Tóm tắt Một nhà sản suất protease tế bào kháng DMHC thành công việc phân lập từ 11 mẫu phân lập vi khuẩn chống chịu benzen-etoluene-xylene-ethylbenzene (BTEX) VSV tìm thấy có khả kháng DMHC vòng đa chức thơm hydrocarbons (PAHs) phân giải xác định Pseudomonas aeruginosa ( trực khuẩn mủ xanh) chủng K Nó chọn lọc dựa ổn định enzyme phân giải protein dung môi hữu khác Protease trực khuẩn mủ xanh chống chịu lên đến 50% (v/v) benzen, n-hexane, 1-decanol, isooctan n-hexadecan độ ổn định có 25% (v/v) n-decane n-dodecane Enzyme chủng K hoạt hóa 2.5, 1.5 1.2 lần có 75% (v/v) 1-decanol, isooctanvà n-Dodecan, tương ứng Độ ổn định protease DMHC sd làm chất xúc tác sinh học cho tổng hợp enzyme hữucơ có mặt DMHC 1 Giới thiệu Trong năm gần đây, nỗ lực lớn thực để phát tầm quan trọng phản ứng enzyme protease sử dụng diện dung môi hữu cho Pseudomonas Protease vi sinh vật hoạt động chất xúc tác dung môi không chứa nước cung cấp khả chuyển dịch cân nhiệt động lực học có lợi cho trình tổng hợp, tăng độ tan chất kỵ nước, đặc biêt kiểm soát cụ thể dung môi cải thiện ổn định nhiệt enzyme G.Bell Klibanov báo cáo dung môi hữu sử dụng môi trường cho phản ứng enzyme cung cấp lợi quan trọng việc áp dụng công nghiệp chất xúc tác sinh học Ngoài ra, vi sinh vật chịu dung môi hữu ích biến đổi sinh học với toàn tế bào hệ thống dung môi nước giai đoạn Đối với lý này, trở thành lĩnh vực enzymology để tìm kiếm protease, ổn định tự nhiên diện DMHC sử dụng phản ứng tổng hợp Protease thường sử dụng môi trường không chứa nước môi trường làm tăng độ tan chất sản phẩm tạo thuận lợi cho việc thu hồi sản phẩm thuận lợi cho phản ứng tổng hợp peptide, nhiệt động lực học không thuận lợi nước Như vậy, ổn định protease diện dung môi hữu hữu ích để tổng hợp môi trường Chú ý bổ sung bắt nguồn từ thực tế nhiều loại dung môi kỵ nước phân loại chất gây ô nhiễm môi trường suy thoái vi sinh vật trọng tâm ngành công nghiệp xử lý sinh học Trong báo này, báo cáo cô lập mô tả đặc tính vi sinh vật lựa chọn dựa đặc tính hình thái sinh hóa độ ổn định dung môi hữu enzyme 2 vật liệu phương pháp 2.1 Chủng VK Các vi khuẩn sử dụng nghiên cứu phân lập từ đất bị ô nhiễm nhà máy gỗ Selangor, Malaysia 11 mẫu phân lập vi khuẩn chịu benzen-toluen-xylene-ethylbenzene (BTEX) chứng minh có đa vòng thơmhydrocarbons (PAHs) phân giải Pseudomonas aeruginosa chủng K bị cô lập nghiên cứu đặc trưng xét nghiệm hình thái sinh hóa tiếp tục khẳng định cách sử dụng hệ thống xác định vi khuẩn MicroLog 2.2 Phân lập sàng lọc DMHC VSV phân giải protein 11 vi khuẩn kháng BTEX sàng lọc với chất lượng cho việc sản xuất protease chúng thạch (SMA) chứa (g /l): sữa tách chất béo( sữa gầy), 12.0 thạch dinh dưỡng, 13.8 Các ủ 37◦C 24-48h Vi sinh vật sản xuất enzyme phân giải protein hình thành khu làm xung quanh khuẩn lạc đĩa SMA.Việc phân lập cho thấy kết tích cực SMA sau thử nghiệm để sản xuất enzyme chúng môi trường lỏng 2.3 Chọn lọc VSV kháng DMHC Sản xuất protease xác định hiếu khí 37 độ C 100ml dung dịch trung tính Môi trường phát triển trung tính bao gồm: (g/l): peptone (Type IV), 10,0; (NH4) 2SO4, 1.0; KH2PO4, 0.5; MgSO47H2O, 0.3; CaCl2.2H2O, 1.0; NaCl, 1.0; glycerol 10,0 ml 4ml chất cấy vi khuẩn 24h cấy vào 100ml môi trường tăng trưởng trung tính ủ 150rpm 37 độC Mẻ cấy lấy phương pháp ly tâm 12,000× g 4◦C cho 10 phút Dịch sau lọc màng lọc cellulose acetate (kích thước lỗ 0.22 µm) 1.0ml DMHC thêm vào 3.0ml dung dịch tế bào chai thông dụng ủ 37 độ C 30 phút với độ rung 150rpm Hoạt hóa protease thí nghiệm thay đổi phương pháp Keay Wildi 2.4 Khảo sát hoạt hóa protein Hoạt tính Caseinolytic đo dựa biến tính nhỏ phương pháp Keay Wildi Hỗn hợp phản ứng gồm 1,0 ml pha loãng dung dịch enzyme (enzyme:nước,1: 3) ủ trước 37◦C phút Các phản ứng bắt đầu việc bổ sung 1,0 ml casein 2,0%(w/v) pH 7,0.Hỗn hợp phản ứng sau ủ nồi hấp 37◦C 10 phút kết thúc việc bổ sung 2,0 ml 0,4 M trichloroacetic acid (TCA) Một máy trộn xoáy sử dụng để đảm bảo trộn hoàn chỉnh giai đoạn khác trình xét nghiệm.Hỗn hợp tiếp tục ủ 37◦C 20 phút, sau ly tâm 13.000 xg 10 phút.( Các dịch thu hoạch) Để 1.0 ml dịch , 5.0 ml 0.4 M Na2CO3 1.0 ml thuốc thử Folin ciocalteau : nước (1:3 v/v) thêm vào hh tạo màu xanh.Hỗn hợp màu ủ nồi hấp 37◦C 20 phút trước hấp thụ 660 nm Một "khoảng trống" chuẩn bị trình tương tự, TCA thêm vào sau casein sau 10 phút ủ Một đơn vị (U) protease tương đương với 0,5g tyrosine giải phóng 1,0 ml dung dịch enzyme điều kiện khảo sát Số lượng tyrosine xác định từ đường cong chuẩn tyrosine 2.5 Sản xuất enzyme Vi sinh vật phát triển nuôi cấy sau:4 ml chất cấy vi khuẩn 24h (OD 540 nm = 0.5) bơm vào 100 ml môi trường tăng trưởng giao động tốc độ 150 rpm 24 48 37◦C Các tế bào chưa phát triển dd enzyme chuẩn bị loại bỏ tế bào cách ly tâm12.000 × g 4◦C 10 phút Dịch thu hoạch kiểm định hoạt động phân giải protein Mỗi thí nghiệm thực lần lặp lại 2.6 Tác động DMHC tới độ ổn định proteaseProtease có chủng K kháng nhiều loại DMHC thử nghiệm môi trường (g/l) : sorbitol 10.0; axit casamino 10.0; natri nitrat 1.0; KH2PO4 0.50; CaCl2 2H2O 1.0; NaCl 1.0 Mg2SO4.7H2O 0.30 VSV nuôi cấy môi trường hiếu khí nông độ DMHC môi trường khác ly tâm với tốc độ quay 10000×g 4°C 10 phút Dịch lọc nhờ màng lọc cenllulose acetate ( kích thước lỗ 0.2µm) 1ml DMHC + 3ml dịch tế bào bảo quản 37°C, 150rpm 14 days Khảo sát độ ổn định protease nồng độ DMHC khác ( 0, 25, 50, 75 v/v ) kiểm tra Dịch tế bào với tỷ lệ DMHC khác rung lắc với150rpm 37°C 30 phút đựng chai thông dụng Đo phân giải protein hoạt hóa lại DMHC chọn để nói : 1-pentanol, benzen, ethylbenzene, toluene, decanol, isooctan, p-xylene, hexadecan, decane dodecane Mỗi thí nghiệm thực lần lặp lại Độ ổn định thể việc phân giải protein hoạt hóa lại liên quan đến việc kiểm soát môi trường chứa dung môi 3 Kết thảo luận 3.1 Phân lập sàng lọc DMHC VSV phân giải protein Dựa việc kiểm tra định tính SMA, tất 11 loại vi khuẩn cho thấy kết tích cực cách hình thành khu vực ly giải xung quanh khuẩn lạc SMA, phân lập tinh khiết Vì tất chủng phân lập báo cáo chịu BTEX , vi sinh vật có khả kháng DMHC xác định lựa chọn số vi sinh vật, hoạt động sản xuất phân giải protein cao có mặt 25% (v/v) benzen toluen môi trường lỏng Vì vậy, sở ổn định tương đối 25% (v/v) benzen toluen, chủng K chọn nhà sản xuất mạnh enzyme phân giải protein kháng DMHC 3.2 Nhận dạng VK Tính chất vi sinh vật dòng K xác định phương pháp mô tả hướng dẫn sử dụng hệ thống Vi khuẩn học Bergey Chủng K VK hiếu khí, gram âm, hình que vi khuẩn di chuyển Nó tiết sắc tố màu vàng-xanh tan nước thạch dinh dưỡng Chủng K có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản, phát triển pH trung tính nhiệt độ khoảng trung tính Trên sở đặc điểm hình thái, sinh hóa văn hóa đặc trưng liệt kê Bảng 1, phân lập chủng K xác định P aeruginosa Kết tiếp tục xác định cách sử dụng phần mềm MicroLog, Biolog Automated System MicroStation 3.3 Ảnh hưởng DMHC tới độ ổn định protease Khả hoạt hóa enzyme q.sát thấy có mặt DMHC đc nhiều ý thập kỷ qua Tuy nhiên có vài nghiên cứu thực để quan sát độ ổn định protease P.earuginosa có mặt nhiều loại DMHC Mt nước tạo thành từ xt sinh học truyền thống Trong năm gần đây, MT hữu xếp vào chất xt sinh học truyền thống Tuy nhiên, tác động độc tố DMHC nên việc lựa chọn DM để làm chất xúc tác hạn chế Mặc dù tương tác DM enzyme phức tạp nên có nhiều tượng phổ biến làm chất xt sinh học mt hữu • Xét ảnh hưởng DMHC độ ổn định protease o Với giá trị log P0/w từ 1.3 đến 3.5 môi trường nuôi cấy đc thêm vào dịch chất 1-pentanol, benzen, toluen, p-xylene n-hexane enzyme phân giải protein chủng K bị bất hoạt 35% so với đối chứng o Với giá trị log P0/w từ đến theo báo cáo gây độc cao cho tế bào thêm toluen o Với giá trị log P0/w từ đến 8.8 thêm vào dịch tế bào chất 1-decanol, isooctan, decane, dodecane hexadecan hoạt tính enzyme với độ ổn định 1.10, 1.59, 1.20, 1.49 1.52 lần tương ứng với chất thấy ổn định so với đối chứng Cũng thấy bảng enzyme protease sản xuất P.earuginosa chủng K otaj hóa tốt có mặt DMHC, đặc biệt với log P 0/w có giá trị lớn 4.0 theo báo cáo H.Ogino độ ổn định protease PST-01 có mặt DMHC Tuy nhiên protease PST-01đã bị bất hoạt không đáng kể nhiều loại DMHC việc kiểm soát sau ủ 14 days Đã có nhiều khó khăn việc tìm kiếm tham số tổng hợp DMHC để tương tác tốt với hoạt tính ezyme C.Laane thảo luận thông số khác tham số hòa tan Hilderbrand, số điện môi hệ số logaric phân vùng DM octanol nước (logP0/w) Họ kết luận tham số tốt liên quan đến hoạt tính enzyme với dung môi đối chứng tham số LogP0/w tham số sử dụng rộng rãi.Giá trị LogP 0/w thước đo dung môi phân cực kị nước, LogP0/w xác định hệ số phân vùng DM octanol-nước pha hệ thống Độc tính DMHC tỷ lệ nghịch với tham số LogP 0/w DM ( dm kị nước) có giá trị LogP0/w cao gây bất hoạt chất xt simh học so với dm có giá trị LogP 0/w thấp Theo phát (ở báo này), DM phân cực yếu tố định độ ổn định chất xt sinh học Tuy nhiên số trường hợp, không tương tác tốt với giá trị LogP 0/w A.S Ghatorae báo cáo liên quan đến việc gây bất hoạt ảnh hưởng DM khác đến enzyme mà không theo xu hướng Đặc biệt, mối quan hệ đơn giản DM phân cực( dù đo logP0/w hay tham số khác) tỷ lệ bất hoạt thông qua DM hòa tan hay chế bề mặt Theo báo cáo A.Laane ghi LogP 0/w hoạt động tương tác quan sát biến đổi VK tượng phổ biến giải thích khác biệt thành phần vốn có DMHC để làm sai lệch yếu tố cần thiết lớp nước xung quanh chất xt sinh học Họ tìm tương tác tốt tỷ lệ epoxidation độ phân cực hệ số phân cực LogP0/w thực số phân cực dung môi Có thể kết luận hoạt tính epoxidation: o o o có LogP0/w < 2: thấp < LogP0/w < : biến đổi yên tĩnh LogP0/w >4 : cao DMHC có giá trị LogP0/w nghiên cứu bảng 2: Hình 2: cho thấy hoạt hóa protease lại tiếp xúc với DMHC tương đối so với không chứa dung môi đối chứng Ảnh hưởng tỷ lệ khác DMHC khác cho chủng K đc nghiên cứu ... 1-pentanol, benzen, ethylbenzene, toluene, decanol, isooctan, p-xylene, hexadecan, decane dodecane Mỗi thí nghiệm thực lần lặp lại Độ ổn định thể việc phân giải protein hoạt hóa lại liên quan đến... chất 1-decanol, isooctan, decane, dodecane hexadecan hoạt tính enzyme với độ ổn định 1.10, 1.59, 1.20, 1.49 1.52 lần tương ứng với chất thấy ổn định so với đối chứng Cũng thấy bảng enzyme protease. .. hoạt tính ezyme C.Laane thảo luận thông số khác tham số hòa tan Hilderbrand, số điện môi hệ số logaric phân vùng DM octanol nước (logP0/w) Họ kết luận tham số tốt liên quan đến hoạt tính enzyme