ĐỀ CƯƠNG môn SINH học PHÂN tử

I SỰ VẬN CHUYỂN DI TRUYỀN Ở VI SINH VẬT Sự tiến hóa vi sinh vật phụ thuộc vào biến dị chọn lọc Nó diễn chậm chạp, lúc biến dị xảy tích lũy biến dị liên tiếp chủng sinh vật Quá trình trở nên nhanh chóng vi sinh vật nhờ vi sinh vật phát triển chế vận chuyển di truyền cá thể Vi khuẩn vận chuyển yếu tố di truyền qua ba chế: biến nạp, tải nạp tiếp hợp Trong biến nạp, đoạn ADN vận chuyển vào tế bào nhận Đây chế thô sơ vận chuyển gen Trong tải nạp tiếp hợp, plasmid vận chuyển qua trung gian phage qua tiếp xúc Plasmid phân tử ADN dạng vòng tròn nằm nhiễm sắc thể có khả tự chép Plasmid có trọng khối nhỏ so với nhiễm sắc thể Hai plasmid gọi không phù hợp chúng tồn bền vững tế bào Những plasmid F mang nhân tố sinh sản F Những plasmid tồn vi khuẩn với nhân tố F gọi Fi+ chúng ngăn cản tiếp hợp F, gọi Fi- trường hợp ngược lại Biến nạp (Transformation) Biến nạp vận chuyển ADN hòa tan nhiễm sắc thể từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận Khi tế bào vi khuẩn bị vỡ làm tan (lysis), ADN dạng vòng tròn chúng thoát môi trường thành đoạn thẳng với chiều dài khác nhau, có khả gây biến nạp cho tế bào nhận khác Griffith năm 1928 khám phá biến nạp phế cầu thí nghiệm sau chuột nhắt : - Tiêm vào chuột phế cầu sống S1 có vỏ chuột chết nhiễm khuẩn huyết - Tiêm vào chuột phế cầu R1 sống không vỏ chuột không chết - Tiêm vào chuột phế cầu S1 chết chuột không chết - Tiêm vào chuột hỗn hợp phế cầu S1 chết với R1 sống chuột chết nhiễm khuẩn huyết Từ máu chuột phân lập S1 sống có vỏ Griffith nhà khoa học thời chưa hiểu ý nghĩa sâu xa kiện Alloway năm 1933 thực thí nghiệm ống nghiệm phân lập phế cầu S1 hỗn hợp phế cầu S1 chết phế cầu R1 sống Avery, Mac-Leod, Mac-Carthy năm 1944 phân lập nhân tố biến nạp xác định ADN Nhưng lúc giới khoa học chưa chấp nhận ADN chất liệu di truyền Đến năm 1952 lúc Hershey Chase chứng minh ADN Phage vào bên vi khuẩn vỏ Protein bị giữ bên ADN công nhận nhân tố biến nạp Sự biến nạp khám phá thêm nhiều vi khuẩn khác: Hemophilus , Neisseria, Streptococcus, Bacillus, Acinetobacter Trong biến nạp, tế bào nhận phải trạng thái sinh lý đặc biệt gọi khả nạp (competence) có khả tiếp nhận ADN hòa tan tế bào cho Trạng thái khả nạp xuất giai đoạn định trình phát triển tế bào vào lúc tê bào tổng hợp vách Sau xâm nhập, phân tử ADN sợi kép bị endonuclease cắt màng tế bào thành đoạn ngắn sợi đơn vào nguyên tương Đoạn ADN sợi đơn kết đôi với ADN tế bào nhận đoạn tương đồng tái tổ hợp; cách ADN biến nạp kết hợp vào nhiễm sắc thể tế bào nhận Nhiễm sắc thể tái tổ hợp phân tử ADN sợi kép tế bào nhận đoạn ngắn sợi thay đoạn ADN tế bào cho Đối với vi khuẩn đường ruột, tiếp nhận đòi hỏi biến đổi bề mặt tế bào cách xử lý với CaCl2 Ý nghĩa biến nạp: Sự biến nạp cho phép kết hợp vào nhiễm sắc thể vi khuẩn ADN tổng hợp ADN biến đổi invitro Biến nạp sử dụng để xác định vùng nhỏ đồ di truyền vi khuẩn Biến nạp xảy thiên nhiên Người ta chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp độc lực tăng lúc tiêm chủng phế cầu vào phúc mạc chuột nhắt Như biến nạp có ý nghĩa dịch tễ học, nhiên vận chuyển di truyền biến nạp không hữu hiệu vận chuyển di truyền plasmid Tải nạp (Transduction) Tải nạp vận chuyển ADN từ vi khuẩn vi khuẩn nhận nhờ phage Trong tải nạp chung, phage mang gen vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận Trong tải nạp đặc hiệu, phage định mang số gen định vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận 2.1 Sự tải nạp chung Kiểu tải nạp Zinder Lederberg khám phá năm 1951 lúc khảo sát tiếp hợp Salmonella Lúc lai giống chủng L22 chủng L2, chủng mang cặp tính trạng đột biến khác thu với tỷ lệ nhỏ số tế bào tái tổ hợp mang cặp tính trạng đột biến tế bào hoang dại gốc, phage P22 tìm thấy nước lọc canh khuẩn chủng vi khuẩn Phage P22 độc lực với chủng L2 ôn hòa với chủng L22 Lúc cho P22 vào canh khuẩn L2 tất tế bào L2 bị dung giải phóng thích phage P22 có phage chứa mảnh ADN L2 Lúc cho chủng L22 vào dung dịch phage P22 nói số phage vận chuyển gen L2 vào L22 vi khuẩn tự dưỡng type hoang dại phát sinh qua tái tổ hợp 2.2 Sự tải nạp đặc hiệu Năm 1954 Mores nhận thấy phage ôn hòa thực kiểu tải nạp khác gọi tải nạp đặc hiệu Nó vận chuyển nhóm giới hạn gen, nhóm gen chuyển nằm sát chổ prophage gắn vào nhiễm sắc thể Sự tải nạp đặc hiệu vận chuyển gen đặc hiệu nhiễm sắc thể đòi hỏi tích hợp phage Hơn khác với tải nạp chung, phage tải nạp đặc hiệu phóng thích lúc chiếu tia cực tím không tự tách rời khỏi nhiễm sắc thể Lúc chiếu tia cực tím vào canh khuẩn E.coli K12 Gal+ sinh tan với phage λ phage phóng thích có khoảng 10^-6λ d Gal λ dGal phage λ mang gen Gal thiếu dọan ADN mà để lại nhiễm sắc thể vi khuẩn Đó phage không hoàn chỉnh nhân lên không bổ sung đọan ADN bị thiếu vận chuyển gen Gal Lúc cho dịch dung giải nói vào canh khuẩn E.coli K12 Gal- thu khỏang 10^-6 vi khuẩn tải nạp galactoza dương tính Đó tượng tải nạp tần số thấp LTF (Low Frequency Tranduction) Một số tế bào canh khuẩn E.coli K12 Gal- nhiễm dịch LTF trở nên hai lần sinh tan với phage λ bình thường phage λ dGal Những tế bào hình thành clon tế bào hai lần sinh tan Lúc chiếu tia cực tím vào tế bào nói thu dịch phage phage λ phage λ dGal Đó tải nạp tần số cao (High frequency transduction) Ý nghĩa tải nạp: Sự tải nạp cho phép xác định gen gần nhiễm sắc thể, sử dụng đê thiết lập đồ di truyền Dựa vào tân số tải nạp hai gen lúc người ta xác định khỏang cách gen nhờ xác định vị trí chúng Trong thiên nhiên tải nạp giữ vai trò có ý nghĩa lây lan Plasmid kháng thuốc vi khuẩn gram dương plasmid penicillinase tụ cầu Ngòai prophage đem lại cho vi khuẩn số tính chất đặc biệt quan trọng ví dụ prophage β trực khuẩn bạch hầu Tiếp hợp (Conjugation) Tiếp hợp tượng vận chuyển yếu tố di truyền từ vi khuẩn cho (đực) sang vi khuẩn nhận (cái) hai vi khuẩn tiếp xúc với Lederberg Tatum lần năm 1946 phát tiếp hợp vi khuẩn Hỗn hợp hai biến chủng E.coli K12 với Chủng khuyết dưỡng với Biotin Methionin có khả tổng hợp Threonin Leucin ký hiệu B-M-T+ L+ Chủng khuyết dưỡng với Threonin Leucin tổng hợp Biotin Methionin, ký hiệu B+M+T- L- Cả hai biến chủng không mọc môi trường tổng hợp tối thiểu không chứa bốn chất nên không tạo thành khuẩn lạc Nếu trộn hai biến chủng với cấy vào môi trường tối thiểu thấy mọc khuẩn lạc với tần số 10^-6 Điều cho thấy hai chủng lọai vi khuấn qua trao đổi gen tạo thành tế bào tái tổ hợp có khả tổng hợp bốn chất : Biotin, Methionin, Threonin, Leucin, ký hiệu B+, M+, T+, L+ Hiện tượng tiếp hợp liên quan đến nhân tố sinh sản F Nhân tố F Plasmid Tế bào chứa F tế bào đực hay tế bào F+ đóng vai trò tế bào cho Tế bào không chứa F tế bào F- đóng vai trò tế bào nhận Trong thí nghiệm tiếp hợp trên, chủng (1) đóng vai trò chủng cho chủng (2) đóng vai trò chủng nhận Từ tế bào F+, Cavalli phân lập tế bào Hfr (High frequency of recombination) có khả vận chuyển gen với tần số cao Khi lai Hfr x F- thu tế bào tái tổ hợp 1000 lần nhiều lai F+ x F- Trong tế bào F+ nhân tố F tạo nên lực đặc biệt gọi lực tiếp hợp Chính nhờ lực mà xảy tiếp hợp vi khuẩn Trong tế bào Hfr nhân tố F tích hợp vào nhiễm sắc thể vi khuẩn có khả chép với nhiễm sắc thể Ở tế bào Hfr nhân tố F tạo nên lực tiếp hợp, trình tiếp hợp nằm cuối gen, đẩy gen vào tế bào nhận qua cầu nguyên tương nối liền hai tế bào tiếp hợp Ở tế bào Hfr số trường hợp F tách rời khỏi nhiễm sắc thể mang theo đoạn ADN nhiễm sắc thể gọi F’ F’ có khả tự chép vận chuyển vào tế bào nhận F’ vận chuyển số tính trạng vi khuẩn sang vi khuẩn khác F’ sử dụng để phân lập vận chuyển số gen chọn lọc Tiếp hợp thường xảy vi khuẩn loài xảy vi khuẩn khác loài E.coli với Salmonella Shigella tần số tái tổ hợp thấp Ý nghĩa tiếp hợp: Sự tiếp hợp công cụ khảo sát quan trọng nhiều lĩnh vực sinh lý di truyền vi khuẩn cho phép tạo nên vi khuẩn phối hợp nhiều đột biến khác Nhờ kỹ thuật tiếp hợp ngắt quãng người ta thiết lập đồ nhiễm sắc thể vi khuẩn Ngoài chủng F’ sử dụng để nghiên cứu hoạt động số gen Trong thiên nhiên tiếp hợp giữ vai trò đáng kể biến dị vi khuẩn đặc biệt lây lan tính kháng thuốc vi khuẩn Gram âm II DI TRUYỀN VỀ TÍNH KHÁNG THUỐC Các vi khuẩn kháng thuốc tìm thấy khắp nơi kể nơi chưa sử dụng kháng sinh Ngay phát minh penicilin năm 1941, vi khuẩn kháng penicilin báo cáo Ngày vấn đề kháng thuốc trở thành mối bận tâm hàng đầu điều trị bệnh nhiễm trùng kháng sinh đồ thử nghiệm hàng ngày phòng xét nghiệm vi trùng Sự hình thành tính kháng thuốc vi sinh vật biến đổi gen nhiễm sắc thể tiếp nhận plasmid kháng thuốc Vi khuẩn trở nên kháng thuốc qua chế: đột biến, tái tổ hợp thu hoạch plasmid kháng thuốc thu hoạch transposon Đột biến thành kháng thuốc Nhiều thí nghiệm chứng minh tính kháng thuốc phát sinh đột biến, tính kháng thuốc liên hệ đến biến đổi gen nhiễm sắc thể di truyền cho hệ sau Sự đột biến xảy với tần suất 10^-5 - 10^-9 Trong tính kháng thuốc, kháng sinh giữ vai trò chọn lọc vai trò đạo Việc sử dụng rộng rãi kháng sinh làm phát triển nhanh chóng vi khuẩn kháng thuốc cách giết chết vi khuẩn nhạy cảm, tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng thuốc phát sinh đột biến chiếm ưu Sự tái tổ hợp Lúc đột biến kháng thuốc xuất quần thể vi khuẩn vi khuẩn kháng thuốc vận chuyển gen kháng thuốc đến vi khuẩn nhạy cảm theo chế vận chuyển di truyền: biến nạp, tải nạp tiếp hợp tùy theo loài vi khuẩn Sự tái tổ hợp vi khuẩn, vi khuẩn kháng kháng sinh làm xuất vi khuẩn kháng với loại kháng sinh Trong thiên nhiên, vận chuyển gen kháng thuốc tải nạp tiếp hợp xảy với tần suất thấp khoảng 10^-5 Trong biến nạp tần suất chưa biết, thấp Thu hoạch plasmid kháng thuốc Hai chế kháng thuốc liên quan đến gen kháng thuốc nằm nhiễm sắc thể Ở tính kháng thuốc liên hệ đến plasmid nằm nhiễm sắc thể Plasmid kháng thuốc vận chuyển theo chế khác tùy theo vi khuẩn Gram dương vi khuẩn Gram âm 3.1 Plasmid kháng thuốc vi khuẩn Gram âm Năm 1946 lần Nhật Bản người ta phân lập nhiều chủng Shigella kháng với nhiều kháng sinh : streptomycin, chloramphenicol, tetracyclin, sulfonamit Nhân tố chịu trách nhiệm tính kháng nhiều thuốc plasmid kháng thuốc goi nhân tố R Nhân tố R điển hình plasmid lớn với phần, chức riêng biệt Phần thứ RTF gọi nhân tố vận chuyển đề kháng (Resistance transfer factor), khoảng 80 kb chứa gen tự chép tiếp hợp Phần nhỏ định đề kháng (R determinant), kích thước thay đổi chứa gen kháng thuốc (R genes) RTF định đề kháng thông thường tạo nên đơn vị Nhân tố R thường tái tổ hợp với làm phát sinh tổ hợp kháng thuốc Nhân tố R lây truyền rộng rãi nhiều loài vi khuẩn đường ruột mà lây truyền cho nhiều vi khuẩn khác vi khuẩn tả, vi khuẩn dịch hạch Nhân tố R lây truyền vi khuẩn qua tiếp xúc nên tính kháng thuốc lan tràn quần thể vi khuẩn nhạy cảm bệnh truyền nhiễm 3.2 Plasmid kháng thuốc vi khuẩn Gram dương Sự đề kháng nhiều chủng tụ cầu vàng với penicillin, erythromycin nhiều kháng sinh plasmid gây nên Plasmid vi khuẩn Gram dương vận chuyển tiếp hợp mà tải nạp qua trung gian phage Hiện phần lớn chủng tụ cầu kháng penicillin bệnh viện mang plasmid penicillinase 4.Thu hoạch transposon Transposon gọi gen nhảy đoạn ADN, kích thước nhỏ chứa hay nhiều gen có đầu tận chuổi nucleotic giống ngược chiều (inverted repeat) nhảy từ plasmid vào nhiễm sắc thể từ nhiễm sắc thể vào plasmid từ plasmid đến plasmid Tất gen có gen kháng thuốc nằm transposon Những transposon đạo kháng kim loại nặng, tạo thành độc tố khả sử dụng số chất chuyển hóa (lactose, raffinose, histidin, hợp chất lưu huỳnh) mô tả Đặc biệt quan trọng vi sinh học transposon kháng kháng sinh Tn3 mang gen kháng ampicillin, Tn5 mang gen kháng kanamycin, Tn10 mang gen kháng tetracyclin, Tn4 mang gen kháng ba kháng sinh ampicillin, streptomycin sulfamit  ... biệt quan trọng vi sinh học transposon kháng kháng sinh Tn3 mang gen kháng ampicillin, Tn5 mang gen kháng kanamycin, Tn10 mang gen kháng tetracyclin, Tn4 mang gen kháng ba kháng sinh ampicillin,... chuyển đề kháng (Resistance transfer factor), khoảng 80 kb chứa gen tự chép tiếp hợp Phần nhỏ định đề kháng (R determinant), kích thước thay đổi chứa gen kháng thuốc (R genes) RTF định đề kháng... chưa sử dụng kháng sinh Ngay phát minh penicilin năm 1941, vi khuẩn kháng penicilin báo cáo Ngày vấn đề kháng thuốc trở thành mối bận tâm hàng đầu điều trị bệnh nhiễm trùng kháng sinh đồ thử nghiệm