuất, nhập cảnh” Đối với trồng đồng ruộng: Lấy mẫu theo Qui chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-38/2010/BNNPTNT1 “Phương pháp điều tra phát dịch hại trồng” 2.1.2 Bảo quản mẫu Các phận tươi (bơng) có triệu chứng bệnh chứa túi nilơng có lỗ thơng khí bảo quản tủ lạnh nhiệt độ - 5°C Mẫu hạt chứa túi ni-lơng hộp nhựa kín bảo quản nhiệt độ phòng Các tiêu lam nấm dán nhãn, để hộp chuyên dụng đựng tiêu lam bảo quản nhiệt độ phòng 2.2 Thiết bị dụng cụ, hố chất Kính lúp soi có độ phóng đại 10 – 40 lần, kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần Lưới lọc (kích thước mắt lưới 53µm, 20µm), bình tam giác, máy ly tâm, máy lắc, tủ sấy, tủ định ôn, cân điện, bể ổn nhiệt,máy PCR, máy điện di, hệ thống chụp ảnh… Bộ dao, kim giải phẫu, panh, kéo, micro pipet Đèn cồn, đĩa petri, ống hút, lam, lamen, cốc đong, giấy parafilm Cồn 70°, lactophenol, acid lactic, nước cất vô trùng, Tween 20, Na2HPO4, KH2PO4, Glycerol, ethylium bromide, agarose, cycloheximide Kít chiết tách DNA, kit PCR 2.3 Phương pháp phát giám định bệnh 2.3.1 Phát thu thập mẫu bệnh Cây nhiễm bệnh thấp hơn, ngắn, số lượng hạt bơng giảm (hình 1, phụ lục 1) Nấm gây bệnh số hạt bông, hạt nhiễm bệnh thường bị lép Ban đầu có chấm đen nhỏ phần nội nhũ rãnh hạt Khi xâm nhiễm hạt, nấm làm cho hạt có mùi (do trimethylamine) tương tự nấm T tritici, T foetida T controversa Hạt bị xâm nhiễm từ phần rốn hạt chạy dọc theo đường rãnh hạt (không gây nhiễm nội nhũ), hạt bị vỡ hồn tồn bị nứt phần (hình 2, phụ lục 1) Khi bệnh nặng, mô dọc theo rãnh hạt vùng tiếp giáp nội nhũ bị thay bào tử Mày hạt bị tách làm cho hạt bị nhiễm bệnh lộ ngoài, hạt phần mày hạt bị rụng khỏi bơng 2.3.2 Phương pháp giám định đặc điểm hình thái nấm gây bệnh 2.3.2.1 Phương pháp kiểm tra trực tiếp Dùng kim khêu nấm khêu lớp bào tử hạt đặt lên lam kính có sẵn giọt axit lactic đậy lamen Đặt lam lên kính hiển vi quan sát đặc điểm hình thái đo kích thước bào tử nấm QCVN 01 - 159 : 2014/BNNPTNT Đối chiếu với hình dạng kích thước bào tử phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra (phụ lục 1) 2.3.2.2 Phương pháp rửa quay ly tâm Lấy 50g hạt lúa mỳ cho vào bình tam giác 250ml Thêm vào bình 100ml dung dịch Tween-20 nồng độ 0,01%, đậy nắp bình (có thể bao kín giấy parafilm) Đặt bình tam giác lên máy lắc lắc tay vòng phút để bào tử rời khỏi hạt lúa mỳ Chuẩn bị bình lọc bao gồm bình tam giác, phễu có lưới lọc kích thước 53µm Đổ dịch hạt lúa mỳ lên phễu bình tam giác chuẩn bị Dùng bình phun nước cất rửa hạt lúa mì lưới lần (mỗi lần dùng 20-50ml nước cất) Tiếp tục rửa hạt lúa mì nước cất đến lượng nước bình đạt từ 300-400ml Bỏ lưới lọc, rửa phễu lọc lần nước cất lần 10-20ml nước Chuẩn bị lọc thứ bao gồm bình tam giác; phễu có đặt lưới lọc 20µm (lưới lọc ngâm nước trước để có hiệu lọc tốt hơn) Rót dịch thu qua lọc chuẩn bị Rửa bình chứa dịch lần 10ml nước cất Nghiêng lưới lọc góc 30-35° rửa nhẹ nhàng lưới lọc nước cất cho phần cặn lại lưới lọc dồn sang bên cạnh lưới lọc Dùng công tơ hút hút dịch cặn lưới lọc vào ống ly tâm Ly tâm dịch thu tốc độ 4000 vòng/phút phút Phần cặn thu sau ly tâm hoà tan lại nước cất để đạt dung tích khoảng 50-100µl Hút dịch lên lam kính, đậy lamen quan sát đo đếm đặc điểm hình thái bào tử nấm gây bệnh kính hiển vi so sánh với đặc điểm bào tử nấm Tilletia indica (phụ lục 1) Lưu ý: Trong trường hợp mẫu hạt qua xử lý hoá chất diệt nấm, hạt phải ngâm NaOH (0,2% 1%) 24 trước rửa, quay ly tâm 2.3.2 Phương pháp giám định PCR Sử dụng phương pháp PCR để giám định nấm gây bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra Quy trình chi tiết phụ lục III THẨM ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO Sau khẳng định kết giám định bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra - dịch hại kiểm dịch thực vật Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết giám định (phụ lục 3) Tất đơn vị thuộc hệ thống Bảo vệ KDTV phải lưu giữ, quản lý khai thác liệu kết điều tra, báo cáo giám định bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra Đối với đơn vị lần giám định phát bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra phải gửi mẫu tiêu Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định QCVN 01 - 159 : 2014/BNNPTNT Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định hành IV TỔ CHỨC THỰC HIỆN Cục Bảo vệ thực vật có trách nhiệm phổ biến; tổ chức, hướng dẫn kiểm tra việc thực Quy chuẩn hệ thống tổ chức chuyên ngành Bảo vệ Kiểm dịch thực vật tổ chức, cá nhân khác có liên quan; Các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến điều tra, thu thập mẫu, xử lý bảo quản mẫu bệnh phấn đen lúa mỳ Việt Nam phải tuân theo quy định quy chuẩn quy định pháp luật có liên quan hành QCVN 01 - 159 : 2014/BNNPTNT Phụ lục Thông tin dịch hại Phân bố ký chủ 1.1.Phân bố Trong nước: Bệnh chưa có Việt Nam Trên giới: Châu Á (Ấn Độ, Afghanistan, Iraq, Nepal, Iran, Pakistan), Châu Phi (Nam Phi), Châu Mỹ (Kenya, Hoa Kì, Mexico) 1.2 Ký chủ: Lúa Mỳ (Triticum aestivum) Ngoài lây nhiễm nhân tạo nấm kí sinh Aegilops spp., Bromus spp., Lolium spp Oryzopsis 2.Tên khoa học vị trí phân loại Tên tiếng Việt : Bệnh phấn đen lúa mỳ Tên khoa học: Tilletia indica Mitra Tên khác: Neovossia indica (Mitra) Mundk Vị trí phân loại: Lớp: Ustilaginomycetes Bộ: Tilletiales Họ: Tilletiaceae Triệu chứng bệnh phấn đen lúa mỳ Hình 1: bơng lúa mì nhiễm bệnh Hình 2: hạt lúa mỳ nhiễm bệnh (Nguồn: CABI, 2012) (Nguồn: CABI, 2012) Đặc điểm hình thái bào tử nấm Tilletia indica Bào tử đông (Teliospore) dạng cầu tới gần cầu, đường kính thơng thường 22-47µm, lớn (35-41µm); Màu sắc từ vàng cam nhạt tới nâu tới nâu đậm, đỏ nâu; số bào tử có màu đen màu đen mờ Gai dày đầu gai nhọn tù, số trường hợp đầu cong, độ dài gai 1,55,0µm Bề mặt gai có dạng vỏ não với rãnh hẹp Các gai bao bọc màng mỏng suốt (hình hình 4) Tế bào bất dục: hình cầu tới gần cầu hình giọt lệ, màu vàng nâu, 10-28x48µm, có khơng có đỉnh nhỏ (gai ngắn), vách tế bào mượt dày khoảng µm tạo phiến QCVN 01 - 159 : 2014/BNNPTNT Hình 3: Bề mặt bào tử T indica (Nguồn: EPPO, 2012) Hình 4: Bào tử T indica quan sát điểm (Nguồn: EPPO, 2012) Phân biệt với số nấm Tilletia khác Bào tử đông T indica bị nhầm lẫn số loài Tilletia lẫn tạp hạt lúa mỳ như: T walkeri (hình 5) T horrida (hình 6) phân biệt sau T horrida T walkeri T indica Kích thước bào