4 đề tài UPDATE FULL

MỞ ĐẦU Vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm ngày toàn xã hội quan tâm Nguồn thực phẩm khơng đảm bảo vệ sinh ngày khó kiểm soát ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người Ngày nay, hầu hết thực phẩm chế biến có chứa chất phụ gia thực phẩm chất tạo ngọt, chất bảo quản, chất tạo màu,… Chất tạo ngọt, bao gồm chất tạo tự nhiên chất tạo nhân tạo Chất tạo nhân tạo tổng hợp sử dụng rộng rãi thay đường tự nhiên với ưu độ gấp nhiều lần, tiết kiệm chi phí bền Tuy nhiên có nhiều nghi vấn tính độc loại chất tạo nhân tạo tới sức khỏe người, chẳng hạn saccharin dùng lâu dài có khả ức chế men tiêu hóa (pepsin) gây chứng khó tiêu Gần số tác giả người Pháp nghiên cứu thấy saccharin vào bàng quang, với có mặt cholesterol, sinh ung thư cho chuột cống trắng [10] Bên cạnh chất tạo ngọt, chất bảo quản sử dụng phổ biến thực phẩm Paraben (các este axít p-hydroxybenzoic) nhóm chất bảo quản có hoạt tính ức chế phát triển vi sinh vật Các paraben sử dụng để gia tăng thời gian bảo quản loại bánh, kem, mứt, nước ngọt, nước chấm hay số sản phẩm thủy hải sản,… Tuy nhiên, có số nghiên cứu paraben gây độc cho người gây dị ứng, ung thư có số nghiên cứu chứng minh gây ảnh hưởng đến hệ sinh sản động vật,…[15, 16] Đến nay, tồn nhiều nghi ngờ tính độc chất tạo nhân tạo chất bảo quản sức khỏe người hai nhóm chất sử dụng rộng rãi chế biến thực phẩm với hàm lượng nằm ngưỡng cho phép Tổ chức Y tế giới (WHO) Hội đồng chuyên gia phụ gia thực phẩm (JECFA), Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) quy định giới hạn cho phép chất tạo nhân tạo saccharin chất bảo quản [32] Tại Việt Nam, việc sử dụng phụ gia thực phẩm hướng dẫn Thông tư 27/2012/TT-BYT ngày 30/11/2012 Bộ Y tế Thông tư quy định giới hạn cho phép sử dụng saccharin paraben đối tượng thực phẩm khác [2] Trên giới có nhiều nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích để phân tích chất bảo quản chất tạo phương pháp quang phổ [13], điện di mao quản [2, 8, 27], sắc ký mỏng [21], sắc ký khí ghép nối khối phổ [7, 13] sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) [22, 30] cho độ nhạy độ xác cao Tuy nhiên, sắc ký khí kết nối khối phổ đòi hỏi quy trình xử lý mẫu phức tạp, thời gian chuyển hóa chất phân tích Hơn giới hạn cho phép nghiên cứu ngưỡng 10 -6 Do đó, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao xu hướng phổ biến áp dụng phòng thí nghiệm để xác định chất bảo quản chất tạo Trong phương pháp sử dụng thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao công bố, chất tạo chất bảo quản phân loại theo hai nhóm sử dụng hai quy trình phân tích riêng biệt Một số phòng thí nghiệm bước đầu đưa phương pháp phân tích đồng thời hai nhóm chất trên, nhiên phương pháp thường sử dụng pha đảo, sử dụng sắc ký tạo cặp ion (ion pair) [22, 26] Điều dẫn đến áp suất cột cao, độ nhạy kém, dễ gây tắc cột phân tích dẫn đến giảm tuổi thọ cột, thời gian phân tích dài Do việc nghiên cứu quy trình cho phép phân tích hai nhóm chất giúp tiết kiệm thời gian phân tích, sử dụng phương pháp đơn giản phổ biến phòng thí nghiệm cần thiết Ở Việt Nam, cơng trình nghiên cứu khoa học công bố xác định khảo sát hàm lượng hai nhóm chất tạo tổng hợp chất bảo quản – este p-hydroxybezoate Trong Thông tư số 27/2012/TT-BYT Bộ Y tế hướng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm, chất tạo tổng hợp saccharin, acesulfame-k, aspartame chất bảo quản methyl p-hydroxybenzoate, propyl p-hydroxybenzoate ethyl phydroxybenzoate phép sử dụng ngưỡng cho phép Buty p– hydroxybenzoate isobutyl p- hydroxybenzoate khơng có danh mục qui định chất phụ gia phép sử dụng thực phẩm Việt Nam Gần đây, Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8471:2010 [3] đưa phương pháp xác định số chất tổng hợp (acesulfame-k, aspartame saccharin) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Hiện Việt Nam, chất bảo quản đưa phương pháp phân tích đơn giản chuẩn độ, so màu Các phương pháp dễ gây sai số, có độ nhạy thấp Hiện nay, chưa có cơng bố Việt Nam xác định đồng thời hàm lượng chất tạo tổng hợp chất bảo quản phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, thay vào phương pháp phân tích cổ điển chuẩn độ, so màu xác định riêng lẻ chất bảo quản, có độ nhạy độ xác khơng cao Chính lý trên, nhóm nghiên cứu lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu phát triển phương pháp xác định chất tạo nhân tạo (saccharin) số chất bảo quản (methyl-, ethyl-, isobutyl- butyl-p-hydroxybenzoate) nước chấm, gia vị số sản phẩm đồ uống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)” với mục tiêu xây dựng phương pháp nhanh, đơn giản, có độ xác cao, phù hợp với phòng thí nghiệm Việt Nam, nhằm góp phần nâng cao việc kiểm tra, giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm, cảnh báo sử dụng thực phẩm an toàn Nội dung nghiên cứu đề tài gồm: – Nghiên cứu lựa chọn dung môi tách chiết tạo nhân tạo số chất bảo quản đối tượng mẫu thực phẩm nghiên cứu – Lựa chọn chế độ phân tích máy sắc ký lỏng hiệu cao HPLC – Xác định độ thu hồi mẫu, LOD LOQ – Xác định độ xác phương pháp – Áp dụng phương pháp nghiên cứu để khảo sát số mẫu nước chấm, gia vị số sản phẩm đồ uống,… thị trường CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chất tạo nhân tạo Saccharin số chất bảo quản nhóm Paraben 1.1.1 Giới thiệu chung Saccharin (E954) chất tạo nhân tạo phát cách tình cờ Giáo sư Constantine Fahlberg Giáo sư Ira Remsen phòng thí nghiệm trường Đại học Johns Hopkins vào năm 1878 [26] Saccharin thường gọi đường hóa học, có độ cao gấp nhiều lần so với loại đường tự nhiên, thường sử dụng thay đường tự nhiên sản xuất bánh kẹo, nước giải khát Ngoài ra, saccharin dùng sản phẩm mỹ phẩm, vitamin dược phẩm Saccharin biết đến thành phần sản phẩm: Sweet and Low, Sweet Twin, Sweet’N Low Necta Sweet,… Hình 1.1 Chất tạo nhân tạo saccharin số sản phẩm thương mại thị trường Paraben nhóm chất bảo quản sử dụng sản phẩm mỹ phẩm, dược phẩm thực phẩm để chống lại sinh trưởng nấm mốc vi khuẩn, bảo vệ người tiêu dùng, đồng thời đảm bảo chất lượng ban đầu sản phẩm Paraben este axít para - hydroxybenzoic bao gồm methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben, isobutylparaben, heptylparaben [12] Hiện nay, paraben cho phép có mặt hàng chục ngàn thực phẩm, mỹ phẩm dược phẩm Trong thực phẩm, paraben thường dùng sản phẩm bánh, kem, mứt, đồ uống, gia vị, nước chấm hay số sản phẩm thủy hải sản Trong ngành dược, paraben dạng riêng lẻ phối hợp sử dụng làm chất bảo quản chống vi khuẩn cho dạng thuốc nước, siro, thuốc viên, thuốc nhỏ mắt, với tỷ lệ vài phần nghìn Paraben sử dụng phổ biến sản phẩm mỹ phẩm đồ trang điểm, dung dịch dưỡng ẩm, làm mềm da, chăm sóc tóc, nước cạo râu,… 1.1.2 Tính chất vật lí - hóa học 1.1.2.1 Saccharin - Danh pháp Quốc tế: 1- dioxo-1,2-benzothiazol-3-1 - Tên thường gọi: benzoic sunfimit octho sunphobenzamit - Công thức hóa học: C7H5NO3S - Cấu trúc phân tử: Hình 1.2 Cấu trúc phân tử chất tạo nhân tạo saccharin - Khối lượng phân tử: 183,18 g/mol - Điểm nóng chảy: 228,8 – 229,7 oC - Khối lượng riêng: 0,828 g/cm3 Bột saccharin kết tinh có màu trắng, khơng mùi, tan nước (1 g/290 ml) ether, dạng muối natri canxi dễ tan nước, methanol, ethanol, acetonitrile Saccharin có pKa = 2,2, ổn định mơi trường axít, lại khơng có phản ứng với thành phần thực phẩm nên thường dùng nhiều đồ uống, nước ngọt, bánh kẹo, kem đánh răng, Ở nhiệt độ cao, saccharin giữ độ vốn có, thay tối đa 25% lượng đường saccharose nên sử dụng sản xuất bánh, mứt, kẹo cao su, hoa đóng hộp, kẹo, bánh tráng miệng,… Saccharin có độ cao gấp 200 - 700 lần loại đường tự nhiên, có nhược điểm lớn có hậu vị cay đắng, với mùi kim loại nồng độ cao Do đó, saccharin thường kết hợp với loại đường khác đường cyclamate aspartame với nồng độ thấp, để bổ trợ khắc phục nhược điểm 1.1.2.2 Paraben Paraben este axít para – hydroxybenzoic Cấu trúc hóa học chung paraben bao gồm gốc axít p - hydroxybenzoic C6H4(OH)COO- ghép nối với nhóm alkyl R Hình 1.3 Cấu trúc phân tử paraben Các paraben thường dùng bao gồm methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben heptylparaben Paraben phổ biến bao gồm isobutylparaben, isopropylparaben, benzylparaben [16] Thông thường, người ta sử dụng phối hợp gốc paraben để giúp làm giảm liều lượng chất sản phẩm đồng thời tăng khả kháng vi khuẩn nấm Phân loại tính chất số paraben thường dùng:  Methylparaben - Danh pháp Quốc tế: Methyl 4-hydroxybenzoate - Tên thường gọi: Methyl paraben, Methyl p-hydroxybenzoate, Methyl parahydroxybenzoate, Nipagin M - Cơng thức hóa học: C8H8O3 - Cấu trúc phân tử: Hình 1.4 Cấu trúc phân tử methylparaben - Khối lượng phân tử: 152,15 g/mol - Điểm nóng chảy: 122 – 131 oC - Nhiệt độ sôi: 270 – 280 oC - Mã phụ gia: E218 - Methylparaben tồn dạng tinh thể hình kim bột trắng, tan nước ấm, ethanol, methanol, DMF (dimethyl foramide), ethyl acetate, acetonitrile  Ethylparaben - Danh pháp Quốc tế: Ethyl 4-hydroxybenzoate - Tên thường gọi: Ethyl paraben; Ethyl parahydroxybenzoate; Ethyl parahydroxybenzoate; Ethyl p-hydroxybenzoate; 4-Hydroxybenzoic acid ethyl ester - Công thức hóa học: C9H10O3 - Cấu trúc phân tử: Hình 1.5 Cấu trúc phân tử ethylparaben - Khối lượng phân tử: 166,17 g/mol - Điểm nóng chảy: 115–118 °C - Nhiệt độ sôi: 297–298 °C - Mã phụ gia: E214 - Ethylparaben tan nước lạnh, có khả tan nước sôi, số dung môi methanol, ethanol  Butylparaben - Danh pháp Quốc tế: Butyl 4-hydroxybenzoate - Tên thường gọi: butyl paraben, butyl parahydroxybenzoate, butyl phydroxybenzoate - Cơng thức hóa học: C11H14O3 - Cấu trúc phân tử: Hình 1.6 Cấu trúc phân tử butylparaben - Khối lượng phân tử: 194,25 g/mol - Nhiệt độ nóng chảy 68-69 oC - Butylparaben chất không màu, không mùi, kết tinh tốt nhiệt độ phòng, tan nước nhiệt độ thường, tan tốt số dung môi acetone, methanol, acetonitrile, – butanol,  Isobutylparaben - Danh pháp Quốc tế: Isobutyl 4-hydroxybenzoate - Tên thường gọi: isobutyl paraben, isobutyl parahydroxybenzoate, isobutyl p-hydroxybenzoate - Cơng thức hóa học: C11H14O3 - Cấu trúc phân tử: Hình 1.7 Cấu trúc phân tử isobutylparaben - Khối lượng phân tử: 194,25 g/mol - Nhiệt độ nóng chảy 76 oC - Tinh thể Isobutylparaben màu trắng, không mùi, kết tinh tốt nhiệt độ phòng, tan nước nhiệt độ thường, tan tốt số dung môi acetone, methanol, acetonitrile, – butanol, 1.1.3 Điều chế chuyển hóa Saccharin sản xuất nhiều cách khác [33] Phương pháp Remsen Fahlberg sử dụng phổ biến, với nguyên liệu toluene với o- chlorotoluene [29] Q trình sulfo hóa axít chlorosulfonic tạo ortho para clorua sulfonyl Các đồng phân ortho tách chuyển thành sulfonamide amoniac Q trình oxy hóa nhóm metyl tạo axít cacboxylic, tạo vòng thành axít tự saccharin [20]: Hình 1.8 Quá tình tổng hợp saccharin theo Remsen-Fahlberg Năm 1950, trình tổng hợp cải tiến phát triển Cơng ty Hố chất Maumee Toledo, Ohio Trong trình tổng hợp này, axít anthranilic phản ứng với axít nitơ (từ natri nitrit axít hydrochloric), sulfur dioxide, clo cuối amoniac để tạo saccharin [20] Hình 1.9 Quá tình tổng hợp saccharin theo Maumee Paraben bao gồm: methylparaben, ethylparaben, propylparaben butylparaben tìm thấy số thực vật, methylparaben việt quất [4] hầu hết paraben tổng hợp cho sản xuất thương mại Paraben điều chế phản ứng este hóa axít parahydroxybenzoic với rượu thích hợp Sau đó, q trình điều chế Kolbe – Schmitt cải tiến phản ứng carboxyl hóa 10 10 16.235 53962 16.619 48911 40 30 mAU paraben Isobutyl Butyl paraben Methyl paraben 21151 5.024 20 Sodium saccharin mAU 30 11.915 70063 40 13.749 63304 50 2: 238 nm, nm HPLC Mix1ppm.gra9.dat Name Retention Time Area Ethyl paraben 50 20 10 0 -10 -10 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 10 16.725 22111 13.813 31486 40 30 mAU paraben Isobutyl Butyl paraben Methyl paraben 5.152 8877 20 Sodium saccharin mAU 30 Ethyl paraben 12.011 34406 40 2: 238 nm, nm HPLC LOD.nc1.dat Name Retention Time Area 16.299 25651 Hình PL31 Sắc ký đồ chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP nồng độ µg/ml sử dụng cột tách Phenyl-3 20 10 0 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 10 16.704 17070 13.803 23839 40 30 mAU paraben Isobutyl Butyl paraben Methyl paraben 5.045 6536 20 Sodium saccharin mAU 30 Ethyl paraben 11.989 25138 40 2: 238 nm, nm HPLC LOD.gk.dat Name Retention Time Area 16.288 18004 Hình PL32 Sắc ký đồ xác định LOD SS, MP, EP, BP, IBP nước giải khát, sử dụng cột tách Phenyl-3 20 10 0 -10 -10 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình PL33 Sắc ký đồ xác định LOD SS, MP, EP, BP, IBP nước tương, sử dụng cột tách Phenyl-3 78 200 175 175 150 438196 150 125 Sodium saccharin 5.045 125 10 Minutes 11 14 75 16.683 1000429 13 16.288 1265694 12 993073 mAU paraben Isobutyl Butyl paraben 25 Ethyl paraben Methyl paraben 50 13.792 75 100 1392623 100 11.957 mAU 200 2: 238 nm, nm HPLC GK1.20ppm.Grad9.dat Name Retention Time Area 50 25 15 16 17 18 19 20 Hình PL34 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát 1, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách Phenyl-3 200 200 2: 238 nm, nm HPLC GK2.20ppm.Grad9.dat Name Retention Time Area 175 175 150 426706 150 5.035 125 100 10 Minutes 11 12 14 75 16.672 16.277 999574 13 988879 mAU paraben Isobutyl Butyl paraben Ethyl paraben 25 1276567 1401451 Methyl paraben 50 11.947 75 13.781 100 Sodium saccharin mAU 125 50 25 15 16 17 18 19 20 Hình PL35 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát 2, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách Phenyl-3 2: 238 nm, nm HPLC Nc6A.20ppm.Grad9.dat Name Retention Time Area 175 175 125 Sodium saccharin 125 10 Minutes 11 12 13 14 75 16.661 16.277 996017 mAU paraben Isobutyl Butyl paraben Ethyl paraben 25 993121 1253386 50 13.771 11.936 75 100 1362067 100 Methyl paraben mAU 150 5.035 150 200 440677 200 50 25 15 16 17 18 19 20 Hình PL36 Sắc ký đồ mẫu nước tương, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách Phenyl-3 79 200 200 2: 238 nm, nm HPLC Nc3.20ppm.dat Name Retention Time Area 175 175 125 5.184 125 10 Minutes 11 12 13 14 75 16.832 16.416 986619 976229 mAU paraben Isobutyl Butyl paraben Ethyl paraben 25 1271318 1392903 Methyl paraben 50 12.117 75 100 13.920 100 Sodium saccharin mAU 150 437351 150 50 25 15 16 17 18 19 20 Hình PL37 Sắc ký đồ mẫu nước ép quả, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách Phenyl-3 200 200 2: 238 nm, nm HPLC Gk2.50ppm.dat Name Retention Time Area 175 175 150 25 221382 100 mAU 240100 16.203 16.597 125 paraben Isobutyl Butyl paraben 50 Ethyl paraben Sodium saccharin 75 13.717 11.893 Methyl paraben 96212 100 5.067 mAU 125 301724 328027 150 75 50 25 0 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình PL38 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát 2, nồng độ thêm chuẩn 50 µg/g sử dụng cột tách Phenyl-3 200 200 2: 238 nm, nm HPLC Nc6.5ppm.dat Name Retention Time Area 175 309983 75 50 125 16.864 100 mAU 248244 16.437 231469 308436 13.941 Ethyl paraben Methyl paraben 113518 5.205 100 Sodium saccharin mAU 125 150 12.128 150 paraben Isobutyl Butyl paraben 175 75 50 25 25 0 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình PL39 Sắc ký đồ mẫu nước tương, nồng độ thêm chuẩn 50 µg/g sử dụng cột tách Phenyl-3 80 200 200 2: 238 nm, nm HPLC NEQ.50ppm.dat Name Retention Time Area 175 50 25 228756 100 mAU 247022 125 16.704 16.288 Ethyl paraben 75 13.803 12.000 Methyl paraben 120511 5.056 100 Sodium saccharin mAU 125 150 353371 343283 150 paraben Isobutyl Butyl paraben 175 75 50 25 0 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình PL40 Sắc ký đồ mẫu nước ép quả, nồng độ thêm chuẩn 50 µg/g sử dụng cột tách Phenyl-3 20 20 15 10 mAU mAU Sodium saccharin 10 (Ethyl paraben) 5.109 (Methyl paraben) 22374 15 (Isobutyl paraben) (Butyl paraben ) 2: 238 nm, nm HPLC Gk5.dat Name Retention Time Area 0 -5 -5 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình PL41 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát 5, sử dụng cột tách Phenyl-3 200 2: 238 nm, nm HPLC NC3.dat Name Retention Time Area 175 322403 75 50 25 13.675 100 75 paraben) (Isobutyl ) (Butyl paraben (Sodium saccharin) 100 125 Ethyl paraben Methyl paraben 125 mAU 150 12.011 150 mAU 175 213441 200 50 25 0 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Hình PL42 Sắc ký đồ mẫu nước tương 3, sử dụng cột tách Phenyl-3 81 20 2: 238 nm, nm HPLC Neq2.dat Name Retention Time Area 40 10 30 mAU Ethyl paraben (Methyl paraben) 20 (Sodium saccharin) mAU 30 paraben)) (Isobutyl (Butyl paraben 13.835 14189 40 20 10 0 -10 -10 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Hình PL43 Sắc ký đồ mẫu nước ép 2, sử dụng cột tách Phenyl-3 200 200 2: 238 nm, nm HPLC TO7.dat Name Retention Time Area 175 175 308999 150 25 mAU 100 75 paraben) (Isobutyl ) (Butyl paraben 50 125 13.643 12.000 27621 75 Ethyl paraben Methyl paraben 100 (Sodium saccharin) mAU 125 150 50 25 0 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình PL44 Sắc ký đồ mẫu tương ớt, sử dụng cột tách Phenyl-3 200 175 175 150 150 125 125 100 100 mAU mAU 200 2: 238 nm, nm HPLC Gk3.dat Name Retention Time Area 75 75 50 50 25 25 0 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình PL45 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát 3, sử dụng cột tách Phenyl-3 82 2: 238 nm, nm HPLC Gk5.dat Name Retention Time Area 40 40 10 mAU paraben) (Isobutyl ) (Butyl paraben (Ethyl paraben) 20 (Methyl paraben) 5.109 22143 30 Sodium saccharin mAU 30 20 10 0 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Hình PL46 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát 6, sử dụng cột tách Phenyl-3 200 175 175 150 125 125 106624 150 100 100 25 paraben) (Isobutyl ) (Butyl paraben (Methyl paraben) (Sodium saccharin) 50 75 Ethyl paraben 75 mAU 13.643 mAU 200 2: 238 nm, nm HPLC NC4.dat Name Retention Time Area 50 25 0 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình PL47 Sắc ký đồ mẫu nước tương 4, sử dụng cột tách Phenyl-3 200 200 2: 238 nm, nm HPLC NT4.dat Name Retention Time Area 175 175 150 163679 150 119469 125 25 mAU paraben) (Isobutyl ) (Butyl paraben 50 75 Ethyl paraben 75 100 13.717 11.893 Methyl paraben 100 (Sodium saccharin) mAU 125 50 25 0 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Hình PL48 Sắc ký đồ mẫu tương ớt 4, sử dụng cột tách Phenyl-3 83 20 300 300 2: 238 nm, nm HPLC GK4.0.dat Name Retention Time Area 250 250 200 234424 200 150 mAU paraben) (Isobutyl ) (Butyl paraben 50 (Ethyl paraben) 100 (Methyl paraben) Sodium saccharin mAU 5.131 150 100 50 0 -50 -50 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình PL49 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát 4, sử dụng cột tách Phenyl-3 300 300 2: 238 nm, nm HPLC NEQ8.A.dat Name Retention Time Area 250 250 200 147405 200 mAU 150 (Ethyl paraben) 50 (Methyl paraben) Sodium saccharin 100 paraben) (Isobutyl ) (Butyl paraben 5.131 mAU 150 100 50 0 -50 -50 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình PL50 Sắc ký đồ mẫu nước ép 8, sử dụng cột tách Phenyl-3 300 300 2: 238 nm, nm HPLC VS2.1.dat Name Retention Time Area 250 556125 250 200 5.141 200 150 mAU paraben) (Isobutyl ) (Butyl paraben 50 (Ethyl paraben) 100 (Methyl paraben) mAU Sodium saccharin 150 100 50 0 -50 -50 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Hình PL51 Sắc ký đồ mẫu viên súp 2, sử dụng cột tách Phenyl-3 84 20 300 300 2: 238 nm, nm HPLC VS5.A.dat Name Retention Time Area 250 533001 250 200 5.131 200 150 mAU paraben) (Isobutyl ) (Butyl paraben 50 (Ethyl paraben) 100 (Methyl paraben) mAU Sodium saccharin 150 100 50 0 -50 -50 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình PL52 Sắc ký đồ mẫu viên súp 5, sử dụng cột tách Phenyl-3 300 300 2: 238 nm, nm HPLC NC7.dat Name Retention Time Area 250 50 mAU 150 paraben) (Isobutyl ) (Butyl paraben (Sodium saccharin) 100 Ethyl paraben mAU Methyl paraben 150 200 13.792 12.000 200 403058 477485 250 100 50 0 -50 -50 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình PL53 Sắc ký đồ nước tương 7, sử dụng cột tách Phenyl-3 300 (Sodium saccharin) 50 200 150 mAU Methyl paraben mAU 150 Ethyl paraben 12.075 200 100 250 13.856 350088 250 769587 2: 238 nm, nm HPLC NC8.dat Name Retention Time Area paraben) (Isobutyl ) (Butyl paraben 300 100 50 0 -50 -50 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18 Hình PL54 Sắc ký đồ nước tương 8, sử dụng cột tách Phenyl-3 85 19 20 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chất tạo nhân tạo Saccharin số chất bảo quản nhóm Paraben 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Tính chất vật lí - hóa học 1.1.3 Điều chế chuyển hóa 1.1.4 Độc tính - Giới hạn cho phép sử dụng saccharin chất bảo quản nhóm paraben 11 1.2 Các phương pháp xác định hàm lượng chất tạo saccharin chất bảo quản nhóm paraben 14 1.2.1 Phương pháp tách chiết, làm làm giàu đồng thời chất tạo nhân tạo chất bảo quản từ mẫu thực phẩm 14 1.2.2 Phương pháp phân tích saccharin paraben thiết bị đại 18 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 27 2.1 Đối tượng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 27 2.1.1 Đối tượng, mục tiêu nghiên cứu 27 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 27 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Nghiên cứu điều kiện tách chiết, làm sạch, làm giàu mẫu từ đối tượng nghiên cứu 30 2.3.2 Lựa chọn chế tối ưu máy HPLC - PDA 32 2.3.3 Xác định giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), xây dựng đường chuẩn 35 2.3.4 Nghiên cứu độ xác phương pháp 37 2.3.5 Áp dụng phương pháp nghiên cứu để khảo sát số mẫu thực phẩm địa bàn Hà Nội 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN 39 3.1 Nghiên cứu điều kiện chiết tách, làm sạch, làm giàu chất tạo saccharin chất bảo quản nhóm paraben 39 3.1.1 Xử lý mẫu sơ 39 3.1.2 Chiết tách 39 3.1.3 Qui trình phân tích phân tích chất tạo saccharin chất bảo quản nhóm paraben thực phẩm 45 3.2 Khảo sát điều kiện xác định chất tạo saccharin chất bảo quản nhóm paraben HPLC - PDA 46 3.3 Đánh giá phương pháp tách chiết phân tích chất tạo saccharin chất bảo quản nhóm paraben đối tượng mẫu nghiên cứu 50 3.3.1 Khoảng tuyến tính 50 3.3.2 Xác định giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ phương pháp 52 3.4 Đánh giá độ xác phương pháp xác định chất tạo saccharin chất bảo quản nhóm paraben thực phẩm 54 3.4.1 Đánh giá độ xác phương pháp 54 3.5 Áp dụng phương pháp nghiên cứu để phân tích mẫu thực tế 59 KẾT LUẬN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC 67 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Quy định nồng độ giới hạn cho phép sử dụng saccharin paraben nước chấm, gia vị nước giải khát 13 Bảng 2.1 Thông số khảo sát cột tách 34 Bảng 2.2 Pha dung dịch chất chuẩn 36 Bảng 3.1 Lựa chọn dung môi tách chiết 40 Bảng 3.2 Khảo sát trình làm mẫu 42 Bảng 3.3 Khảo sát trình rửa tạp với nước 44 Bảng 3.4 Khảo sát pha tĩnh pha động 47 Bảng 3.5 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chất phân tích 50 Bảng 3.6 Khoảng tuyến tính phương trình hồi quy tuyến tính đường chuẩn chất nghiên cứu 52 Bảng 3.7 Giới hạn phát giới hạn định lượng chất tạo saccharin chất bảo quản nhóm paraben thực phẩm 53 Bảng 3.8 Kết đánh giá độ xác phương pháp, n=6 55 Bảng 3.9 Kết phân tích hàm lượng chất tạo saccharin chất bảo quản nhóm paraben thực phẩm 59 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Chất tạo nhân tạo saccharin số sản phẩm thương mại thị trường Hình 1.2 Cấu trúc phân tử chất tạo nhân tạo saccharin Hình 1.3 Cấu trúc phân tử paraben Hình 1.4 Cấu trúc phân tử methylparaben Hình 1.5 Cấu trúc phân tử ethylparaben Hình 1.6 Cấu trúc phân tử butylparaben Hình 1.7 Cấu trúc phân tử isobutylparaben Hình 1.8 Quá tình tổng hợp saccharin theo Remsen-Fahlberg 10 Hình 1.9 Quá tình tổng hợp saccharin theo Maumee 10 Hình 2.1 Các bước trình chiết pha rắn 17 Hình 2.2 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 22 Hình 2.3 Quy trình xử lý mẫu dự kiến 32 Hình 2.4 Một số đối tượng thực phẩm nghiên cứu 38 Hình 3.1 Biểu đồ phụ thuộc hiệu suất thu hồi vào cột SPE 42 Hình 3.2 Biểu đồ khảo sát trình rửa tạp 0, 2, ml nước 44 Hình 3.3 Quy trình phân tích chất tạo saccharin chất bảo quản nhóm paraben thực phẩm 46 Hình 3.4 Sắc ký đồ chất chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP sử dụng chương trình sắc ký 48 Hình 3.5 Sắc ký đồ chất chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP sử dụng chương trình sắc ký 48 Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn sử dụng chương trình sắc ký 3, chế độ gradient 49 Hình 3.7 Đường chuẩn chất nghiên cứu sử dụng cột Ph-3 51 Hình 3.8 Sắc ký đồ chất tạo saccharin chất bảo quản nhóm paraben nồng độ 20 µg/ml 52 Hình 3.9 Sắc ký đồ xác định LOD saccharin paraben sử dụng cột Ph-3 53 Hình PL1 Sắc ký đồ chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP nồng độ µg/ml sử dụng cột tách ODS-3 68 Hình PL2 Sắc ký đồ chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP nồng độ µg/ml sử dụng cột tách ODS-3 68 Hình PL3 Sắc ký đồ chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP nồng độ µg/ml sử dụng cột tách ODS-3 68 Hình PL4 Sắc ký đồ chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP nồng độ 10 µg/ml sử dụng cột tách ODS-3 69 Hình PL5 Sắc ký đồ chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP nồng độ 20 µg/ml sử dụng cột tách ODS-3 69 Hình PL6 Sắc ký đồ chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP nồng độ 25 µg/ml sử dụng cột tách ODS-3 69 Hình PL7 Sắc ký đồ chất chuẩn khảo sát cột SPE Supelco SuperClean LC-Si, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách ODS-3 70 Hình PL8 Sắc ký đồ chất chuẩn khảo sát cột SPE CNW HC-18 SPE Tuber, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách ODS-3 70 Hình PL9 Sắc ký đồ chất chuẩn khảo sát cột SPE Water Vac C18 3cc, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách ODS-3 70 Hình PL10 Sắc ký đồ chất chuẩn khảo sát cột Supelco SuperClean LC18, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách ODS-3 71 Hình PL11 Sắc ký đồ chất chuẩn khảo sát cột Supelco SuperClean LC18, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g, rửa tạp ml nước sử dụng cột tách ODS3 71 Hình PL12 Sắc ký đồ chất chuẩn khảo sát cột Supelco SuperClean LC18, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g, rửa tạp ml nước sử dụng cột tách ODS3 71 Hình PL13 Sắc ký đồ xác định LOD, sử dụng cột tách ODS-3 72 Hình PL14 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách ODS-3 72 Hình PL15 Sắc ký đồ mẫu nước ép quả, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách ODS-3 72 Hình PL16 Sắc ký đồ mẫu nước tương, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách ODS-3 73 Hình PL17 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát, nồng độ thêm chuẩn 50 µg/g sử dụng cột tách ODS-3 73 Hình PL18 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát, nồng độ thêm chuẩn 50 µg/g sử dụng cột tách ODS-3 73 Hình PL19 Sắc ký đồ mẫu nước tương, nồng độ thêm chuẩn 50 µg/g sử dụng cột tách ODS-3 74 Hình PL20 Sắc ký đồ chuẩn 20 µg/ml, cột tách Ph-3, pha động acetonitrile: đệm acetate 70:30 (v/v) 74 Hình PL21 Sắc ký đồ chuẩn 20 µg/ml, cột tách Ph-3, pha động methanol: đệm acetate 55:45 (v/v) 74 Hình PL22 Sắc ký đồ chuẩn 20 µg/ml, cột tách Ph-3, pha động methanol: đệm acetate 50:50 (v/v) 75 Hình PL23 Sắc ký đồ chuẩn 20 µg/ml, cột tách Ph-3, pha động methanol: đệm acetate 60:40 (v/v) 75 Hình PL24 Sắc ký đồ mẫu nước tương thêm chuẩn nồng độ 200 µg/ml, cột tách Ph-3, pha động methanol: đệm acetate 55:45 (v/v) 75 Hình PL25 Sắc ký đồ chuẩn 20 µg/ml, cột tách Ph-3, chế độ gradient 76 Hình PL26 Sắc ký đồ chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP nồng độ 25 µg/ml sử dụng cột tách Phenyl-3 76 Hình PL27 Sắc ký đồ chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP nồng độ 20 µg/ml sử dụng cột tách Phenyl-3 76 Hình PL28 Sắc ký đồ chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP nồng độ 10 µg/ml sử dụng cột tách Phenyl-3 77 Hình PL29 Sắc ký đồ chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP nồng độ µg/ml sử dụng cột tách Phenyl-3 77 Hình PL30 Sắc ký đồ chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP nồng độ µg/ml sử dụng cột tách Phenyl-3 77 Hình PL31 Sắc ký đồ chuẩn SS, MP, EP, BP, IBP nồng độ µg/ml sử dụng cột tách Phenyl-3 78 Hình PL32 Sắc ký đồ xác định LOD SS, MP, EP, BP, IBP nước giải khát, sử dụng cột tách Phenyl-3 78 Hình PL33 Sắc ký đồ xác định LOD SS, MP, EP, BP, IBP nước tương, sử dụng cột tách Phenyl-3 78 Hình PL34 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát 1, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách Phenyl-3 79 Hình PL35 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát 2, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách Phenyl-3 79 Hình PL36 Sắc ký đồ mẫu nước tương, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách Phenyl-3 79 Hình PL37 Sắc ký đồ mẫu nước ép quả, nồng độ thêm chuẩn 200 µg/g sử dụng cột tách Phenyl-3 80 Hình PL38 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát 2, nồng độ thêm chuẩn 50 µg/g sử dụng cột tách Phenyl-3 80 Hình PL39 Sắc ký đồ mẫu nước tương, nồng độ thêm chuẩn 50 µg/g sử dụng cột tách Phenyl-3 80 Hình PL40 Sắc ký đồ mẫu nước ép quả, nồng độ thêm chuẩn 50 µg/g sử dụng cột tách Phenyl-3 81 Hình PL41 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát 5, sử dụng cột tách Phenyl-3 81 Hình PL42 Sắc ký đồ mẫu nước tương 3, sử dụng cột tách Phenyl-3 81 Hình PL43 Sắc ký đồ mẫu nước ép 2, sử dụng cột tách Phenyl-3 82 Hình PL44 Sắc ký đồ mẫu tương ớt, sử dụng cột tách Phenyl-3 82 Hình PL45 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát 3, sử dụng cột tách Phenyl-3 82 Hình PL46 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát 6, sử dụng cột tách Phenyl-3 83 Hình PL47 Sắc ký đồ mẫu nước tương 4, sử dụng cột tách Phenyl-3 83 Hình PL48 Sắc ký đồ mẫu tương ớt 4, sử dụng cột tách Phenyl-3 83 Hình PL49 Sắc ký đồ mẫu nước giải khát 4, sử dụng cột tách Phenyl-3 84 Hình PL50 Sắc ký đồ mẫu nước ép 8, sử dụng cột tách Phenyl-3 84 Hình PL51 Sắc ký đồ mẫu viên súp 2, sử dụng cột tách Phenyl-3 84 Hình PL52 Sắc ký đồ mẫu viên súp 5, sử dụng cột tách Phenyl-3 85 Hình PL53 Sắc ký đồ nước tương 7, sử dụng cột tách Phenyl-3 85 Hình PL54 Sắc ký đồ nước tương 8, sử dụng cột tách Phenyl-3 85 ... khác 14. 1 .4 500 Cà phê, sản phẩm tương tự cà phê, chè, đồ uống thảo dược đồ uống từ ngũ cốc, trừ đồ uống từ cacao 14. 1.5 45 0 Rượu táo, lê 14. 2.2 200 Rượu vang (trừ rượu vang nho) 14. 2 .4 200 Rượu... mạnh pha đường ades 14. 1 .4. 2 300 Đồ uống hương liệu cô đặc 14. 1 .4. 3 300 Cà phê, sản phẩm tương tự cà phê, chè, đồ uống thảo dược loại đồ uống từ ngũ cốc, trừ đồ uống từ ca cao 14. 1.5 200 Đồ uống... đồ uống từ ca cao 14. 1.5 200 Đồ uống có cồn hương liệu 14. 2.7 80 12.3 100 12 .4 300 12.6 1000 Dấm Methyl-4hydroxyben zoate Mù tạt ethyl-4Nước chấm sản phẩm 13 hydroxyben tương tự zoate Nước chấm