lai phan tu molecularbiology

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM “Chuyên đề: Kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc ứng dụng kiểm tra động vật chuyển gen Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH Thái Nguyên, 2014 • Đặt vấn đề • Nội dung • Kết luận Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH Đặt vấn đề • Động vật chuyển gen: động vật có hệ gen bị biến đổi cách đưa thêm DNA ngoại lai gắn vào hệ gen Đoạn DNA ngoại lai dùng để đưa vào khác gọi gen chuyển • Để khẳng định ĐV có chuyển gen lạ vào hay không người ta phải kiểm tra xem có gen lạ xâm nhập vào máy di truyền động vật hay không Phương pháp thường hay sử dụng kỹ thuật lai phân tử pha rắn (Southern blot, Nouthern blot….) Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH Hình ảnh số động vật chuyển gene Mèo phát sáng Cá gấu trúc phát sáng Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH Hình ảnh số động vật chuyển gene Dê tạo tơ nhện Lợn thân thiện với môi trường Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH Nội dung Khái niệm lai phân tử Các phương pháp lai phân tử Các phương pháp khác Kết luận Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 1.Khái niệm lai phân tử • Lịch sử: - 1960 Julius Marmur đồng nghiệp ông quản lý ngành học Đại học Harvard khám phá trình ủ lại (reannealing).Quá trình bao gồm kết hợp mạch đơn thành phân tử mạch đôi bền vững Từ khám phá trình reannealing phương pháp lai nucleic phát triển - Sử dụng kỹ thuật mạch bổ sung từ nguồn khác acid nucleic trọn lẫn thành dạng phân tử mạch đôi đặt tên thể lai (hybrid) Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 1.Khái niệm lai phân tử => Việc lai phân tử mở rộng nhiều kỹ thuật khác dùng vào mục đích đa dạng với mục đích sử dụng lai DNA kỹ thuật so sánh dùng cặp base bổ sung để đối chiếu gene chứa toàn nội dung di truyền loài khác đánh giá điểm tương đồng chúng Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 1.Khái niệm lai phân tử *Cơ sở lai phân tử : biến tính hồi tính DNA Khi phân tử DNA mạch đôi đun lên nhiệt độ vượt “nhiệt độ nóng chảy Tm mạch đơn tách rời phá vỡ liên kết Hydro nối liền mạch Sau mạch tách rời, nhiệt độ phản ứng làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng bắt cặp trở lại Hiện tượng gọi lai phân tử * Đặc điểm lai phân tử: -Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp xảy trình tự có trình tự hoàn toàn bổ sung -Các trình tự bổ sung DNA hay RNA dẫn đến hình thành phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay phân tử lại DNA-RNA Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 1.1 Các nhân tố ảnh hưởng đến lai phân tử  - Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA - Ảnh hưởng của độ dài DNA - Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch) - Ảnh hưởng của môi trường phản ứng Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 2.2.2 Phương pháp Nouthern blot Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 2.2.3 Phương pháp Western blot • Là phương pháp có độ nhạy cao dựa tính đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể để phát protein điện di gel SDS-PAGE chuyển lên màng lai • Phương pháp cho phép xác định có mặt, trọng lượng phân tử, định lượng protein có mặt mẫu khác * Các bước thực hiện: • Protein phân tách điện di gel SDS-PAGE • Các pr chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí phân tách gel • Ủ màng lai với kháng thể sơ cấp • Tiếp tục ủ màng lai hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme • Đặt phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát SVTH : Nhóm - Lớp điểm sáng phát doNhóm enzyme 43CNSH 2.2.3 Phương pháp Western blot Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 2.2.4. Dot slot blot  Mục đích: Định lượng tương đối cho 1 RNA đặc trưng trong 1 hỗn  hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng ra. Phương pháp này  có thể sử dụng cho RNA.  Đặc điểm: Trong phương pháp này người ta không chuyển acid nulceic từ gel lên  mà mà đặt trực tiếp 1 lượng mẫu nhỏ lên màng lai ( thành 1 điểm_Do t hay 1 khe_Slot).  Bản phóng xạ tự ghi sau đó đươc phân tích bằng kỹ  thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong  mẫu. Trong thực nghiệm, người ta sử dụng một dụng cụ ( tên là manif old) cho phép đặt một lúc nhiều mẫu DNA hay RNA lên màng lai.  Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 3.Các phương pháp khác • • • • Lai chỗ Lai khuẩn lạc Lai NST Lai tế bào mô Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 3.1 Lai chỗ *Định nghĩa: + Lai chỗ kiểu lai phân tử trình tự cần tìm nằm tế bào hay mô + Lai chỗ sử dụng để định vị đoạn acid nucleic bổ sung với mẫu dò đánh dấu đặc thù NST tế bào sinh vật nhận thật tế bào vi khuẩn *Nguyên tắc: Nghiên cứu acid nucleic mà không cần giai đoạn tách chiết chúng khỏi mô hay tế bào Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 3.2 Lai khuẩn lạc *Mục đích: Dùng để phát dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cần tìm ngân hàng gen *Các bước tiến hành: - Mỗi khuẩn lạc để lại vài tế bào vi khuẩn màng lai - Màng lai sau xử lý NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn làm biến tính DNA - Việc cố định màng lai thao tác lai diễn biến theo bước tương tự phương pháp lai pha rắn - Kết phóng xạ tự ghi dấu ấn cho phép định dòng vi khuẩn cần tìm hộp petri ban đầu Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 3.2 Lai khuẩn lạc Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 3.3 Lai NTS *Mục đích: Cung cấp thông tin xác vị trí phân bố trình tự DNA cần tìm NST nhờ mẫu dò chuyên biêt *Các bước thực hiện: • Các NST giai đoạn trung kỳ (các NST thường có nguồn gốc từ bạch cầu) xử lý kỹ thuật tế bào học lame • NTS cố định lame đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ • Để phát phân tử lai, người ta phủ lên lame dịch huyền nhạy cảm với tia xạ Sau thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch Lame quan sát kính hiển vi, kết thể thành hạt nằm lớp huyền dịch vị trí có phân tử lai Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 3.3 Lai NTS Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 3.4 Lai tế bào mô *Mục đích: Nghiên cứu chức điều hòa biểu gen tương tác mRNA với thành phần khác tế bào mô *Ứng dụng: - Trong đối tượng nghiên cứu phức tạp bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác não - Xác định mối tương quan hoạt động phiên mã dịch mã gen Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH 4.Kết luận • Những phần trình bày kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc ứng dụng kiểm tra động vật chuyển gen • Các phương pháp lai phân tử có ý nghĩa việc kiểm tra động vật chuyển gen nên việc ứng dụng phương pháp sử dụng phổ biến Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH Tài liệu tham khảo Bài giảng CNSHĐV, TS Nguyễn Văn Duy, khoa CNSH & CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên “Công nghệ sinh học người động vật”, (2007), Phan Kim Ngọc, NXB Giáo dục Bài giảng “ Công nghệ sinh học thú y”,GS.TS Nguyễn Quang Tuyên, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên http://tailieu.vn http://vcn.v.nn.vn/ http://violet.vn/main/ Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH Cảm ơn thầy giáo bạn ý lắng nghe Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH Thành viên nhóm Mạc Văn Dương Nguyễn Thị Thanh Dung 3.Đỗ Thị Hào 4.Nguyễn Thị Hằng 5.Mông Thị Hương Lý Thị Liễu Nhóm SVTH : Nhóm - Lớp 43CNSH