LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN HÔ HẤP (PRRS) TRÊN HEO GIAI ĐOẠN 2003 – 2007 VÀ THỬ NGHIỆM VẮC XIN PHÒNG BỆNH NÀY TẠI TP. HỒ CHÍ MINH VÀ VÙNG LÂN CẬN

MỤC LỤC Trang Phụ bìa Cam đoan ii Lời cảm tạ iii Mục lục ………………………………………………………………………. iv Danh mục bảng……………………………………………………………….. viii Danh mục hình……………………………………………………………….. x Danh mục biểu đồ …………………………………………………………… xii Danh mục chữ viết tắt ……………………………………………………….. xiii Phụ lục xiv Tóm tắt……………………………………………………………………….. xv MỞ ĐẦU……………………………………………………………………… 1 1. Đặt vấn đề………………………………………………………………. 1 2. Mục tiêu của đề tài…………………………………………………….. 2 3. Những đóng góp mới về khoa học……………………………………... 3 Chương 1 TỔNG QUAN ……………………………………………………. 4 1.1 Lịch sử phát hiện bệnh PRRS………………………………………….. 4 1.2 Tác nhân gây bệnh…………………………………………………….. 6 1.2.1 Phân loại…………………………………………………………… 6 1.2.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc …………………………………… 6 1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy và sự nhân lên của vi rút PRRS……………….. 8 1.2.4 Sức đề kháng ………………………………………………………. 10 1.3 Dịch tễ bệnh PRRS…………………………………………………….. 11 1.3.1 Phân bố địa lý……………………………………………………… 11 1.3.2 Loài vật mắc bệnh …………………………………………………. 13 1.3.3 Phương thức truyền lây và tuổi nhiễm …………………………….. 13 1.4 Sinh bệnh và miễn dịch………………………………………………… 14 1.4.1 Sinh bệnh ………………………………………………………….. 14 1.4.2 Miễn dịch đối với vi rút PRRS…………………………………….. 16 v 1.5 Triệu chứng và bệnh tích ……………………………………………… 18 1.5.1 Triệu chứng………………………………………………………… 18 1.5.2 Bệnh tích …………………………………………………………... 22 1.6 Các phương pháp chẩn đoán bệnh…………………………………….. 24 1.6.1 Phương pháp phát hiện vi rút ……………………………………… 25 1.6.2 Phương pháp huyết thanh học phát hiện kháng thể ………………. 27 1.7 Phòng và kiểm soát bệnh……………………………………………….. 31 1.7.1 Phòng bệnh…………………………………………………………. 31 1.7.2 Kiểm soát bệnh……………………………………………………. 33 1.8 Một số nghiên cứu về mức độ nhiễm PRRS và sử dụng vắc xin……… 34 1.8.1 Trên thế giới ………………………………………………………. 34 1.8.2 Tại Việt Nam……………………………………………………..... 36 Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………… 37 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu……………………………………… 37 2.2 Nội dung nghiên cứu…………………………………………………… 37 2.3 Đối tượng nghiên cứu và vật liệu xét nghiệm………………………….. 38 2.3.1 Đối tượng ………………………………………………………….. 38 2.3.2 Mẫu vật nghiên cứu………………………………………………… 38 2.3.3 Vật liệu xét nghiệm………………………………………………… 38 2.3.3.1 Bộ kit xét nghiệm kháng thể …………………………………. 38 2.3.3.2 Vật liệu trong phân lập vi rút PRRS…………………………. 38 2.3.3.3 Hóa chất trong kỹ thuật RTPCR……………………………… 39 2.3.4 Dụng cụ thiệt bị…………………………………………………….. 39 2.3.4.1 Dụng cụ……………………………………………………….. 39 2.3.4.2 Thiết bị ……………………………………………………….. 39 2.4 Phương pháp nghiên cứu………………………………………………… 40 2.4.1 Điều tra tình hình nhiễm vi rút PRRS trên heo dựa vào phát hiện kháng thể …………………………………………………………….. 40 2.4.2 Xác định mối liên hệ giữa tình trạng huyết thanh dương tính PRRS và năng suất sinh sản của heo nái …………………………………... 44 vi 2.4.3 Khảo sát sự biến động kháng thể thụ động do mẹ truyền và tăng trưởng ở heo con khi heo nái có huyết thanh dương tính PRRS…. 46 2.4.4 Phân lập vi rút trên các hạng heo……………………………………. 47 2.4.5 Đánh giá đáp ứng của heo khi tiêm vắc xin phòng PRRS…………. 52 2.5 Công thức tính các chỉ tiêu và xử lý số liệu…………………………….. 54 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………… 57 3.1 Điều tra tình hình nhiễm vi rút PRRS trên heo dựa vào phát hiện kháng thể ……………………………………………………………… 57 3.1.1 Tỷ lệ nhiễm vi rút PRRS trên heo …………………………………. 57 3.1.1.1 Phân bố tỷ lệ nhiễm theo loại hình chăn nuôi và hạng heo……. 59 3.1.1.2 Phân tích tỷ lệ nhiễm theo lứa đẻ và giống heo………………... 61 3.1.2 Phân bố các dòng vi rút PRRS nhiễm trên heo…………………….. 64 3.2 Mối liên hệ giữa mức huyết thanh dương tính PRRS với khả năng sinh sản của heo nái …………………………………………………… 66 3.2.1 Tỷ lệ huyết thanh dương tính PRRS trên nái khảo sát……………. 66 3.2.2 Năng suất sinh sản của nái ………………………………………… 67 3.2.2.1 Số heo con trên ổ của nái dương tính và âm tính PRRS………. 67 3.2.2.2 Tần suất rối loạn sinh sản ở nái khảo sát……………………… 70 3.3 Sự biến động kháng thể thụ động do mẹ truyền và tăng trưởng ở heo con khi heo mẹ dương tính với vi rút PRRS………………………. 73 3.3.1 Biến động kháng thể của heo con từ heo nái dương tính PRRS ở 2 trại ……………………………………………………………… 74 3.3.2 Tỷ lệ ho của đàn heo con ở 2 trại…………………………………… 85 3.3.3 Tăng trọng đàn con ở 2 trại ………………………………………… 86 3.4 Tần suất phân lập vi rút PRRS trên các hạng heo………………………. 87 3.4.1 Đặc điểm bệnh tích trên tế bào MARC145 và kết quả phân lập vi rút theo hạng heo…………………………………………………. 88 3.4.2 Loại mẫu phân lập được vi rút PRRS……………………………….. 92 3.5 Đáp ứng của heo khi tiêm vắc xin phòng PRRS……………………….. 93 3.5.1 Đáp ứng đối với vắc xin trên heo tăng trưởng thương phẩm ………. 93 vii 3.5.1.1 Tỷ lệ huyết thanh dương tính trên heo sau tiêm vắc xin ………… 93 3.5.1.2 Tỷ lệ bệnh đường hô hấp………………………………………… 96 3.5.1.3 Tăng trọng bình quân và hệ số chuyển hóa thức ăn …………….. 97 3.5.1.4 Nhận xét bệnh tích phổi…………………………………………. 98 3.5.2 Mức kháng thể trên heo nái sau tiêm vắc xin PRRS ………………... 99 Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ……………………………………… 102 4.1 Kết luận…………………………………………………………………... 102 4.2 Đề nghị………………………………………………………………….. 103 Các công trình có liên quan đến luận án đã công bố ……………………… 104 Tài liệu tham khảo …………………………………………………………... 105 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bệnh phẩm dùng cho các phương pháp chẩn đoán bệnh PRRS…... 30 Bảng 2.1 Phân bố mẫu khảo sát tỷ lệ huyết thanh dương tính và dòng vi rút PRRS bằng ELISA…………………………………………... 41 Bảng 2.2 Phân bố nái khảo sát năng suất theo lứa đẻ và giống……………… 45 Bảng 2.3 Phân bố mẫu phân lập vi rút PRRS………………………………… 48 Bảng 2.4 Trình tự đoạn mồi phát hiện vi rút PRRS………………………….. 49 Bảng 2.5 Số mẫu khảo sát trong thí nghiệm đánh giá đáp ứng của heo tăng trưởng khi tiêm vắc xin phòng bệnh PRRS ……………………… 53 Bảng 2.6 Số heo con sơ sinh còn sống điều chỉnh theo lứa (NSIF, 2004)…... 56 Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm vi rút PRRS trên heo theo địa điểm khảo sát………… 57 Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm vi rút PRRS trên heo theo loại hình chăn nuôi ở 2 địa điểm…………………………………………………………… 59 Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm vi rút PRRS theo hạng heo…………………………… 60 Bảng 3.4 Tỷ lệ nhiễm vi rút PRRS theo lứa đẻ………………………………. 62 Bảng 3.5 Tỷ lệ nhiễm vi rút PRRS trên heo sinh sản theo giống…………….. 63 Bảng 3.6 Phân bố các dòng vi rút PRRS nhiễm trên heo……………………. 64 Bảng 3.7 Tỷ lệ huyết thanh dương tính PRRS trên heo nái ở 2 trại khảo sát .. 66 Bảng 3.8 Phân bố nhóm nái theo các mức kháng thể (tỷ số SP) ở nái dương tính …………………………………………………………. 67 Bảng 3.9 Số heo con trên ổ của nái dương tính và âm tính PRRS…………… 68 Bảng 3.10 Số heo con trên ổ của nái dương tính ở các mức kháng thể ……… 69 Bảng 3.11 Tỷ lệ sinh sớm trên nái từ lứa 1 đến lứa khảo sát…………………. 70 Bảng 3.12 Tỷ lệ thai chết và heo con yếu của nái dương và âm tính với PRRS. 71 Bảng 3.13 Hệ số tương quan giữa mức kháng thể PRRS (SP) của heo nái dương tính và một số chỉ tiêu sinh sản…………………………….. 72 Bảng 3.14 Mức kháng thể (tỷ số SP) của nái trên 2 lô khảo sát ở 2 trại……… 74 Bảng 3.15 Sự biến động tỷ số SP trên đàn con của nái dương tính ở trại 1…... 75 ix Bảng 3.16 Hệ số tương quan giữa mức kháng thể của heo mẹ dương tính 3 ngày sau sinh và đàn con tại trại 1…………………………………. 77 Bảng 3.17 Biến động kháng thể của heo con từ những nái dương tính trại 2… 80 Bảng 3.18 Tỷ lệ ho và thở bụng của đàn con ở 2 trại ………………………… 85 Bảng 3.19 Tăng trọng và tiêu tốn thức ăn giai đoạn sơ sinh đến 2 tháng tuổi… 86 Bảng 3.20 Kết quả phân lập vi rút PRRS theo hạng heo……………………… 89 Bảng 3.21 Kết quả phân lập vi rút PRRS theo loại mẫu trên heo cai sữa …… 92 Bảng 3.22 Tỷ lệ huyết thanh dương tính và tỷ số trung bình SP tại các thời điểm trước và sau tiêm vắc xin ở 2 lô……………………………… 94 Bảng 3.23 Tỷ lệ ho và thở bụng theo từng giai đoạn khảo sát ……………….. 97 Bảng 3.24 Tăng trọng của heo và tiêu tốn thức ăn…………………………….. 98 Bảng 3.25 Tỷ số SP và tỷ lệ huyết thanh dương tính của heo nái trước và sau tiêm vắc xin ………………………………………………………... 100 x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phát hiện các ổ dịch PRRS tại Việt Nam (2007)………………… 5 Hình 1.2 Mô hình cấu trúc vi rút PRRS …………………………………… 7 Hình 1.3 Mô hình cấu trúc gen của vi rút PRRS ………………………….. 8 Hình 1.4 Mô hình chu trình nhân lên của vi rút PRRS trong tế bào……… 9 Hình 1.5 Bệnh tích tế bào do vi rút PRRS trên MARC145………………. 10 Hình 1.6 Bản đồ phân bố bệnh PRRS trên thế giới……………………….. 12 Hình 1.7 Triệu chứng sẩy thai và sinh sớm trên nái nhiễm vi rút PRRS………………………………………………………. 19 Hình 1.8 Triệu chứng trên heo con nhiễm vi rút PRRS…………………… 20 Hình 1.9 Triệu chứng heo cai sữa nhiễm vi rút PRRS…………………….. 21 Hình 1.10 Hạch lâm ba sưng to……………………………………………… 22 Hình 1.11 Phổi viêm kẽ và phù do nhiễm kết hợp PRRS và Circovirus…… 23 Hình 1.12 Bệnh tích đại thể phổi và hạch lâm ba xuất huyết ở heo nhiễm PRRS …………………………………………………………….. 23 Hình 1.13 Bệnh tích trên thai từ nái đẻ nhiễm PRRS ………………………. 24 Hình 1.14 Hóa mô miễn dịch dùng immunoperoxidase trên mẫu phổi heo nhiễm vi rút PRRS……………………………………………….. 25 Hình 1.15 Miễn dịch huỳnh quang trên đại thực bào………………………. 25 Hình 2.1 Chuồng trại của 2 loại hình chăn nuôi…………………………… 41 Hình 2.2 Kết quả phát hiện kháng thể kháng vi rút PRRS ………………… 43 Hình 2.3 Kết quả phát hiện kháng thể kháng vi rút PRRS dòng châu Âu hoặc Bắc Mỹ……………………………………………. 44 Hình 3.1 Tế bào MARC145 sau 3 ngày nuôi cấy ………………………… 90 Hình 3.2 Tế bào MARC145 sau 5 ngày nuôi cấy ………………………… 90 Hình 3.3 Tế bào MARC145 sau 7 ngày nuôi cấy ………………………… 91 Hình 3.4 Bệnh tích cụm tế bào trên MARC145…………………………… 91 xi Hình 3.5 Kết quả phát hiện vi rút PRRS trong dịch tế bào bằng RTPCR…………………………………………………………... 91 Hình 3.6 Bệnh tích phổi heo lô tiêm vắc xin ……………………………… 98 Hình 3.7 Bệnh tích phổi heo lô không tiêm vắc xin………………………. 99 xii DANH MỤC SƠ ĐỒ BIỂU ĐỒ Sơ đồ 1.1 Sơ đồ cách sinh bệnh của vi rút PRRS………………………… 15 Sơ đồ 2.1 Phân lập và giám định sự hiện diện vi rút PRRS……………… 50 Sơ đồ 2.2 RTPCR phát hiện vi rút PRRS từ dịch tế bào………………… 51 Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ nhiễm PRRS trên 4 hạng heo ở 2 loại hình chăn nuôi……………………………………………………… 61 Biểu đồ 3.2 Phân bố dòng vi rút nhiễm trên heo ở 5 trại heo ……………… 65 Biểu đồ 3.3 Đồ thị tuyến tính giữa mức kháng thể PRRS ở heo nái và tỷ lệ heo con sơ sinh chọn nuôi…………………………………….. 73 Biểu đồ 3.4 Diễn biến của mức kháng thể trung bình (SP) các đàn heo con ở lô nái dương tính PRRS trại 1……………………………….. 76 Biểu đồ 3.5 Tỷ lệ huyết thanh dương tính của đàn con ở 2 lô tại trại 1…… 78 Biểu đồ 3.6 Diễn biến của mức kháng thể trung bình trên heo con có huyết thanh dương tính PRRS từ 5 ngày tuổi ở nái dương tính trại 1... 79 Biểu đồ 3.7 Diễn biến mức kháng thể trung bình (SP) của các đàn heo con ở lô nái dương tính PRRS trại 2……………………………….. 81 Biểu đồ 3.8 Tỷ lệ dương tính của đàn con ở hai lô tại trại 2………………. 82 Biểu đồ 3.9 Diễn biến của mức kháng thể trung bình trên heo con có huyết thanh dương tính PRRS từ 21 ngày tuổi ở nái dương tính trại 2. 82 Biểu đồ 3.10 Đồ thị dự đoán tỷ số SP theo tuổi của những heo con có kháng thể âm tính từ 21 ngày tuổi…………………………………….. 84 Biểu đồ 3.11 Tỷ lệ huyết thanh dương tính của 2 lô thí nghiệm……………. 95 Biểu đồ 3.12 Tỷ số SP trung bình của các mẫu huyết thanh dương tính ở 2 lô thí nghiệm…………………………………........................... 95 xiii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT NGUYÊN CHỮ NGHĨA TIẾNG VIỆT Ctv Cộng tác viên CPE Cytopathic effect Bệnh tích tế bào ELISA Enzyme linked immunosorbent assay Phản ứng miễn dịch gắn men FA Fluorescent antibody Kháng thể huỳnh quang IHC Immunohistochemistry staining Nhuộm hóa mô miễn dịch IPMA Immunoperoxydase monolayer assay Phương pháp miễn dịch tế bào một lớp với peroxydase IRPC Relative index percent Chỉ số tương đối (%) MH Mycoplasma hyopneumoniae Vi sinh vật gây bệnh suyễn heo NHC Normal host cells Tế bào bình thường của vật chủ SVN Serum virus neutralization Trung hòa vi rút NSP Nonstructural proteins Protein không cấu trúc Odn Optical density of negative sample Mật độ quang mẫu âm tính Odp Optical density of positive sample Mật độ quang mẫu dương tính OIE Office international des épizooties Tổ chức dịch tễ động vật Quốc tế PAM Porcine alveolar macrophage Đại thực bào phế nang heo PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo RFLP Restriction fragment length polymorphism Kỹ thuật cắt phân đoạn đa hình RTPCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction Phản ứng nhân chuỗi gen sao chép ngược SP Sample positive Mẫu xét nghiệm dương tính chuẩn TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh xiv PHỤ LỤC Phụ lục 1 Bảng phân bố mẫu xét nghiệm…………………………………… 132 Phụ lục 2 Giới thiệu tổng quát về 2 trại heo khảo sát năng suất sinh sản…. 133 Phụ lục 3 Môi trường nuôi cấy tế bào………………………………………. 135 Phụ lục 4 Một số vắc xin đang có ở Việt Nam……………………………… 138 Phụ lục 5 Kết quả tỷ số SP và tỷ lệ tiêu chảy trên heo tiêm vắc xin PRRS… 141 Phụ lục 6 Chấm điểm bệnh tích phổi………………………………………... 142 Phụ lục 7 Phân tích thống kê………………………………………………... 143 xv TÓM TẮT PRRS là bệnh truyền nhiễm của heo do vi rút gây ra. Mặc dù vi rút PRRS đã được xác định gần 20 năm nhưng các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh chưa đem lại hiệu quả cao. Do vi rút PRRS có 2 dòng và nhiều chủng, tính biến đổi gen và động lực cao, nên ảnh hưởng của bệnh này trên heo khá phức tạp ở nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam. Với mục đích xác định phân bố của dòng nhiễm và hiện diện vi rút PRRS trên heo, cũng như tìm hiểu lứa tuổi heo con có nguy cơ nhiễm bệnh và đáp ứng của heo với vắc xin phòng bệnh, đề tài “Đặc điểm dịch tễ của hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) trên heo giai đoạn từ năm 2003 – 2007 và thử nghiệm vắc xin phòng bệnh này Tp. Hồ Chí Minh và vùng lân cận”, được thực hiện tại TP. Hồ Chí Minh và Đồng Nai (vùng lân cận TP.HCM) từ năm 2003 đến 3 tháng đầu năm 2007. Qua các phương pháp điều tra cắt ngang, xét nghiệm chẩn đoán và thử nghiệm vắc xin, chúng tôi ghi nhận được các kết quả sau: Trong tổng số 1082 mẫu huyết thanh heo từ 5 trại chăn nuôi tập trung và 21 hộ chăn nuôi (nuôi từ 10 nái hoặc 10 heo thịt trở lên), có 398 mẫu dương tính với kháng thể kháng vi rút PRRS bằng kỹ thuật ELISA, chiếm tỷ lệ 36,78%. Tỷ lệ nhiễm cao nhất trên heo hậu bị và heo thịt (51,24%, 49,25%), kế đến là heo nái và heo đực (27,29%, 26,82%), và thấp nhất là tỷ lệ nhiễm trên heo cai sữa (16,66%). Tại TP. HCM, tỷ lệ heo có huyết thanh dương tính ở trại chăn nuôi tập trung cao hơn heo ở hộ chăn nuôi gia đình (36,60% so với 13,98%). Sử dụng bộ kit của Hipra (Tây Ban Nha) kiểm tra kháng thể kháng vi rút dòng Bắc Mỹ và dòng châu Âu của 140 mẫu huyết thanh dương tinh với kit IDEXX (Mỹ), từ đó xác định dòng vi rút nhiễm trên heo của 5 trại chăn nuôi tập trung. Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm dòng Bắc Mỹ là phổ biến ở cả 5 trại (62,14%), trong đó 4 trại nhiễm cả 2 dòng vi rút. Dựa trên phiếu theo dõi cá thể từ lứa 1 đến lứa đẻ khảo sát, thu thập năng suất sinh sản của heo nái kết hợp với kết quả xét nghiệm ELISA (IDEXX, Mỹ) để đánh giá sự thay đổi của một số chỉ tiêu giữa 2 nhóm nái dương tính và âm tính với PRRS. Kết quả ghi nhận tỷ lệ thai chết lưu và heo con yếu ở nhóm nái dương tính cao hơn khi xvi mức SP của nái đạt từ 0,8 trở lên; có mối tương quan ở mức độ vừa giữa mức kháng thể của nái dương tính và các chỉ tiêu về tỷ lệ heo con sơ sinh chọn nuôi và số thai chết lưu. Kết quả khảo sát kháng thể thụ động mẹ truyền bằng kỹ thuật ELISA (IDEXX Mỹ) cho thấy kháng thể thụ động của heo con từ heo nái dương tính ( tỷ số SP = 0,43 đến 1,13), sẽ giảm dần tới mức âm tính khi heo con được 19 ngày tuổi. Mô hình hồi quy hỗn hợp dự đoán heo có thể nhiễm vi rút PRRS và huyết thanh trở nên dương tính khi heo khoảng 37 đến 47 ngày tuổi. Trên dòng tế bào MARC145, tiến hành phân lập vi rút PRRS từ các loại mẫu huyết thanh, hạch phổi, phổi và hạch amidan của heo cai sữa có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ bệnh PRRS (heo sốt, ho), tỷ lệ phân lập được vi rút PRRS là 11,76% (434 mẫu). Bốn chủng vi rút phân lập được đều thuộc dòng vi rút Bắc Mỹ và gây bệnh tích cho dòng tế bào MARC145. Tiêm vắc xin nhược độc dòng Bắc Mỹ (Bestar, Singapore) cho heo tăng trưởng thương phẩm khi trại đã nhiễm vi rút PRRS, bước đầu ghi nhận heo đã có đáp ứng với vắc xin phòng. Tỷ lệ huyết thanh dương tính ở lô heo được chủng cao hơn lô heo không chủng vắc xin. Các biểu hiện bệnh đường hô hấp và tăng trọng bình quân của heo cũng được cải thiện hơn so với những heo không chủng vắc xin. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy dòng vi rút Bắc Mỹ nhiễm phổ biến trên heo trong sự hiện diện của cả 2 dòng vi rút PRRS, lứa tuổi heo có nguy cơ nhiễm bệnh khá sớm và đáp ứng của heo với vắc xin phòng bệnh, làm sáng tỏ hơn tính chất dịch tễ trong giai đọan đầu của dịch bệnh PRRS tại TP. HCM và vùng lân cận thuộc Đồng Nai. 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (porcine reproductive and respiratory syndrome–PRRS) là bệnh truyền nhiễm ở heo do vi rút thuộc họ Arteriviridae gây ra. Bệnh được phát hiện đầu tiên ở Mỹ vào năm 1987. Hiện nay bệnh có mặt ở hầu hết các nước trên thế giới và là mối quan tâm của các nhà chăn nuôi cũng như những người nghiên cứu bệnh heo ở nhiều quốc gia. Theo ước tính tại Mỹ hàng năm bệnh làm thiệt hại kinh tế khoảng 560 triệu đôla (Neumann và ctv., 2005) 128. Bệnh gây ra những triệu chứng rối loạn sinh sản trên heo nái như tăng tỷ lệ đẻ sớm, giảm tỷ lệ đẻ, tăng số heo con sinh ra bất thường (heo hoá gỗ, chết thai, heo yếu), số heo con còn sống và cai sữa thấp (Meredith, 1995 115; Christianson và Joo, 1994 40) và bệnh hô hấp trên heo mọi lứa tuổi. Tuy nhiên, heo nái có đáp ứng miễn dịch sau khi nhiễm hoặc được tiêm vắc xin có thể truyền kháng thể thụ động cho heo con. Vi rút PRRS có 2 kiểu gen (Nelsen và ctv., 1999 127) và có nhiều chủng trong cùng kiểu gen (Adreyev và ctv., 1997 14; Forsberg và ctv., 2002 67), với mức độ khác nhau về độc lực nên thiệt hại do bệnh gây ra không giống nhau giữa các vùng. Các nghiên cứu của Pesch (2005) và Mateu (2006), dẫn liệu của Zimmerman, 2006 201 đã chúng minh sự khác nhau giữa các dòng và chủng vi rút PRRS có liên quan đến khả năng bảo vệ chéo, hiệu quả vắc xin và phương thức chẩn đoán bệnh. Ở nước ta, lần đầu tiên đã phát hiện các mẫu huyết thanh dương tính trên đàn heo nhập từ Mỹ vào năm 1997. Kết quả khảo sát của Nguyễn Lương Hiền và 2 ctv. (2000) 6 đã xác định tỷ lệ huyết thanh dương tính với PRRS trên heo của Thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long lần lượt là 1,3 % – 62,19 %. Đầu năm 2007, PRRS xuất hiện thành dịch ở một số tỉnh thành phía Bắc làm số heo chết và tiêu hủy do bệnh lên tới trên 15 ngàn con (tỷ lệ chết khoảng 23%). Vì mức độ ảnh hưởng của bệnh đối với sự phát triển của chăn nuôi heo nói riêng và xã hội nói chung, bệnh do vi rút PRRS chính thức được bổ sung vào danh mục những bệnh phải công bố dịch (theo quyết định số 10372007QĐBNN của Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn) 1. Thành phố Hồ Chí Minh và Đồng Nai là những vùng có nền chăn nuôi heo khá phát triển của khu vực Miền Đông Nam Bộ, nhằm vừa cung cấp con giống cho các tỉnh thành Miền Nam, vừa cung cấp thực phẩm cho trên 8 triệu dân của Thành phố. Theo Tổng cục thống kê Việt Nam năm 2005 8, tổng số đầu heo của TP.HCM và Đồng Nai là 1.375.623 con (riêng TP.HCM có 235.623 con). Với tổng đàn heo như vậy, nếu không kiểm soát chặt chẽ, nguy cơ xuất hiện dịch bệnh PRRS trên đàn heo nuôi là rất lớn và mức độ thiệt hại không thể dự báo được. Một số nghiên cứu đã báo cáo tại Việt Nam của Nguyễn Hữu Lai và ctv., 2008; Nguyễn Ngọc Hải và ctv., 2010, chỉ khảo sát một số chủng vi rút hoặc dùng kỹ thuật sinh học phân tử PCR xác định trình tự gen của vi rút mà chưa có những nghiên cứu mang tính hệ thống về bệnh cũng như kết quả thử nghiệm vắc xin phòng bệnh này. Do đó, xác định đặc điểm dịch tễ, phát hiện tác nhân gây bệnh cũng như thử nghiệm vắc xin làm cơ sở kiểm soát khống chế bệnh cho đàn heo nuôi ở TP.HCM và Đồng Nai là cần thiết, đặc biệt đối với dịch bệnh PRRS, nhằm đảm bảo tính ổn định cho việc phát triển kinh tế xã hội. Để đóng góp một số thông tin về tình hình bệnh PRRS trong các năm 2003 đến 3 tháng đầu năm 2007, chúng tôi thực hiện đề tài: ”Đặc điểm dịch tễ của hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) trên heo giai đoạn 2003 – 2007 và thử nghiệm vắc xin phòng bệnh này tại Tp. Hồ Chí Minh và vùng lân cận”. 3 2. Mục tiêu của đề tài Xác định phân bố của tỷ lệ nhiễm, dòng vi rút và lứa tuổi heo có nguy cơ nhiễm bệnh cũng như nhận xét bước đầu về đáp ứng miễn dịch của heo với vắc xin phòng bệnh, góp phần nâng cao hiệu quả trong công tác phòng và kiểm soát PRRS trên heo. 3. Những đóng góp mới về khoa học Đề tài nghiên cứu đầu tiên cho thấy mối liên quan giữa một số đặc điểm dịch tễ của bệnh đến mức độ mắc bệnh và sự thay đổi về năng suất sinh sản của nái khi nhiễm ở giai đoạn đầu, đã phân lập và giám định vi rút PRRS. Đánh giá được mức độ và thời gian tồn tại của kháng thể thụ động của heo con để xác định được lứa tuổi có nguy cơ bắt đầu nhiễm bệnh. 4 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử phát hiện bệnh PRRS Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (Porcine reproductive and respiratory syndrome PRRS) ghi nhận được đầu tiên tại Mỹ năm 1987 và lây lan nhanh chóng khắp vùng Bắc Mỹ (Keffaber, 1989 89; Hill, 1990 81. Năm 1990 ổ dịch đầu tiên ở châu Âu được thông báo tại Đức và từ đây bệnh lan nhanh các vùng khác thuộc châu lục này (Meredith, 1995 115). Ở Hà Lan, ổ dịch đầu tiên nổ ra trong các bầy heo giống vào đầu năm 1991 và một tháng sau, bệnh đã nổ ra ở hầu hết các tỉnh có mật độ trại chăn nuôi heo nhiều. Tại châu Á, kháng thể kháng vi rút PRRS được phát hiện từ những mẫu huyết thanh nhập vào Nam Triều Tiên năm 1985 (Shin và ctv., 1993) 164, nhưng trận dịch PRRS đầu tiên xảy ra ở Nhật năm 1988 (Hirose và ctv., 1995) 82 và Đài Loan năm 1991 (Chang và ctv., 1993) 33. Như vậy, trong thời gian khoảng vài năm, dịch bệnh PRRS đã xảy ra ở hầu hết các vùng sản xuất heo chính trên thế giới. Wensvoort và ctv. (1991) 184 lần đầu tiên phân lập được nguyên nhân gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo ở châu Âu bằng việc nuôi cấy trên môi trường đại thực bào phế nang heo và đặt tên virus Lelystad (LV). Tại Mỹ, Collins và ctv. (1992) 31 xác định nguyên nhân gây bệnh này trên heo do dòng vi rút VR2332 khi phân lập trên tế bào MA 104 và CL 2621. Tên bệnh “Mystery swine diseasebệnh bí ẩn trên heo” trở nên thông dụng khi chưa xác định được căn bệnh (Roberts, 2001153; Keffaber, 1989 89). Có rất nhiều tên khác được sử dụng khi bệnh này mới xảy ra như: bệnh bí ẩn trên heo 89, hội chứng hô hấp và vô sinh trên heo (Hill, 1990 81), hội chứng hô hấp và dịch sẩy thai trên heo (Terpstra và ctv., 1991176), bệnh heo tai xanh (White, 1991 187). Tuy nhiên, hiện nay hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo là tên được sử dụng 5 chính thức cho bệnh này theo quyết định của Tổ chức dịch tễ động vật Quốc tế (OIE) tháng 51992. Tại Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn heo nhập từ Mỹ (1051 heo xét nghiệm có huyết thanh dương tính). Kết quả điều tra của Nguyễn Lương Hiền và cộng sự (2000) 6 cho thấy tỷ lệ huyết thanh dương tính PRRS trên heo biến động từ 1,3% đến 62,29 %. Sau 10 năm, dịch bệnh PRRS nổ ra đầu tiên trên heo tại tỉnh Hải Dương và lan nhanh sang các tỉnh khác thuộc đồng bằng Sông Hồng, các tỉnh miền Trung và một số tỉnh ở miền Nam; đã có 26 tỉnh, thành thuộc 3 miền trong cả nước có dịch bệnh PRRS trên heo; trên 70 ngàn heo mắc bệnh, số heo chết và tiêu hủy trên 17 ngàn con (Cục Thú Y, 2007). Ba năm sau bệnh lại nổ ra tại 12 tỉnh thành miền Bắc và miền Trung, số heo bệnh lên tới 39.826 con, trong đó 16.230 heo bị chết và tiêu huỷ. Hiện nay, dịch bệnh lại xuất hiện ở 13 tỉnh thành phố trong cả nước. Tổng cộng có 41.016 con heo mắc bệnh, trong đó 30.738 con heo đã chết và tiêu hủy (Quang Duẩn, 2010) 7. Hình 1.1 Phát hiện các ổ dịch PRRS tại Việt Nam (2007) 6 1.2 Tác nhân gây bệnh 1.2.1 Phân loại Vi rút PRRS được xếp vào họ Arteriviridae, cùng với các thành viên của họ Coronaviridae thuộc bộ Nidovirales (Caranagh, 1997 27). Các vi rút thuộc họ này như vi rút PRRS, vi rút viêm động mạch ở ngựa (Equine Arterivirus EAV), vi rút gây tăng men của lactate (Lactate dehydrogenelevating virus – LVD) và vi rút gây sốt xuất huyết ở khỉ (Simian hemorrhagic fever virus –SHFV) đều mang các đặc tính: gây nhiễm trùng dai dẳng mà không có biểu hiện triệu chứng và thường gây chết, nhân lên trong các đại thực bào, và khả năng biến đổi gen rất lớn (Pringle, 1996 132). Hiện nay vi rút có 2 kiểu gen (dòng) (Wensvoort và ctv., 1992 185; Mardassi và ctv., 1994 106; Meng và ctv., 1995 114; Suaez và ctv., 1996 171) và nhiều chủng. Các chủng vi rút châu Âu thuộc dòng 1 và các chủng vi rút Bắc Mỹ là dòng 2. Sự biến đổi kháng nguyên dễ dàng nhận biết bằng kháng thể đơn hoặc đa dòng giữa các chủng Bắc Mỹ và châu Âu (Hill, 1990 81; Keffaber, 1989 89; Mardassi và ctv., 1994 106. Ngoài ra, mức độ tương đồng về nucleotit của hai dòng này chỉ giống nhau khoảng 67% (Mardassi và ctv., 1994 106; Meng và ctv., 1995 114). 1.2.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc Vi rút dạng hình cầu có vỏ, kích thước khoảng 4060 nm. Cấu trúc di truyền là một chuỗi ARN đơn dương được bao bọc bởi capxit kích thước 2535nm. Vỏ của vi rút trơn láng, bao gồm hai lớp màng lipit. Trình tự gen của các dòng vi rút PRRS (Collins và ctv., 1991 30; Dee và ctv., 1996 47) tương tự các vi rút khác trong cùng một giống Arterivirus. Bộ gen của vi rút PRRS có chiều dài gần 15 kb và chứa 8 khung đọc mở (open reading frame, ORF) (Conzelman và ctv., 1993 42; Meulenberg và ctv., 1993 118; 1996 119; Murtaugh và ctv., 1995 124; Shen và ctv., 2000 161; Wootton và ctv., 2000 189). Tuy nhiên, những nghiên cứu của Collins và ctv., 1991 30; Dee và ctv., 1996 47, Stadejek và ctv., 2002 167 đã 7 xác định 9 ORF do có 2 loại ORF 2 (ORF 2a và ORF 2b) (hình 1.3). ORF 1a và 1b chiếm gần 80% gen và mã hóa cho enzym RNAdependent RNA polymerase, đây là một enzym sao chép (replicase). ORF 1a và ORF 1b mã hóa các polyprotein để hình thành các protein không cấu trúc. Có khoảng 12 protein không cấu trúc được tạo ra từ ORF1. Vẫn còn ít hiểu biết về chức năng của mỗi loại protein không cấu trúc. Tuy nhiên, thông báo mới của Kwon và ctv., 2008 96 cho thấy một gen quan trọng quyết định độc lực của vi rút PRRS được định vị trong vùng ORF1a. Hình 1.2 Mô hình cấu trúc vi rút PRRS (Thiry, 2004) 181 Những gen mã hóa protein cấu trúc của vi rút PRRS định vị tại đầu 3’ và chiếm 20% còn lại của gen, bao gồm gen mã hóa protein E của vỏ (25kD), protein màng M (19kD), protein N của nucleocapsit (15kD), và các glycoprotein (GP) khác được mã hóa bởi các khung tín hiệu mở (ORF 2, 2a ; ORF 3 và ORF 4). Dựa vào chuỗi gen, người ta thấy trình tự ORF 5 (mã hóa protein E) của 2 dòng vi rút có sự khác biệt lớn nhất. Do đó, protein E được sử dụng để phân biệt các chủng vi rút PRRS (Dea và ctv., 2000) 48. Ngoài ra, các quyết định kháng nguyên (epitop) gây đáp ứng kháng thể trung hòa và đóng vai trò quan trọng trong sự nhận diện thụ thể trên tế bào đích đã được Suarez và ctv. (1996) 170, Nathalie và ctv. (2003) 126 chứng minh. 8 Protein M (ORF 6) có tính kháng nguyên cao và có thể phát hiện ở thú sau khi nhiễm bệnh 10 ngày. Protein M có rất nhiều trong lưới nội chất. Mặc dù những thông tin về vai trò mỗi loại protein của vi rút trong miễn dịch trung gian tế bào còn hạn chế nhưng theo Bautista và ctv. (1997) 17, protein M có thể giữ vai trò chính trong miễn dịch trung gian tế bào. Mã hóa protein không cấu trúc Mã hóa protein cấu trúc Hình 1.3 Mô hình cấu trúc gen của vi rút PRRS (dự a trên trì nh tự vi rút Lelystad) (Delputte, 2004) 52 Protein N (ORF 7) có đầu tận cùng là N, được cho là có liên quan đến sự nhận biết điểm tiếp nhận. Có ít nhất 5 vị trí quyết định kháng nguyên trên protein này (Yang và ctv., 2000) 190. Đây là một loại protein có tính miễn dịch cao. Protein N hiện diện nhiều nhất trong virion với chức năng bảo vệ bộ gen của vi rút PRRS. 1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy và sự nhân lên của vi rút PRRS Vi rút PRRS có thể nhân lên và gây bệnh tích ở một số dòng tế bào như tế bào thận khỉ mặt xanh Châu Phi (MA104), những tế bào có nguồn gốc từ MA104 (MARC145, CL2621) và CRL 11171. Các chủng vi rút thuộc dòng Bắc Mỹ phát triển tốt trên tế bào MARC145 trong khi các chủng vi rút thuộc dòng châu Âu phát triển nhanh hơn trên đại thực bào phế nang phổi heo (PAM) (Christopher và ctv., 2002) 39. 9 Vi rút PRRS hấp phụ lên màng tế bào nhờ vào sự gắn kết giữa protein E của vi rút và thụ thể trên bề mặt tế bào đích. Ngoài heparan sulphate và sialoadhesin, theo Calvert và ctv., (2007) 28, một protein hiện diện trên tế bào PAM, dòng tế bào khỉ mặt xanh châu Phi (MARC145) được xem như một thụ thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của vi rút PRRS. Vi rút này xâm nhập vào tế bào bằng con đường nhập nội bào (endocytosis). Sau đó, vỏ ngoài của vi rút bị phân hủy để giải phóng axit nucleic. Quá trình nhân lên của vi rút chỉ xảy ra trong tế bào chất của tế bào nhiễm (Hình 1.4). Hình 1.4 Mô hình chu trình nhân lên của vi rút PRRS trong tế bào (Delputte, 2004) 52 Sau khi axit nucleic của vi rút PRRS được giải phóng ra ngoài tế bào chất của tế bào nhiễm, được dịch mã thành phức hợp những men cần thiết cho sự nhân lên của vi rút và các protein không cấu trúc. Những protein này kết hợp với lưới nội chất không hạt tạo ra những túi có màng kép, là nơi tổng hợp ARN của vi rút. Một 10 số protein cấu trúc được hoàn thiện ở bộ máy Golgi. ARN ở túi màng kép sẽ kết hợp với protein N để tạo thành những nucleocapsid. Các nucleocapsid đi vào lưới nội chất không hạt và tạo vỏ (envelope). Trong các tế bào bị nhiễm vi rút, những hạt vi rút tập trung tại bộ máy Golgi và lưới nội chất không hạt, sau đó giải phóng ra ngoài bằng con đường xuất ngoại bào. Trên môi trường tế bào, hầu hết các chủng vi rút PRRS đều gây bệnh tích (CPE). Tuy nhiên, vài chủng thì không (Yoon và ctv., 1992 194; Christianson và ctv., 1994 40; Mardassi và ctv., 1994 108) hoặc chỉ gây bệnh tích tế bào sau khi cấy chuyển (passage) (OIE, 2000) 135. Biểu hiện bệnh tích tế bào chủ yếu là tế bào co tròn, tụ lại, nhân kết đặc và bong ra sau 6 ngày nuôi cấy (Benfield và ctv., 1992 19; William và ctv., 2006 186). Hình 1.5. Bệnh tích tế bào do vi rút PRRS trên MARC145 1.2.4 Sức đề kháng Vi rút PRRS không bền với nhiệt độ và pH. Vi rút ổn định ở nhiệt độ 40C trong 1 tháng và ít nhất 4 tháng tại 700C. Vi rút bất hoạt hoàn toàn ở 370C trong 48 giờ và 45 phút ở 560C. Vi rút PRRS ổn định ở pH từ 6,5 đến 7,5, nhưng sẽ mất khả năng gây nhiễm rất nhanh ở pH dưới 6 và trên 7,5 (Zimmerman và ctv., 2006 202). Một kết quả khảo sát của Sagar và Goyal (1993) 159 cho thấy khả năng gây nhiễm của vi rút PRRS giảm đi 90% tại pH < 5 và pH > 7. 11 Vi rút bị bất hoạt rất nhanh trong điều kiện khô hạn ở môi trường bên ngoài nhưng tồn tại 9 ngày trong nước giếng và 11 ngày trong nước máy (Pirtle và Beran, 1996) 143. Một nghiên cứu mới đây của Hermann và ctv. (2007) 80 cho thấy vi rút PRRS ổn định hơn ở dạng khí dung (aerosol) tại nhiệt độ và ẩm độ thấp. Tuy nhiên, sự ổn định này của vi rút phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ thấp hơn là với ẩm độ thấp. Ở nhiệt độ phòng, vi rút PRRS bất hoạt hoàn toàn bởi clo (0,03%) trong 10 phút, iốt (0,0075%) trong 1 phút (Shirai và ctv., 2000) 166. Như vậy, vi rút PRRS ít ổn