Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)

Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá (tt)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÁO CÁO TÓM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ Mã số: ĐH2014-TN05-01 Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Huy Hoàng THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÁO CÁO TÓM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ Mã số: ĐH2014-TN05-01 Xác nhận tổ chức chủ trì (ký họ tên, đóng dấu) THÁI NGUYÊN - 2017 Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) i DANH SÁCH THÀNH VIÊN, ĐƠN VỊ THAM GIA ĐỀ TÀI I Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu STT Họ tên ThS Nguyễn Huy Hoàng PGS TS Lê Văn Sơn TS Phạm Bích Ngọc TS Nguyễn Thu Hiền TS Nguyễn Thị Thu Ngà II Đơn vị phối hợp STT Tên đơn vị Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Đơn vị công tác Đại học Y Dược - ĐHTN Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Đại học Y Dược - ĐHTN Đại học Sư phạm - ĐHTN Họ tên người đại diện PGS TS Chu Hoàng Hà MỤC LỤC DANH SÁCH THÀNH VIÊN, ĐƠN VỊ THAM GIA ĐỀ TÀI……………………………………………… i MỤC LỤC ii THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU iii MỞ ĐẦU………………………………………………………………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………………………………………1 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………………2 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………………………………… 3.1 Thay đổi mã di truyền gene Interleukin tối ưu biểu thực vật 3.2 Thiết kế vector chuyển gene Interleukin tái tổ hợp vào thuốc .3 3.3 Biểu protein Interleukin tái tổ hợp thuốc phương pháp Agro-Infiltration 3.4 Đánh giá biểu tạm thời protein IL-7 tái tổ hợp 3.5 Phân tích định lượng tinh protein IL-7 tái tổ hợp 3.6 Đánh giá hoạt tính sinh học protein IL-7 tái tổ hợp Chương BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Biểu tăng cường protein Interleukin tái tổ hợp thuốc 4.2 Tăng cường biểu protein thực vật với ELP tinh mITC 10 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ…………………………………………………………………………… 11 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Đơn vị: Trường Đại học Y Dược THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung: Tên đề tài: Thiết kế vector chuyển gene interleukin bước đầu đánh giá biểu protein thuốc Mã số: ĐH2014-TN05-01 Chủ nhiệm: ThS Nguyễn Huy Hoàng Cơ quan chủ trì: Đại học Y Dược Thái Nguyên Thời gian thực hiện: 2014 - 2017 Mục tiêu: Thiết kế vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin tái tổ hợp Tạo thuốc biểu protein interleukin Kết nghiên cứu: Thiết kế cấu trúc vector chuyển gene biểu protein tái tổ hợp thực vật Biểu thành công protein thực vật phương pháp Agro-infiltration Đã đánh giá hoạt tính sinh học protein IL-7 tái tổ hợp Sản phẩm: 4.1 Sản phẩm khoa học: 03 báo đăng tạp chí khoa học, 01 trình tự gen đăng kí Ngân hàng gen - Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Giang, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn (2014), “Interleukin vai trò hệ thống miễn dịch người”, Tạp chí Khoa học Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, Tập 118 số 04, tr 153-156 - Nguyễn Huy Hoàng, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn (2015), “Thiết kế vector mang cấu trúc gen Interleukin phục vụ chuyển gen hệ thống thực vật”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Đại học Thái Nguyên, Tập 134 số 04, tr 25-28 - Nguyễn Huy Hoàng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2017), “Biểu tạm thời protein Interleukin tái tổ hợp thuốc (Nicotiana benthamiana domin) phương pháp AgroInfiltration”, Tạp chí Sinh học, Tập 39 số 02, tr 232-238 - Hoang,N.H, Ha,C.H., Ngoc,P.B and Son,L.V (2017), IL7 human gene is optimized genetic codes which will be expressed in plants, GenBank: MF170526.1 4.2 Sản phẩm đào tạo 4.3 Sản phẩm ứng dụng 01 quy trình thiết kế vector tái tổ hợp mang gene mã hóa protein IL-7 sản phẩm vector tái tổ hợp 01 quy trình biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn Agrobacterium 01 quy trình biểu protein tái tổ hợp thực vật phương pháp Agro-infiltration Hiệu quả: Khoa học công nghệ: Đề tài hoàn thành góp phần hoàn thiện phương pháp sản xuất protein interleukin tái tổ hợp phục vụ y học Thông tin: Cung cấp thông tin giá trị loại cytokin nói chung interleukin, có interleukin nói riêng hệ thống miễn dịch người Nâng cao lực nghiên cứu người tham gia, đặc biệt với chủ nhiệm đề tài Bổ sung 01 tài liệu tham khảo phục vụ cho việc nghiên cứu, giảng dạy học tập học viên, sinh viên chuyên ngành Di truyền học Khả áp dụng phương thức chuyển giao kết nghiên cứu: Đề tài cung cấp quy trình biểu protein interleukin tái tổ hợp thuốc chuyển gene quy mô phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục đích nuôi cấy thu sinh khối tế bào Bước đầu đánh giá hoạt tính sinh học protein interleukin tái tổ hợp thu sau tinh sạch, tiền đề cho nghiên cứu sâu Ngày 14 tháng năm 2017 Cơ quan chủ trì Chủ nhiệm đề tài INFORMATION ON RESEARCH RESULTS General information: Project title: Research on expressing the recombinant interleukin protein in plant culture systems Code number: ĐH2014-TN05-01 Coordinator: Nguyen Huy Hoang, MA Implementing institution: Thai Nguyen university of Medicine and Pharmacy Duration: from 2014 to 2017 Objective(s): - Design the recombinant interleukin encoded gene transferred the plant culture systems culture systems - Generates tobacco expressing protein interleukin Research results: - Design of two transgenic vector constructs and recombinant protein expression in plants - Successfully expression of protein in plants by Agroinfiltration - The recombinant IL-7 protein was evaluated bioactivity Products: 4.1 Scientific product: 03 articles published scientific journals, 01 sequence has been registered on the genebank - Nguyen Huy Hoang, Nguyen Thu Giang, Chu Hoang Ha, Phạm Bich Ngoc, Le Van Son (2014), “Interleukin and role in the immune system of humans”, TNU-Journal of scrience and technology, 118 (04), pp 153-156 - Nguyen Huy Hoang, Chu Hoang Ha, Pham Bich Ngoc, Le Van Son (2015), “Vector construction contained structure interleukin-7 in plant”, TNU-Journal of scrience and technology, 134 (04), pp 25-28 - Nguyen Huy Hoang, Pham Bich Ngoc, Le Van Son, Chu Hoang Ha (2017), “Transient expression of a taste-modifying protein, interleukin-7, in nicotiana benthamiana using agro-infiltration”, Journal of biology, 39 (02), pp 232-238 - Hoang,N.H, Ha,C.H., Ngoc,P.B and Son,L.V (2017), IL7 human gene is optimized genetic codes which will be expressed in plants, GenBank: MF170526.1 4.2 Training product 4.3 Application product: 01 recombinant vector design process carrying genes encoding interleukin protein and recombinant vector product 01 recombinant vector transformation process into Agrobacterium 01 process of recombinant protein expression in plants by method Agroinfiltration Effects: Science and Technology: The completed project will contribute to the improvement of the methods of recombinant interleukin production in medicine Information: Provides information on the value of cytokines and interleukins, including interleukin in particular in human immune systems Improve the research capacity of the participants, especially the leader Additional 01 reference material for the research, teaching and learning of students, specialized students in Genetics Transfer alternatives of reserach results andapplic ability: The subject has provided a process for expression of interleukin recombinant protein in transgenic tobacco plants in a laboratory scale for cell culture purposes Initial evaluation of the bioactivity of the recombinant interleukin protein obtained after purification, is the premise for further research 1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngày nay, chất lượng sống nâng cao vấn đề chăm sóc sức khỏe ngày quan tâm, coi trọng Tuy nhiên, người phải đối mặt với nhiều bệnh nguy hiểm HIV, AIDS, tiểu đường, SARS, ebola v.v… Trong đó, việc điều trị chủ yếu sử dụng thuốc theo giai đoạn diễn biến bệnh nên tính hiệu không cao mang tính cầm cự Interleukine nhóm cytokine tìm thấy tế bào bạch cầu Chức hệ thống miễn dịch người phụ thuộc chủ yếu vào Interleukine Trong đó, nhóm Interleukine (IL7) cytokine có vai trò tăng trưởng dòng tế bào B T [3] Đây dòng tế bào có chức quan trọng hệ miễn dịch người, tế bào đích công virus, mầm bệnh xâm nhập vào thể người Trong y học ngày nay, protein có hoạt tính sinh học sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị loại hormone, enzyme tái tổ hợp Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất loại protein chủ yếu tách chiết từ phận động vật Tuy nhiên, nhu cầu ngày cao nguồn cung từ động vật hạn chế, giá thành lại đắt dễ nhiễm mầm bệnh nguy hiểm cho người Do đó, việc tổng hợp protein tái tổ hợp đặt cách cấp thiết Trong thập niên gần đây, với bước tiến lớn lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không khó khăn trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học Mặc dù số protein tổng hợp đường hoá học song phương pháp tổng hợp sinh học thể tính tối ưu thực tiễn cao Thực tế phương pháp áp dụng rộng rãi để tổng hợp số loại protein làm thuốc insulin, hormone tăng trưởng v.v… mà để tổng hợp nhiều hợp chất khác nguồn nguyên liệu hạn chế đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn Hiện nay, biểu protein tái tổ hợp thực vật quan tâm nghiên cứu ưu điểm vượt trội so với hệ thống biểu khác chúng sinh trưởng môi trường tương đối đơn giản, protein tiết môi trường nhiều phần tích luỹ tế bào nên việc thu hồi tinh dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho người so với protein có nguồn gốc từ hệ thống nuôi cấy khác mầm bệnh virus thực vật tác nhân gây bệnh người Nhằm mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng liệu pháp sinh học góp phần hoàn thiện phương pháp nghiên cứu sản xuất cytokine nói chung interleukine nói riêng cách tối ưu Căn vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép với phương pháp khả thi, định lựa chọn thực đề tài luận án: “Thiết kế vector chuyển gene interleukin bước đầu đánh giá biểu protein thuốc lá” Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin Tạo thuốc biểu protein interleukin Nội dung nghiên cứu Tối ưu mã di truyền gene interleukin biểu thực vật Thiết kế gen mã hóa interleukine vào vector chuyển gen phù hợp với hệ thống nuôi cấy thực vật Chuyển cấu trúc gen vào thuốc Phân tích, đánh giá chất lượng interleukine tái tổ hợp thu Cấu trúc đề tài Đề tài gồm 82 trang, bảng 16 hình Sử dụng 107 tài liệu tham khảo, gồm tài liệu tiếng Việt 104 tài liệu tiếng Anh CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đề tài tham khảo tổng kết 107 tài liệu, vấn đề liên quan: (1) Interleukin 7; (2) Tình hình nghiên cứu ứng dụng loại cytokine tái tổ hợp y học; (3) Nghiên cứu biểu interleukin tái tổ hợp thuốc Interleukine nhóm cytokine, đóng vai trò quan trọng hệ miễn dịch người Chúng có chức điều hoà miễn dịch, bao gồm phát triển tế bào, trưởng thành, di chuyển bám dính Ngoài ra, chúng có khả kích hoạt phản ứng miễn dịch thể (Chad et al., 2010) Interleukine gồm chuỗi glycoprotein xoắn 4α, có khối lượng phân tử 17,4 kDa ổn định gốc N - glycosyl hóa O - glycosyl hóa cầu nối disulfide nội phân tử (Yoseph et al., 2016) Ở người, gen hIL-7 có kích thước 33Kb, gồm có exon intron nằm nhiễm sắc thể số 8, vị trí 8q21.13 Hiện nay, việc nghiên cứu sử dụng loại cytokine tái tổ hợp mở hướng điều trị tích cực y học Hàng loạt cytokine khác nghiên cứu, sản xuất thử nghiệm điều trị lâm sàng như: hIL-2, hIL-7, IFN-a, G-CSF, GM-CSF, hIL-11 EPO (Kwon et al., 2003) Các loại cytokine có vai trò quan trọng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu không đặc hiệu, hướng nghiên cứu tập trung vào tác dụng điều trị cytokine tác nhân dược lý đích tác động quan tâm nghiên cứu Chính lý nên yêu cầu cấp bách đặt phải hoàn thiện quy trình hệ thống thu nhận cytokine tái tổ hợp nói chung interleukine nói riêng, phục vụ y học Các hệ thống biểu thường sử dụng như: hệ thống vi khuẩn, hệ thống biểu tế bào huyền phù BY2, hệ thống biểu rễ tơ hệ thống biểu tạm thời thực vật Trong đó, hệ thống biểu thực vật thể khả ưu việt so với hệ thống khác như: khả tạo sinh khối, khả thu nhận protein tái tổ hợp, tốn công chăm sóc v.v… Đặc biệt mầm bệnh, virus thực vật đối tượng gây bệnh cho người, nên phù hợp để biểu loại protein tái tổ hợp người phục vụ y học CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Đề tài sử dụng dòng tế bào thuốc BY2 (Nicotiana tabacum L Cv Bright Yellow 2), thuốc N benthamiana N tabacum K326 phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp Các chủng vi khuẩn E coli DH-5α, A tumefaciens, A rhizogenes, E.coli Rosetta-gami B Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt nam cung cấp Tế bào 2E8 Ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC cung cấp Các vector: pBSK, pK7WG2D.1, pCB301, pRTRA 35S-TBAG-100xELP, pENTRTM221/cal nhận từ Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.2 Hóa chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu Hóa chất, KIT sử dụng hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Promega… Các loại enzyme sử dụng hãng Fermentas: BamHI, NcoI, HindIII, T4 ligase…Các thí nghiệm nghiên cứu luận án thực Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Luận án hoàn thành Bộ môn Sinh học đại Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp thay đổi mã di truyền gen interleukin tối ưu biểu protein thực vật Khai thác trình tự nucleotide trình tự mRNA Tiến hành thay codon gen IL-7 codon phổ biến thực vật Thêm trình tự cmyc, histag, vị trí nhận biết enzyme giới hạn vào trình tự Sử dụng BioEdit kiểm tra trình tự nucleotide trình tự acid amin trước sau đổi mã 2.3.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen interleukin tái tổ hợp Trong nội dung đề tài, thiết kế vector chuyển gen: (1) pRTRA 35S-IL7-100xELP; (2) pCB301_IL7/ELP 2.3.3 Phương pháp biểu gen thuốc Phương pháp chuyển gen vào thuốc thực gián tiếp thông qua A rhizogene theo phương pháp Topping (1998) 2.2.4 Nhóm phương pháp phân tích dòng chuyển gen Kiểm tra có mặt gen chuyển kỹ thuật PCR, xác định protein tái tổ hợp lai miễn dịch Western blot Phân tích biểu protein điện di protein theo Laemmli (1970) Western blot Định lượng protein IL-7 tái tổ hợp ELISA theo phương pháp Sun cs (2006) Protein tinh theo phương pháp IMAC mITC đánh giá hoạt tính sinh học dòng tế bào 2E8 3 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Thay đổi mã di truyền gene Interleukin tối ưu biểu thực vật Chúng sử dụng trình tự gene interleukin người công bố Ngân hàng Gene có mã số: J04156.1 bảng tần suất codon phổ biến thực vật (Codon Usage Database) [36], với phần mềm Codon Optimization 2.0 để loại bỏ thay khoảng 10% codon gen IL-7 codon phổ biến thực vật mà không làm thay đổi thành phần trật tự acid amin Ngoài ra, tiến hành loại bỏ trình tự ATTTA gen IL-7 cho gây bất ổn trình phiên mã mRNA, kết hợp sử dụng phần mềm Invitrogene để giảm thiểu hình thành cấu trúc mRNA thứ cấp Kết hình 3.1 cho thấy, thay đổi thành công mã di truyền gene interleukin để phù hợp nâng cao hiệu biểu thực vật mà không làm thay đổi trình tự acid amin so với gene gốc, với độ tương đồng nucleotide 63,6 %, độ tương đồng acid amin 100% Ngoài ra, để chuẩn bị cho việc cắt ghép nối gene trình thiết kế vector chuyển gene, trình tự nhận biết enzyme giới hạn NcoI, SacI, HindIII thêm vào đầu 5’ 3’ gene interleukin Đồng thời, thêm trình tự nucleotide mã hóa cho protein c-myc epitope his-tag gắn vào đầu 3’ gene Trình tự nucleotide gene interleukin sau tối ưu có kích thước 536bp, đặt tổng hợp nhân tạo hãng Epoch Life Science (Hoa Kỳ) nhân dòng vector pBSK/IL7 3.2 Thiết kế vector chuyển gene interleukin tái tổ hợp vào thuốc 3.2.1 Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP Cấu trúc vector chuyển gene pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP mô hình 3.2 Hình 3.2 Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP Chúng tiến hành nhân gene IL-7 từ vector pBSK/IL7 phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F IL7_BamHI_R Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 0,8% Kết thể hình 3.3.A cho thấy, thu băng có kích thước khoảng 564bp Vector pRTRA 35S/TBAG-histag-cmyc-100xELP xử lý với enzyme cắt giới hạn BamHI điện di kiểm tra gel agarose 0,8% Kết thể hình 3.3.B cho thấy, đường chạy xuất băng có kích thước khoảng 5051 bp 1152 bp tương ứng với kích thước vector pRTRA 35S-histagcmyc-100xELP mở vòng gene TBAG theo tính toán lý thuyết Chúng tiến hành gel tinh đoạn DNA có kích thước 5051 bp để sử dụng cho thí nghiệm A B C D Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gene pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP (A) Kết PCR nhân gene IL-7 IL7_BamHI_F IL7_BamHI_R; (B) Kết cắt vector pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP enzyme BamHI; (C): Kết colony PCR cặp mồi 35S-SQF IL7_BamHI_R, 1-10: mẫu khuẩn, (-) Đối chứng âm (pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP), (+) Đối chứng dương (pBSK/IL7); (D) Kết cắt kiểm tra vector pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP enzyme giới hạn BamHI Tiến hành lai ghép gene IL-7 vào vector pRTRA 35S-histag-cmyc-100xELP tạo vector tái tổ hợp pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP với xúc tác enzyme T4 ligase 220C 30 phút Plasmid tái tổ hợp biến nạp vào tế bào E.coli DH 5α để nhân dòng phương pháp sốc nhiệt 4 Để chọn lọc dòng khuẩn lạc mọc môi trường chọn lọc có mang vector chứa gene mã hóa protein IL-7, thực phản ứng colony PCR với cặp mồi đặc hiệu để check chiều 35S-SQF IL7_BamHI_R Kết thể hình 3.3.C cho thấy, 10 dòng khuẩn lạc thí nghiệm, có dòng 2, 4, 5, 7, 8, dương tính với băng có kích thước khoảng 0,8kb gồm kích thước gene mã hóa protein IL-7 (564bp) cộng kích thước đoạn promoter (250bp) Để loại bỏ khả dương tính giả phản ứng colony PCR, tiến hành tách plasmid khuẩn lạc dương tính thực phản ứng cắt enzyme cắt giới hạn BamHI Theo tính toán lý thuyết, vector pRTRA tái tổ hợp cắt enzyme giới hạn BamHI cho băng kiểm tra gel agarose 0,8% Tại đường chạy hình 3.3.D xuất băng có kích thước khoảng kb 0,56 kb tương ứng với kích thước vector pRTRA mở vòng (5051bp) gene IL-7 (564bp) Cấu trúc biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α để nhân dòng sử dụng làm nguyên liệu để thiết kế vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 3.2.2 Thiết kế vector chuyển gene pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP Plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP pCB301 xử lý đồng thời enzyme cắt giới hạn HindIII Với plasmid pBC301 để tránh tượng tự đóng vòng, sản phẩm cắt với enzyme HindIII sau tinh xử lý tiếp enzyme SAP Các sản phẩm cắt điện di kiểm tra gel agarose 0,8% Trên hình 3.4.A cho thấy, đường chạy (sản phẩm cắt pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP) xuất băng có kích thước khoảng 2.9 kb 2.6 kb; đường chạy (sản phẩm cắt pCB301 xử lý qua SAP) có băng có kích thước khoảng 5.6 kb Điều chứng tỏ cắt thành công plasmid pRTRA 35S/IL7cmyc-histag-100xELP pCB301 HindIII Tiến hành gel, tinh phân đoạn DNA có kích thước 2.9 kb 5.6 kb chuẩn bị cho thí nghiệm Tiến hành phản ứng lai ghép casette 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào vector mở vòng pCB301 tạo vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP tái tổ hợp biến nạp phương pháp sốc nhiệt vào vi khuẩn E.coli DH5α để chọn lọc, nhân dòng Chọn khuẩn lạc mọc môi trường chọn lọc, tiến hành phản ứng colony PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F IL7_BamHI_R, kết thể hình 3.4.B cho thấy, đường chạy xuất băng có kích thước khoảng 564bp tương ứng với kích thước gene IL-7 theo tính toán lý thuyết Để tránh khả dương tính giả PCR, tiến hành tách plasmid cắt kiểm tra enzyme giới hạn HindIII Kết thể hình 3.4.C, đường chạy xuất hai băng có kích thước khoảng 2.9 kb 5.6 kb theo kích thước tính toán lý thuyết Điều chứng tỏ thiết kế thành công vector pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP tái tổ hợp A B C Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gene pCB301/IL7/100xELP (A) Kết xử lý vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vector pCB301 enzyme giới hạn HindIII; (B) Kết kiểm tra colony PCR pCB301/IL7-cmyc-histag-100xELP cặp mồi IL7_BamHI_F IL7_BamHI_R, (-) Đối chứng âm (pCB301), (+) Đối chứng dương (pBSK/IL7); (C) Kết cắt kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP enzyme giới hạn HindIII Do sử dụng enzyme cắt giới hạn tạo đầu dính vector pCB301 cassette 35S/IL7histag-cmyc-100xELP nên sử dụng enzyme giới hạn NcoI để kiểm tra chiều cassette chuyển vào so với chiều vector pCB301 Vector pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP tái tổ hợp có hai vị trí nhận biết enzyme giới hạn NcoI, vị trí nằm vector vị trí nằm cassette, xử lý NcoI cho băng có kích thước khác tùy theo cassette gắn xuôi chiều hay ngược chiều với vector pCB301 Hình 3.5 Kết kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP enzyme NcoI M Thang DNA chuẩn kb; Sản phẩm cắt ngược chiều; Sản cắt xuôi chiều Kết thể hình 3.5 cho thấy, đường chạy xuất băng có kích thước khoảng 3.6 kb 4.9 kb tương ứng với kích thước tính toán lý thuyết cassette gắn ngược chiều với chiều vector pCB301, đường chạy xuất băng có kích thước khoảng 6.9 kb 1.6 kb tương ứng với trường hợp cassette gắn xuôi chiều với vector pCB301 Sau đó, lựa chọn vector tái tổ hợp có chứa cassette ngược chiều sau cắt kiểm tra để biến nạp vào tế bào A.tumefaciens C58C1 xung điện để chuẩn bị cho thí nghiệm 3.3 Biểu protein interleukin tái tổ hợp thuốc phương pháp Agro-infiltration 3.3.1 Tạo dòng tế bào A.tumefaciens C58C1/pGV2260 mang vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag100xELP Từ kết mục 3.2.5, vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP tái tổ hợp thiết kế thành công, chuyển vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58C1/pGV2260 phương pháp xung điện (mục 2.2.3.2.f) Sản phẩm trình biến nạp cấy trải môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh rifamycin 50 mg/l, carbemycin 50 mg/l kanamycin 50 mg/l ngày Chúng lựa chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ, tròn phát triển môi trường chọn lọc để kiểm tra phản ứng colony PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F IL7_BamHI_R phản ứng cắt enzyme giới hạn NcoI Kết thể hình 3.6 3.7 Hình 3.6 Kết colony PCR cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R M Thang DNA chuẩn kb; - Các dòng khuẩn lạc; (-) Đối chứng âm; (+) Đối chứng dương Trên hình 3.6 cho thấy, đường chạy - xuất băng có kích thước khoảng 564 bp, tương ứng với kích thước gene IL-7 nhân cặp mồi IL7_BamHI_F IL7_BamHI_R, đồng thời giếng đối chứng âm băng nào, đối chứng dương plasmid pBSK/IL7 xuất băng kích thước khoảng 564 bp Điều chứng tỏ phản ứng colony PCR thành công mẫu không bị nhiễm 6 Hình 3.7 Kết cắt kiểm tra enzyme giới hạn NcoI Để khẳng định chắn cho kết luận, tiến hành tách plasmid dòng khuẩn dương tính với phản ứng colony PCR cắt enzyme giới hạn NcoI Kết hình 3.7 cho thấy, đường chạy số xuất hai băng có kích thước khoảng 3,6 kb 4,9 kb theo tính toán lý thuyết vector pCB301 cassette 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP Từ kết cho thấy biến nạp thành công vector pCB301 35S/IL7-cmychistag-100xELP vào vi khuẩn A.tumefaciens C58C1/pGV2260 3.3.2 Biểu tạm thời protein IL-7 phương pháp Agro-infiltration Quá trình biến nạp vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào thuốc thực theo quy trình trình bày mục 2.2.4 Sau ngày biến nạp, tiến hành thu lá, bảo quản -800C để chuẩn bị cho thí nghiệm kiểm tra có mặt vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP biểu tạm thời protein IL-7 tái tổ hợp với hỗ trợ protein Hc-Pro ức chế chế câm gene hoạt động phương pháp western blot 3.4 Đánh giá biểu tạm thời protein IL-7 tái tổ hợp Để kiểm tra biểu protein IL-7 tái tổ hợp, tiến hành tách chiết protein tổng số đo nồng độ theo phương pháp Bradford (1976), sau sử dụng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot vị trí biểu tạm thời non, bánh tẻ già Qua thực nghiệm, nhận thấy khả biểu protein IL-7 tái tổ hợp khác có độ tuổi khác nhau, biểu mạnh non; điều giải thích non có tốc độ sinh trưởng mạnh, sinh tổng hợp protein mạnh so với bánh tẻ già Kết thể hình 3.9 cho thấy đường chạy 1, 2, xuất băng có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein IL-7 tái tổ hợp theo tính toán lý thuyết, đường chạy đối chứng âm, thuốc không chuyển gene không xuất băng Hình 3.9 Kiểm tra biểu protein IL-7 tái tổ hợp thuốc Western blot M Thang protein chuẩn (4 - 20% tris-glycine SDS-PAGE); Lá non, Lá bánh tẻ, Lá già; (-) Đối chứng âm (lá thuốc không chuyển gene) 3.5 Phân tích định lượng tinh protein Il-7 tái tổ hợp Sau biểu thành công protein IL-7 tái tổ hợp thuốc lá, tiến hành tinh protein phương pháp sắc ký ion cố định kim loại (niken) để tinh định lượng protein IL-7 tái tổ hợp Đây phương pháp hiệu để tinh protein tái tổ hợp liên kết với his-tag Phương pháp dựa nguyên lý histidine tạo phức hợp với kim loại hoá trị II (niken) nồng độ pH trung tính Sự tương tác protein liên kết his-tag với kim loại phụ thuộc vào nồng độ pH Protein đích sau liên kết với cột tinh sạch, hoà tan thu lại cách giảm pH dung dịch tăng nồng độ đệm ion nồng độ đệm EDTA imidazole Sau tinh sạch, kiểm tra biểu protein IL-7 tái tổ hợp điện di SDSPAGE phương pháp lai miễn dịch Western blot Kết thể hình 3.10 cho thấy, thu băng protein có kích thước khoảng 64 kDa, theo tính toán lý thuyết Hình 3.10 Kết tinh định lượng protein IL-7 phương pháp IMAC (A) Điện di SDS-PAGE: 1A Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2A Dịch chiết thu nhận sau qua cột tinh sạch; 3A Protein IL-7 sau tinh (B) Kết Western blot: 1B Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2B Dịch chiết thu nhận sau qua cột tinh sạch; 3B Protein IL-7 sau tinh (C) Định lượng protein IL-7 western blot sử dụng phần mềm ImageJ: 1C, 2C, 3C, 4C: đối chứng dương có nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng, 5C Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP trước xử lý, 6C protein IL-7 sau tinh (30 µg protein tổng số/giếng Từ 1kg mẫu tươi, sau tinh theo phương pháp IMAC thu nhận lại protein IL-7 tái tổ hợp concentrator iCONTM, nồng độ protein tổng số định lượng theo phương pháp Badford protein IL-7 định lượng phần mềm ImageJ màng lai Kết thu 252 mg protein IL-7 tinh sạch/8 gram protein hòa tan tổng số, đạt tỷ lệ 3,15%, tương đương nồng độ protein IL-7 tái tổ hợp 252 mg/kg tươi So sánh với số nghiên cứu biểu protein tạm thời khác biểu protein IL-7 thuốc N Benthamiana tương đối cao Kết cho thấy hiệu phương pháp biểu tạm thời tinh protein IL-7 từ thuốc N benthamiana thời gian ngắn, dễ thực Để thu protein IL-7 tái tổ hợp với hàm lượng cao hơn, tiếp tục định lượng tinh phương pháp mITC dựa đặc tính gắn kết ELP với protein đích IL-7 Chúng sử dụng 100 gam thuốc biến nạp phương pháp agroinfiltration để tinh thu nhận protein IL-7 tái tổ hợp theo phương pháp mITC (mục 2.2.6.2) Chúng tiến hành thu lại dịch chiết protein sau bước tinh gồm dịch chiết thô trước tinh sạch, dịch khỏi màng sau đưa dịch chiết thô qua màng dịch tinh protein IL-7 tái tổ hợp tách khỏi màng rửa màng nước milipore Q lạnh Dịch thu sau bước đo nồng độ protein theo phương pháp Bradford (1976) phân tích phương pháp lai miễn dịch western blot để kiểm tra protein tinh đánh giá hiệu suất thu hồi protein Kết thể bảng 3.1 hình 3.11 Kết hình 3.11 cho thấy, đường chạy xuất băng có kích thước khoảng 64 kDa 130 kDa (trạng thái dimer) protein có gắn đuôi ELP; đường chạy dịch chiết protein khỏi màng lọc sau đưa dịch protein thô ban đầu qua màng không xuất băng protein nào, điều chứng tỏ protein IL7 có gắn đuôi ELP giữ lại màng lai không bị rửa trôi protein khác Ở đường chạy số dịch chiết sau rửa màng nước milipore-Q lạnh nồng độ ion thấp có băng protein có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein IL-7 tái tổ hợp theo tính toán 8 Hình 3.11 Kết tinh protein IL-7 tái tổ hợp phương pháp mITC M Thang protein chuẩn; Protein IL-7 tinh sau rửa màng nước lạnh; Dịch chiết khỏi màng sau đưa dịch thô qua màng; Dịch chiết protein chứa IL7/ELP trước tinh Bảng 3.1 Hiệu suất thu hồi protein IL-7 tái tổ hợp phương pháp mITC Protein Protein Hiệu suất Độ tinh Dịch chiết protein tổng số (mg) tái tổ hợp (mg) thu hồi (%) (%) Dịch thô 1634,7 38,3 100 X trước tinh Dịch IL-7 45,8 36,7 95,82 86,3 tinh Hình 3.12 Định lượng protein IL-7 tái tổ hợp phương pháp lai miễn dịch Dịch chiết thô chứa protein IL7/ELP trước tinh (30 µg/giếng); Protein IL-7 tách khỏi màng rửa màng nước milipore-Q lạnh; 3, 4, 5, Đối chứng dương với nồng độ 200, 150, 100, 50 ng/giếng Từ kết xác định nồng độ protein cho thấy hiệu suất thu hồi protein IL-7 phương pháp mITC đạt 95,82 %, độ tinh đạt 86,3% Hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp protein hòa tan tổng số 2,34%, kết tương đương với nghiên cứu trước hàm lượng protein tái tổ hợp protein hòa tan tổng số: 2% [47], [143]; 2,2% [1]; 3% [29] 3.6 Đánh giá hoạt tính sinh học protein IL-7 tái tổ hợp Để đánh giá hoạt tính sinh học protein IL-7 tiến hành thí nghiệm theo phương pháp mô tả mục 2.2.7 với nồng độ IL-7 là: 0,125 µg/ml; 0,25 µg/ml; 0,5 µg/ml; µg/ml; 1,5 µg/ml; µg/ml; 2,5 µg/ml Kết thu được trình bày bảng 3.2 hình 3.13 9 Bảng 3.2 Kết hoạt hoá dòng tế bào 2E8 interleukin Nồng độ protein IL-7 % hoạt hóa dòng tế bào 2E8 0.125 µg/ml 35.7 0.25 µg/ml 45.3 0.5 µg/ml 53.5 µg/ml 65.8 1.5 µg/ml 73.6 µg/ml 82.5 2.5 µg/ml 79.3 0.35 Giá trị ED50 (µg/ml) % hoạt hóa dòng tế bào 2E8 Qua bảng 3.2 hình 3.13 cho thấy, protein IL-7 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học việc hỗ trợ sinh trưởng hoạt hoá dòng tế bào 2E8, với khả hoạt hóa đạt 82,5% so với đối chứng âm (dòng tế bào 2E8 không bổ sung IL-7 vào môi trường nuôi cấy) Ở nồng độ chất thử IL-7 tăng dần, % hoạt hóa tế bào mẫu tăng theo, cho thấy hoạt tính sinh học mẫu thử ổn định; đó, khả hoạt hóa cao đạt nồng độ µg/ml 82,5%, sau khả hoạt hóa không tăng mà lại giảm đi, điều giải thích interleukin liều lượng cao gây ức chế cho sinh sản hoạt hóa tế bào, chí gây chết cho tế bào 90 80 70 60 50 40 30 20 10 82.5 73.6 79.3 63.8 53.3 45.3 35.7 Protein IL-7 0.125 0.25 0.5 1.5 2.5 Nồng độ mẫu thử (µg/ml) Hình 3.13 Hoạt tính sinh học protein IL-7 tái tổ hợp Qua kết trên, bước đầu khẳng định protein IL-7 tái tổ hợp có khả thể hoạt tính sinh học giống với tự nhiên, mở khả sản xuất lượng lớn protein IL-7 tái tổ hợp phục vụ y học nhằm đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cho người Chương BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Biểu tạm thời protein interleukin tái tổ hợp thuốc Thực vật sử dụng nhiều nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp Protein tái tổ hợp biểu thực vật thông qua hai phương pháp: tạo chuyển gen biểu tạm thời Trong phương pháp tạo chuyển gen, gen tái tổ hợp nhân vector biểu chuyển vào hệ gen thực vật Do đó, gen tái tổ hợp di truyền qua hệ sản xuất quy mô lớn protein tái tổ hợp Trong phương pháp biểu tạm thời, thay tích hợp vào hệ gen thực vật gen chuyển nhanh chóng tạo protein tái tổ hợp Phương pháp có lợi mức độ biểu protein tái tổ hợp cao nhiều so với phương pháp khác, thời gian sản xuất protein nhanh hơn, không bị ảnh hưởng vị trí gắn gen tế bào thực vật, đặc biệt không gặp phải vấn đề an toàn sinh thái phương pháp tạo chuyển gen Tuy nhiên, phương pháp biểu tạm thời gen chuyển không gắn vào hệ gen thực vật nên thường bị chế câm gen (RNAi) dịch mã sau dịch mã tác động, dẫn đến hàm lượng protein tái tổ 10 hợp thu nhận không cao Đây chế phản ứng thực vật trước xâm nhập DNA ngoại lai, dẫn đến phá hủy trình tự gen đặc hiệu làm giảm sản phẩm protein gen mã hóa Trong nghiên cứu luận án, để tránh gặp phải tượng RNAi làm giảm hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp, biểu đồng thời protein đích interleukin protein hỗ trợ Hc-Pro virus khoai tây Y nhằm chống lại tượng câm gen thực vật cách ngăn cản phân giải mRNA RNA sợi đôi, từ giảm lượng siRNA phá hỏng chức cắt enzyme cắt sợi đôi Dicer RISC Kết quả, thu protein IL-7 tái tổ hợp biểu thuốc với hàm lượng cao 4.2 Tăng cường biểu protein thực vật với ELP tinh mITC Mức độ biểu protein tái tổ hợp thực vật thường không cao giới hạn nghiên cứu biểu protein thực vật Đã có nhiều nghiên cứu thực nhằm vượt qua giới hạn để tăng cường khả biểu protein tái tổ hợp biểu thực vật nhiều phương pháp như: tối ưu hóa codon, kết hợp với thành phần hỗ trợ enzyme lichenase, ELP Trong nghiên cứu luận án, sử dụng 100xELP với protein IL-7 kiểm soát promoter CaMV35 nhằm tăng cường khả biểu protein IL-7 thực vật Kết phù hợp với số nghiên cứu khác như: Patel cộng (2007) tăng cường biểu interleukin người lên 19 lần interleukin 10 lên 15 lần kết hợp với 27xELP; nghiên cứu Floss (2009) cho thấy, mức độ biểu chuỗi nặng chuỗi nhẹ kháng thể kháng HIV (2F5 2G12) cao kết hợp với ELP Từ kết cho thấy tích lũy protein tái tổ hợp hiệu ứng ELP vị trí gen chuyển Sự tăng cường biểu protein kết hợp với ELP giải thích protein kết hợp ELP khó bị protease tế bào chủ phân cắt thủy phân Điều dẫn tới hàm lượng protein tái tổ hợp cao so với bình thường, góp phần nâng cao hiệu phương pháp tinh thu nhận protein Hiện nay, có nhiều phương pháp nhằm tinh thu nhận loại protein tái tổ hợp đạt nồng độ cao tinh khiết như: phương pháp sắc ký lọc gel, phương pháp sắc ký lực (IMAC), sắc ký trao đổi ion, phương pháp đảo chiều thuận nghịch mITC Tùy thuộc vào nghiên cứu loại protein, người ta lựa chọn phương pháp tinh tối ưu để thu hàm lượng protein tái tổ hợp cao Phương pháp tinh protein đảo chiều thuận nghịch mITC dựa tính chất đảo ngược chuyển từ trạng thái tan sang trạng thái không tan ngược lại nhiệt độ môi trường thay đổi ELPylated tỏ có nhiều ưu điểm ứng dụng ngày rộng rãi hàm lượng protein tái tổ hợp thu nhận nhiều với độ tinh cao, bước tiến hành nhanh đơn giản kết tinh protein gắn kết ELP giữ lại bề mặt màng dễ dàng khử khỏi màng Trong nghiên cứu luận án, sử dụng hai phương pháp để tinh protein IL-7 tái tổ hợp phương pháp sắc ký ion cố định kim loại (IMAC) phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng (mITC) Đối với phương pháp sắc ký ion cố định kim loại, thu hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp đạt 252 mg protein IL-7 tinh sạch/8gram protein hòa tan tổng số, đạt tỷ lệ 3,15%, tương đương nồng độ protein IL-7 tái tổ hợp 252 mg/kg tươi Đối với phương pháp tinh protein tái tổ hợp đảo chiều thuận nghịch qua màng (mITC), thu hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp đạt 367 mg/kg tươi với hiệu suất thu hồi đạt 95,82 % độ tinh đạt 86,3% Qua số liệu thu cho thấy, phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng (mITC) dựa đặc tính ELP có hiệu suất thu hồi cao hẳn phương pháp khác; kết nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu trước biểu protein tái tổ hợp có gắn kết ELP Scheller cộng (2006) tổng hợp protein scFV tái tổ hợp với hàm lượng tăng gấp 40 lần so với thông thường, không gắn với ELP, Theo Floss (2009), việc gắn kết với ELP làm tăng mức độ biểu kháng thể vô hiệu hóa HIV biểu hạt; ELP kết hợp với protein tái tổ hợp đầu C làm tăng tích lũy nhiều loại protein biểu Từ kết cho thấy, việc biểu protein tái tổ hợp gắn kết với ELP tinh phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng mITC cho hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp với độ tinh cao so với phương pháp khác Mở hướng nghiên cứu nhiều triển vọng cho mục đích thu nhận protein tái tổ hợp người sản xuất thực vật nhằm phục vụ y dược học, chữa bệnh cho người 11 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Kết luận Mã di truyền gen hIL-7 thay đổi phù hợp với hệ thống biểu thực vật với độ tương đồng nucleotide 63,6 % độ tương đồng acid amin 100% Các cấu trúc vector chuyển gen pET32c(+)/IL7; pENTR221/IL7/cal; pK7WG2D.1/cal/IL7; pRTRA 35S-IL7-100xELP; pCB301_IL7/ELP thiết kế phục vụ chuyển gen vào tế bào vi khuẩn E.coli rosetta-gami B, dòng tế bào huyền phù BY-2, rễ tơ thuốc thuốc để biểu protein interleukin tái tổ hợp Hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp thu qua hệ thống nuôi cấy cao đạt 367 mg/kg tươi biểu tạm thời thuốc thu nhận phương pháp tinh mITC; thấp biểu qua hệ thống nuôi cấy huyền phù BY-2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg protein tan tổng số Hoạt tính sinh học protein IL-7 đạt 82,5% nồng độ µg/ml Đề nghị Trên sở kết nghiên cứu đạt được, để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu sâu hơn; đề xuất số đề nghị sau: Tiếp tục thử nghiệm protein IL-7 tái tổ hợp tinh mức độ động vật thí nghiệm lâm sàng nhằm đánh giá sâu hoạt tính sinh học protein IL-7 trước sản xuất diện rộng Nghiên cứu biểu protein IL-7 số loài thực vật khác để làm phong phú nguồn nguyên liệu tổng hợp protein IL-7 tái tổ hợp  ... án: Thiết kế vector chuyển gene interleukin bước đầu đánh giá biểu protein thuốc lá Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin Tạo thuốc biểu protein interleukin. .. Thiết kế vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin tái tổ hợp Tạo thuốc biểu protein interleukin Kết nghiên cứu: Thiết kế cấu trúc vector chuyển gene biểu protein tái tổ hợp thực vật Biểu. .. DƯỢC BÁO CÁO TÓM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ Mã số: ĐH2014-TN05-01 Xác nhận tổ chức