TIÊU CHUẨN VIỆT NAM VỀ THỊT

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7928 : 2008 THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GEL PECTIN Foodstuffs – Determination of total aerobic count by the pectin gel method Lời nói đầu TCVN 7928:2008 xây dựng sở AOAC 988.18 Aerobic Plate Count – Pectin Gel Method; TCVN 7928:2008 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GEL PECTIN Foodstuffs – Determination of total aerobic count by the pectin gel method Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp gel pectin để xác định tổng vi khuẩn hiếu khí có sản phẩm thực phẩm Nguyên tắc Phương pháp sử dụng đĩa RedigelTM xử lý sơ có chứa lớp “chất làm cứng” mỏng môi trường lỏng chứa chất dinh dưỡng với chất làm đông pectin Rót lớp môi trường lỏng từ 12 ml đến 15 ml vào đĩa RedigelTM xử lý sơ bổ sung phần mẫu thử không pha loãng pha loãng Xoay lắc đĩa để trộn mẫu thử môi trường Để yên đĩa mặt phẳng từ 30 đến 40 đông đặc Toàn trình thực nhiệt độ phòng Sau ủ đĩa đếm Thuốc thử môi trường nuôi cấy Các thuốc thử sử dụng phải loại tinh khiết phân tích nước sử dụng phải nước cất nước có chất lượng tương đương, trừ có qui định khác 3.1 Ống đĩa gel pectin Dịch lỏng gel pectin hấp áp lực có sẵn lọ dùng cho phép thử 10 phép thử Sử dụng lọ Redigel đĩa Redigel xử lý sơ có bán sẵn, loại tương đương đáp ứng yêu cầu kỹ thuật Để chuẩn bị pectin đếm đĩa từ thành phần riêng lẻ, hòa tan 5,0 g sản phảm thủy phân casein, 2,5 g dịch chiết nấm men 1,0 g glucoza 500 ml nước Hòa tan 15 g pectin metoxyl hóa thấp 500 ml nước Đun nóng hỗn hợp riêng rẽ thành phần hòa tan hết Hấp áp lực dung dịch 15 121 oC Gộp thành phần dinh dưỡng, dung dịch pectin chỉnh pH đến 7,0 ± 0,1 Để chuẩn bị đĩa Redigel vô trùng, cần chuẩn bị hỗn hợp lớp chất làm cứng thạch % với CaCl2 % (khối lượng thể tích) Khử trùng hỗn hợp hấp áp lực 15 121 oC Phân phối cách vô trùng lượng ml hỗn hợp vào đĩa Redigel vô trùng 3.2 Dung dịch đệm phosphat Butterfield Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 4.1 Pipet 4.2 Ống đong 4.3 Cân 4.4 Máy trộn phòng thử nghiệm, trì tốc độ từ 10 000r/min đến 12 000r/min 4.5 Tủ ấm, trì nhiệt độ 32 oC ± oC 35 oC ± oC Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị dịch cấy Chuẩn bị dịch pha loãng thập phân 90 ml dịch pha loãng vô trùng (dung dịch đệm phosphat Butterfield) với 10 ml dung dịch mẫu pha loãng, trừ có quy định khác Lắc tất dịch pha loãng 25 lần theo dạng hình vòng cung 30 cm Dùng pipet (4.1) lấy xác thể tích cần thiết Không dùng pipet có dung tích lớn 10 lần thể tích lấy Ví dụ: không dùng pipet có dung tích lớn 10 ml để phân phối ml, không dùng pipet có dung tích lớn ml để phân phối thể tích 0,1 ml 5.1.1 Sản phẩm sữa Đong (hoặc cân) 11 ml (hoặc 11 g) phần mẫu thử pha loãng 99 ml dung dịch đệm phosphat Butterfield (3.2) Đối với sản phẩm dạng rắn trộn máy trộn phòng thử nghiệm (4.4) tốc độ quay từ 10 000 r/min đến 12 000 r/min Chuẩn bị dung dịch pha loãng cho đĩa tổng số khuẩn lạc thu từ 25 đến 250 Ủ đĩa 48 h ± h 32 oC ± oC 5.1.2 Các sản phẩm khác với sữa Cân 50 g phần mẫu thử cho vào 450 ml dung dịch đệm phosphat Butterfield (3.2) trộn máy trộn phòng thử nghiệm (4.4) tốc độ quay từ 10 000 r/min đến 12 000 r/min Chuẩn bị dung dịch pha loãng cách phân phối 10 ml phần mẫu thử vào 90 ml dịch pha loãng cho đĩa tổng số khuẩn lạc thu từ 30 đến 300 Ủ đĩa 48 h ± h 35 oC ± oC 5.2 Phương pháp xác định 5.2.1 Mở nắp đĩa Redigel vô trùng rót khoảng từ 12 ml đến 15 ml dịch lỏng gel pectin từ chai vào đĩa Đậy nắp đĩa xoay đĩa để gel pectin phủ khắp đáy Chuẩn bị số lượng đĩa cần thiết cho phần mẫu thử (hai đĩa cho dịch pha loãng) Các đĩa cần sử dụng vòng sau rót gel pectin 5.2.2 Cho ml dịch cấy vào dịch lỏng gel pectin đĩa Redigel vô trùng Chạm đầu tip pipet lần vào điểm khô thành đĩa (cao mức dịch pha loãng gel pectin) sau phân phối phần mẫu thử đến điểm ngừng tip pipet Lắc đĩa để trộn phần mẫu thử với gel pectin Không để pectin tràn CHÚ THÍCH Bước khác quy trình gel pectin môi trường thạch Không cho dịch cấy vào đĩa Redigel vô trùng chuẩn bị sơ rót gel pectin lên Điều hạn chế mẫu thử diện tích nhỏ đĩa không tách khuẩn lạc riêng lẻ 5.2.3 Để yên đĩa cấy mặt phẳng đông đặc (khoảng 30 đến 40 min) sau ủ 48 h ± h 35 oC ± oC sản phảm khác với sữa 48 h ± h 32 oC ± oC sản phẩm sữa 5.2.4 Đếm đĩa có số khuẩn lạc thích hợp (từ 30 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc sản phẩm khác với sữa từ 25 khuẩn lạc đến 250 khuẩn lạc sản phẩm sữa) Nếu đĩa không chứa số khuẩn lạc thích hợp ghi lại độ pha loãng số khuẩn lạc đếm 5.3 Biểu thị kết Ghi lại trung bình số đếm thu tổng số vi sinh vật hiếu khí đếm gam mililit sản phẩm Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: - thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - phương pháp thử sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; - chi tiết thao tác không qui định tiêu chuẩn này, với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết quả; - kết thử nghiệm thu TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6848 : 2001 VI SINH VẬT HỌC – HƯỚNG DẪN CHUNG VỀ ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM – KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Microbiology – General guidance for the enumeration of coliforms – Colony count technique Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đưa hướng dẫn chung để định lượng coliform có thực phẩm thức ăn chănnuôi kỹ thuật đếm khuẩn lạc môi trường đặc sau nuôi cấy 300C, 350C 370C, nhiệt độ cần thỏa thuận bên có liên quan Chú thích – Nhiệt độ nuôi cấy 300C dùng để định lượng mang tính chất kỹ thuật, nhiệt độ 350C 370C dùng nhiều lĩnh vực sức khỏe cộng đồng Tiêu chuẩn viện dẫn TCVN 4881 : 1989 (ISO 6887 : 1983), Vi sinh vật học – Hướng dẫn chung cách pha chế dung dịch pha loãng để kiểm nghiệm vi sinh vật TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1997), Vinh sinh vật thực phẩm thức ăn gia súc – Nguyên tắc chung kiểm tra vi sinh vật Định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng định nghĩa sau: Coliform (Coliform): Vi khuẩn nhiệt độ xác định (nghĩa 300C, 350C 370C theo thỏa thuận) tạo nên khuẩn lạc đặc trưng thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể điều kiện thử quy định tiêu chuẩn Nguyên tắc 4.1 Chuẩn bị gồm hai đĩa rót sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc đặc, lấy lượng mẫu thử theo quy định sản phẩm ban đầu chất lỏng, lấy lượng huyền phù ban đầu theo quy định sản phẩm dạng khác Chuẩn bị cặp đĩa thạch khác điều kiện, dùng dung dịch pha loãng thập phân mẫu thử huyền phù ban đầu 4.2 Ủ đĩa 300C, 350C 370C (theo thỏa thuận) 24h 4.3 Tính số coliform có mililit gam mẫu từ số khuẩn lạc đặc trưng thu đĩa chọn (xem 10.1) Môi trường nuôi cấy chất lỏng pha loãng 5.1 Khái quát Thực hành phòng thí nghiệm, xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218) 5.2 Chất lỏng pha loãng Xem TCVN 4881 : 1989 (ISO 6887) tiêu chuẩn liên quan đến sản phẩm xét nghiệm 5.3 Môi trường chọn lọc đặc: Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể (VRBL) Thành phần pepton g Cao men g Lactoza 10 g Natri clorua g Muối mật (bile salts) 1,5 g Đỏ trung tính 0,03 g Tím tinh thể 0,002 g Thạch 12 g đến 18 g Nước 000 ml Chuẩn bị Tiến hành sau để giữ tính chọn lọc đặc trưng môi trường Trộn kỹ thành phần môi trường hoàn chỉnh khô nước để yên vài phút Chỉnh pH cho sau đun sôi 250C pH 7,4 Đun đến sôi khuấy cho tan hết Giữ sôi phút Làm nguội môi trường nồi cách thủy (6.5) có nhiệt độ 450C Tránh làm nhiệt môi trường, nghĩa đun nóng lâu đun lại Do đó, không trùng nồi áp lực cần kiểm tra độ vô trùng môi trường thời điểm sử dụng (xem 9.2.2) Sử dụng môi trường vòng h sau chuẩn bị Thiết bị dụng cụ thủy tinh Chú thích – Có thể sử dụng thiết bị, dụng cụ dùng lần thay cho việc sử dụng lại dụng cụ thủy tinh chúng đáp ứng yêu cầu phù hợp Các thiết bị thông thường phòng thí nghiệm vi sinh vật đặc biệt 6.1 Thiết bị để trùng khô (tủ sấy) để trùng ướt (nồi hấp áp lực) Xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218) 6.2 Tủ ấm, hoạt động 300C ± C, 350C ± 10C, 370C ± 10C 6.3 Đĩa Petri, thủy tinh chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm 6.4 Pipet xả hết, có dung tích danh định ml 6.5 Nồi cách thủy, thiết bị tương tự trì nhiệt độ 45 0C ± 0,50C 6.6.Thiết bị đếm khuẩn lạc, gồm nguồn chiếu sáng illumined dụng cụ đếm điện tử 6.7 pH met, xác đến ± 0,1 đơn vị pH 250C Lấy mẫu Lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp sản phẩm tương ứng Nếu tiêu chuẩn bên liên quan cần thỏa thuận với vấn đề Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp sản phẩm có liên quan Nếu tiêu chuẩn bên liên quan cần thỏa thuận với vấn đề Cách tiến hành 9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu dịch pha loãng Xem TCVN 4881 : 1989 (ISO 6887) tiêu chuẩn thích hợp liên quan đến sản phẩm 9.2 Cấy nuôi mẫu 1) Tùy theo sức đông thạch 9.2.1 Lấy hai đĩa Petri vô trùng (6.3) Dùng pipet vô trùng (6.4) cho vào đĩa ml mẫu thử sản phẩm lỏng, ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác Lấy hai đĩa Petri vô trùng khác Dùng pipet vô trùng cho vào đĩa 1ml dịch pha loãng thập phân (10 -1 ) mẫu thử sản phẩm lỏng, ml dịch pha loãng thập phân (10 -2 ) huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác Dùng pipet vô trùng lặp lại trình tự mô tả với dịch pha loãng thập phân 9.2.2 Rót khoảng 15 ml môi trường VRBL (5.3) 450C ± 0,50C vào đĩa Petri Thời gian tính từ kết thúc khâu chuẩn bị huyền phù ban đầu (hoặc dịch pha loãng 1/10 sản phẩm lỏng) đến thời điểm rót môi trường (5.3) vào đĩa không vượt 15 phút Trộn cẩn thận mẫu cấy với môi trường hỗn hợp đông đặc lại cách đặt đĩa Petri mặt phẳng ngang, mát Đồng thời chuẩn bị đĩa kiểm tra với 15 ml môi trường để kiểm tra độ vô trùng 9.2.3 Sau đông đặc hoàn toàn, rót khoảng ml môi trường VRBL (5.3) 450C±0,50C lên bề mặt môi trường vừa cấy Để cho đông lại mô tả 9.2.4 Lật ngược đĩa cấy để vào tủ ấm 300C, 350C 370C (theo thỏa thuận) 24 h ± 2h 9.3 Đếm khuẩn lạc Sau thời gian nuôi ấm quy định (xem 9.2.4) dùng thiết bị đếm khuẩn lạc (6.6) để đếm khuẩn lạc coliform đặc trưng đĩa có chứa không 150 khuẩn lạc22) loại Chú thích – Sau nuôi 24 h, khuẩn lạc đặc trưng khuẩn lạc màu đỏ ánh tía có đường kính 0,5 mm lớn có vùng mật tủa đỏ bao quanh 10 Biểu thị kết 10.1 Phương pháp tính 10.1.1 Trường hợp chung – Đối với đĩa có chứa từ 15 đến 150 khuẩn lạc đặc trưng Giữ lại đĩa chứa không 150 khuẩn lạc đặc trưng hai độ pha loãng Một đĩa cần chứa 15 khuẩn lạc đặc trưng Tính số coliform N mililit gam sản phẩm, tùy trường hợp, dùng công thức sau đây: Trong ∑Clà tổng khuẩn lạc đặc trưng đếm tất đĩa chọn; n tổng số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ nhất; n tổng số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ hai; d hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ Làm tròn kết đến hai chữ số có nghĩa Kết số coliform mililit gam sản phẩm biểu thị số từ 0,1 đến 9,9 nhân với 10 x x lũy thừa 10 Thí dụ: Đếm coliform 300C cho kết sau: 2) Cao số có nguy khuẩn lạc không cho hình dạng điển hình - độ pha loãng thứ giữ lại (10 -2 ): 83 97 khuẩn lạc đặc trưng - độ pha loãng thứ hai giự lại (10 -3 ): 13 khuẩn lạc đặc trưng Làm tròn kết theo quy định thành 100 9,1x 10 coliform mililit gam sản phẩm 10.1.2 Trường hợp đĩa có chứa 15 khuẩn lạc đặc trưng Nếu đĩa giữ lại chứa 15 khuẩn lạc đặc trưng, tính số coliform ước lượng N E công thức nêu 10.1.1 Thí dụ: Đếm số coliform 300C cho kết sau: - Ở dịch pha loãng 10 -4 : 140 145 khuẩn lạc có khuẩn lạc đặc trưng tương ứng - Ở dịch pha loãng 10 -5 : 11 khuẩn lạc có khuẩn lạc đặc trưng tương ứng Làm tròn kết theo quy định 10.1.1 cho kết 4,0x10 coliform mililit gam 10.1.3 Ước đoán số lượng nhỏ Nếu hai đĩa ứng với mẫu thử (sản phẩm lỏng) huyền phù ban đầu (các sản phẩm dạng khác) chứa 15 khuẩn lạc đặc trưng báo cáo sau: - 15 coliform mililit (sản phẩm lỏng) - 15x 1/d coliform gam (các sản phẩm dạng khác), d hệ số pha loãng huyền phù ban đầu 10.1.4 Trường hợp khuẩn lạc đặc trưng - hai đĩa ứng với mẫu thử (sản phẩm lỏng) huyền phù ban đầu (các sản phẩm dạng khác) không chứa khuẩn lạc đặc trưng báo cáo kết thử sau: - coliform mililit (sản phẩm lỏng) - x 1/d coliform gam (các sản phẩm dạng khác), d hệ số pha loãng huyền phù ban đầu 10.2 Độ chụm 10.2.1 Các đĩa có chứa từ 15 đến 150 khuẩn lạc đặc trưng (xem 10.1.1) Vì lý túy thống kê, 95% trường hợp giới hạn tin cậy phương pháp dao động từ ± 16% đến ± 52% (Cowel Morisetti, tạp chí nông nghiệp thực phẩm, tập 20 trang 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử nghiệm dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn coi tùy chọn với chi tiết cố mà ảnh hưởng đến kết quả; e) kết thử nghiệm thu được, kiểm tra độ lặp lại nêu kết cuối thu Phụ lục A (tham khảo) Các kết phép thử liên phòng thử nghiệm Một phép thử cộng tác quốc tế (xem [2]) gồm 17 phòng thử nghiệm 15 quốc gia tham gia thực phomat, thịt, thức ăn chăn nuôi vật liệu chuẩn Các mẫu thực phẩm/thức ăn chăn nuôi loại thử nghiệm ba mức nhiễm bẩn C.perfringens khác 1) Trong phép thử liên phòng thử nghiệm này, giá trị độ tái lập thay đổi qua nhiều mẫu để biểu thị Theo ISO 16140, thông số sau nhận biết phép thử liên phòng thử nghiệm Phép thử viện Y tế Cộng đồng quốc gia (RIVM) tổ chức thực vào tháng năm 2000 cho liệu Bảng A đến A.4 TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4830-1 : 2005 ISO 6888 : 1999 WITH AMENDMENT : 2003 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCI CÓ PHẢN ỨNG DƯƠNG TÍNH VỚI COAGULASE (STAPHYLOCOCCUS AUREUS VÀ CÁC LOÀI KHÁC) TRÊN ĐĨA THẠCH PHẦN 1: KỸ THUẬT SỬ DỤNG MÔI TRƯỜNG THẠCH BAIRD-PARKER TCVN 4830-1 (ISO 6888-1) TCVN 4830-2 (ISO 6888-2) mô tả phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng với coagulase đĩa thạch gặp phải chủng sinh độc tố liên quan chủ yếu đến Staphylococcus aureus, có S.intermedius chủng định S.hyicus Cả hai tiêu chuẩn TCVN 4830-1 (ISO 6888-1) TCVN 4830-2 (ISO 6888-2) cho kết tương đương Tuy nhiên, nên sử dụng quy trình mô tả TCVN 4830-2 (xem [1]) thực phẩm (như mát chế biến từ sữa nguyên liệu sản phẩm thịt nguyên liệu) bị nhiễm bẩn do: - staphylococci hình thành khuẩn lạc không điển hình môi trường thạch Baird-Parker - hệ vi khuẩn mà che khuất khuẩn lạc cần tìm Tiêu chuẩn khẳng định staphylococci dựa phản ứng với coagulase dương tính, phải công nhận số chủng Staphylococcus aureus cho phản ứng dương tính yếu với coagulase Các chủng bị nhầm lẫn với vi khuẩn khác chúng phân biệt cách sử dụng phép thử bổ sung mà không đề cập đến tiêu chuẩn phép thử độ nhạy với lysostaphin, sinh hemolizin, nucleaze chịu nhiệt sinh axit từ manitol Phạm vị áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đĩa thạch có mặt sản phẩm dùng cho người thức ăn chăn nuôi, cách đếm số khuẩn lạc thu môi trường đặc (môi trường Baird-Parker) sau ủ điều kiện hiếu khí 350C đến 370C Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 3.1 staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (coagulase-positive staphylococci) vi khuẩn hình thành khuẩn lạc điển hình và/ không điển hình bề mặt môi trường cấy chọn lọc cho phản ứng với coagulase dương tính tiến hành thử nghiệm theo phương pháp quy định tiêu chuẩn 3.2 định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (enumeration of the coagulase-positive staphylococci) việc xác định số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase tìm thấy mililit gam mẫu tiến hành thử nghiệm theo phương pháp quy định tiêu chuẩn Nguyên tắc 4.1 Cấy lên bề mặt môi trường cấy đặc chọn lọc, sử dụng hai đĩa, dùng lượng mẫu thử quy định sản phẩm dạng lỏng, với lượng huyền phù ban đầu quy định sản phẩm dạng khác Trong điều kiện, cấy dung dịch pha loãng thập phân mẫu thử huyền phù ban đầu, dùng hai đĩa cho độ pha loãng 4.2 Ủ đĩa điều kiện hiếu khí 350C 370C kiểm tra sau 24h 48h 4.3 Tính số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase mililit, gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc điển hình và/ không điển hình đĩa phận pha loãng chọn cho kết có ý nghĩa khẳng định kết thử coagulase dương tính Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng, bên có liên quan tự thỏa thuận vấn đề Điều quan trọng phòng thí nghiệm nhận mẫu đại diện không bị hư hỏng biến đổi suốt trình bảo quản vận chuyển Cách tiến hành 6.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) tiêu chuẩn riêng phù hợp với sản phẩm liên quan 6.2 Cấy 6.2.1 Dùng pipet vô trùng chuyển vào hai đĩa thạch đĩa 0,1 ml mẫu thử sản phẩm dạng lỏng, 0,1 ml huyền phù ban đầu (độ pha loãng 10-1 ) sản phẩm dạng khác Lặp lại trình tự độ pha loãng 10-2 độ pha loãng thập phân cần 6.2.2 Đối với sản phẩm định, tốt để đếm staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase với số lượng thấp, giới hạn phát tăng lên 10 lần cách cấy 1,0ml mẫu thử dạng lỏng, 1,0 ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác, lên bề mặt đĩa thạnh lớn (140 mm) lên bề mặt ba đĩa thạch nhỏ (90 mm) Trong hai trường hợp, chuẩn bị mẫu kép cách dùng hai đĩa to sáu đĩa nhỏ 6.2.3 Sử dụng dụng cụ dàn mẫu dàn chất cấy cẩn thận nhanh tốt, lên mặt đĩa thạch, cố gắng không chạm vào mép đĩa Để đĩa có nắp đậy khô khoảng 15 phút nhiệt độ phòng thử nghiệm 6.3 Ủ Lật ngược đĩa chuẩn bị ủ chúng 24 h ± h sau ủ lại thêm 24h ± h tủ ấm 350C 370C 6.4 Chuẩn bị đĩa diễn giải 6.4.1 Sau ủ 24h ± 2h, đánh dấu vị trí khuẩn lạc điển hình có mặt (xem thích 1) đáy đĩa Nhiệt độ bên có liên quan thỏa thuận nêu rõ báo cáo thử nghiệm Ủ lại tất đĩa nhiệt độ 350C 370C thêm 24h ± 2h, đánh dấu khuẩn lạc điển hình Đồng thời đánh dấu khuẩn lạc không điển hình có mặt (xem thích1) Chỉ lấy đĩa (xem thích 2) có chứa tối đa 300 khuẩn lạc với 150 khuẩn lạc điển hình và/ không điển hình hai dung dịch để định lượng Một đĩa phải chứa 15 khuẩn lạc Chọn để khẳng định lượng A có (thường khuẩn lạc điển hình, khuẩn lạc không điển hình có khuẩn lạc không điển hình, khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc không điển hình hai loại có mặt đĩa) Với sản phẩm dạng lỏng chưa pha loãng dung dịch pha loãng thấp sản phẩm dạng khác, có 15 khuẩn lạc điển hình và/hoặc không điển hình có mặt đĩa CHÚ THÍCH 1: Các khuẩn lạc điển hình có màu đen màu xám, bóng lồi (có đường kính từ mm đến 1,5 mm sau ủ 24 h, từ 1,5 mm đến 2,5 mm sau ủ 48 h) bao quanh vùng rõ rệt, mờ phần Sau ủ 24 h, xuất vòng màu trắng đục tiếp giáp với khuẩn lạc CHÚ THÍCH 2: Các khuẩn lạc không điển hình kích cỡ khuẩn lạc điển hình có trạng thái sau: - khuẩn lạc đen bóng có không viền trắng hẹp; vùng không nhìn thấy vòng trắng đục khó nhìn thấy - khuẩn lạc màu xám vùng Các khuẩn lạc không điển hình hình thành chủ yếu chủng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase bị nhiễm bẩn sản phẩm, ví dụ, sản phẩm sữa, tôm phận vật nuôi Chúng thường hình thành nhiễm chủng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase bị nhiễm bẩn sản phẩm khác CHÚ THÍCH 3: Các khuẩn lạc khác tất khuẩn lạc lại có khả có mặt đĩa mà không cho thấy biểu bên điển hình không điển mô tả Chú thích Chú thích 2, coi hệ vi khuẩn 6.4.2 Nếu dàn 1,0 ml chất cấy lên ba đĩa, xử lý đĩa giống theo quy trình đếm khẳng định 6.4.3 Để ước tính số lượng nhỏ staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase, giữ lại tất đĩa có chứa chất khuẩn lạc điển hình không điển hình Chọn tất khuẩn lạc để khẳng định nằm giới hạn đề 6.5 Khẳng định (phép thử coagulase) Từ khuẩn lạc chọn, dùng que cấy vô trùng lấy phần chuyển vào ống lọ đựng môi trường canh não – tim Ủ 350C 370C 24h ± 2h Bằng kỹ thuật vô trùng, lấy 0,1 ml dịch cấy cho vào 0,3 ml huyết tương thỏ (trừ nhà sản xuất quy định lượng khác) đựng ống lọ đựng dung dịch hồng cầu vô trùng, ủ nhiệt độ 350C 370C Nghiêng ống, kiểm tra kết dính huyết tương sau ủ từ 4h đến 6h phép thử âm tính, kiểm tra lại sau ủ 24h, kiểm tra theo thời gian ủ nhà sản xuất quy định Nếu thể tích kết dính chiếm nửa thể tích ban đầu chất lỏng, phép thử coagulase dương tính Nhiệt độ thỏa thuận bên có liên quan nêu báo cáo thử nghiệm Để kiểm tra âm tính, mẻ huyết tương, thêm 0,1 ml môi trường canh não-tim vô trùng vào lượng huyết tương thỏ khuyến cáo ủ không cấy Phép thử hợp lệ kiểm tra huyết tương cho thấy dấu hiệu kết dính Biểu thị kết 7.1 Trường hợp chung 7.1.1 Tính số lượng a staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase nhận dạng đĩa chọn Trên đĩa, tính số lượng a staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase nhận dạng, theo công thức: Trong A c số lượng khuẩn lạc điển hình qua phép thử coagulase A nc số lượng khuẩn lạc không điển hình qua phép thử coagulase b c số lượng khuẩn lạc điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase; b nc số lượng khuẩn lạc không điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase; c c tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy đĩa ; c nc tổng số khuẩn lạc không điển hình nhìn thấy đĩa ; Lấy kết tròn số [Xem TCVN 6404 (ISO 7218)] 7.1.2 Tính số lượng N staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase nhận dạng có mặt phần mẫu thử Đối với đĩa có chứa tối đa 300 khuẩn lạc, có 150 khuẩn lạc điển hình và/ không điển hình hai độ pha loãng liên tiếp, tính số lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đĩa theo quy định 10.1.1 tính số N Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase nhận biết có mặt mẫu thử, trung bình thu từ hai độ loãng liên tiếp, công thức sau: Trong đó: ∑a tổng số khuẩn lạc staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase nhận biết tất đĩa chọn V thể tích chất cấy đĩa, tính mililit; n số đĩa chọn độ pha loãng thứ nhất; n số đĩa chọn độ pha loãng thứ hai; d độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ chọn (huyền phù ban đầu độ pha loãng) Làm tròn kết tính đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] Báo cáo kết theo số staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase mililit (sản phẩm dạng lỏng) gam (đối với sản phẩm dạng khác), biểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân 10 x , x lũy thừa tương ứng 10 7.1.3 Ví dụ Số đếm sản phẩm sau cấy 0,1 ml sản phẩm cho kết sau: - độ pha loãng thứ chọn (10 -2 ): 65 khuẩn lạc điển hình, 85 khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc không điển hình; - độ pha loãng thứ hai chọn (10 -3 ): khuẩn lạc điển hình, khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc không điển hình Số lượng cấy đâm sâu sau: - từ 65 khuẩn lạc, khuẩn lạc cấy đâm sâu khuẩn lạc cho phản ứng dương tính với coagulase, nên a = 65 - từ 85 khuẩn lạc, khuẩn lạc cấy đâm sâu, số cho phản ứng dương tính với coagulase, nên a = 51 - từ khuẩn lạc, tất khuẩn lạc cấy đâm sau cho phản ứng dương tính với coagulase, nên a = - từ khuẩn lạc, khuẩn lạc cấy đâm sâu cho phản ứng dương tính với coagulase, nên a = Độ chụm 8.1 Yêu cầu chung Độ chụm phương pháp định lượng biểu thị theo thuật ngữ độ lặp lại độ tái lập, định nghĩa TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) Tuy nhiên, phương pháp tính sử dụng TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) dựa vào trung bình thích hợp cho phép phân tích vi sinh vật, mà lúc cho phân bố chuẩn (Gaussian) Do ISO 16140 xây dựng riêng cho phương pháp phân tích vi sinh vật tiêu chuẩn sử dụng ước tính để tính độ lặp lại độ tái lập Các phép thống kê có ưu điểm nhạy giá trị cực điểm, nên loại trừ giá trị ngoại lai phép thống kê Do ước tính sử dụng tiêu chuẩn Các chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm độ chụm phương pháp tóm tắt phụ lục A Các giá trị nhận từ phép thử liên phòng thử nghiệm không áp dụng cho dải tập trung mẫu khác với giá trị nêu Dữ liệu độ chụm xác định sử dụng ba loại thực phẩm bị nhiễm mức khác vật liệu chuẩn Các yếu tố chủng loại cần xem xét, hệ vi sinh vật cạnh tranh, đặc điểm sinh lý đối tượng chủng loại cạnh tranh ảnh hưởng đến giá trị độ chụm 8.2 Độ lặp lại 8.2.1 Giới hạn lặp lại Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử độc lập đơn lẻ (được chuyển log 10 ) (số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase gam mililit) tỷ số giá trị cao giá trị thấp hai kết thử nghiệm thang danh định, thu sử dụng phương pháp, vật liệu thử giống hệt phòng thí nghiệm, người thao tác, sử dụng thiết bị, thực khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp lớn giới hạn lặp lại (r) 8.2.2 Các giá trị tổng thể Để biểu thị chung giới hạn độ lặp lại (r), giá trị sau sử dụng kiểm tra mẫu thực phẩm nói chung Các giá trị r giá trị trung bình tất mẫu xem xét: r = 0,28 (được biểu thị theo chênh lệch tuyệt đối kết thử nghiệm chuyển thành log 10 ), r = 1,9 (được biểu thị theo tỷ số giá trị cao giá trị thấp hai kết thử nghiệm thang danh định) Đối với vật liệu chuẩn (các viên nang chứa khoảng 000 CFU, xem phụ lục A), giá trị sau sử dụng: r = 0,19 (được biểu thị theo chênh lệch tuyệt đối kết thử nghiệm chuyển log 10 ), r = 1,55 (được biểu thị theo tỷ số giá trị cao giá trị thấp hai kết thử nghiệm thang danh định) VÍ DỤ: Kết thử nghiệm thứ 10 000 1,0 x 10 staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase quan sát gam thực phẩm Dưới điều kiện lặp lại, tỷ số giá trị cao giá trị thấp hai kết thử không lớn 1,9 Vì vậy, kết thứ hai phải từ 263 (= 10 000/ 1,9) đến 19 000 (10 000 x 1,9) staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase gam 8.3 Độ tái lập 8.3.1 Giới hạn tái lập Chênh lệch tuyệt đối kết (được chuyển log10) hai phép thử độc lập (số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase gam mililit) tỷ số giá trị cao giá trị thấp hai kết thử nghiệm thang danh định, thu sử dụng phương pháp, vật liệu thử, tiến hành phòng thử nghiệm khác nhau, người khác thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không % trường hợp lớn giới hạn tái lập (R) 8.3.2 Các giá trị tổng thể Để biểu thị chung giới hạn tái lập (R), giá trị sau sử dụng kiểm tra mẫu thực phẩm nói chung Các giá trị R trung bình tất mẫu R = 0,43 (được biểu thị theo chênh lệch kết thử nghiệm chuyển thành log 10 ), R = 2,7 (được biểu thị theo tỷ số giá trị cao giá trị thấp hai kết thử nghiệm thang danh định) Đối với vật liệu chuẩn (các viên nang chứa khoảng 000 CFU, xem phụ lục A) giá trị sau sử dụng: R = 0,39 (được biểu thị theo chênh lệch kết thử nghiệm chuyển thành log 10 ), R = 2,4 (được biểu thị theo tỷ số giá trị cao giá trị thấp thang danh định) ... tồn tiêu chuẩn quốc tế và/hoặc tiêu chuẩn quốc gia mà không phù hợp với tiêu chuẩn Trong trường hợp có sẵn tiêu chuẩn quốc tế cho sản phẩm cần thử nghiệm phải tuân theo tiêu chuẩn Hy vọng tiêu chuẩn. .. Khoa học Công nghệ) ban hành; Tiêu chuẩn chuyển đổi năm 2008 từ Tiêu chuẩn Việt Nam số hiệu thành Tiêu chuẩn Quốc gia theo quy định khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật điểm a khoản... sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; - chi tiết thao tác không qui định tiêu chuẩn này, với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết quả; - kết thử nghiệm thu TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6848 : 2001