Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cây hẹ ( Allium tuberosum Rotller ex Spreng) trồng tại xã Cẩm Lý, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang đối với 4 chủng vi khuẩn: Stapylococus aurenus, Serratia marcescens, Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa. Kết quả cho thấy, dịch chiết từ các bộ phận của cây hẹ (rễ, thân, lá) có khả năng ức chế cả 4 loài vi khuẩn nghiên cứu. Trong đó, dịch chiết từ thân, lá và rễ có khả năng kháng S. aurenus, B. subtilis cao hơn so với S. marcescens và P. aeruginosa.
SỞ GD & ĐT BẮC GIANG TRƯỜNG THPT CẨM LÝ ĐỖ THỊ YẾN LINH XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT TỪ CÂY HẸ (Allium tuberosum Rotller ex Spreng) TRỒNG TẠI XÃ CẨM LÝ - HUYỆN LỤC NAM - TỈNH BẮC GIANG Người hướng dẫn: TS Nguyễn Hữu Quân - GV ĐH SP Thái Nguyên Th Sỹ Nguyễn Thị Hồng Liên - THPT Cẩm Lý CẨM LÝ, NĂM 2016 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT CÂY HẸ ( Allium tuberosum Rotller ex Spreng) TRỒNG TẠI XÃ CẨM LÝ, HUYỆN LỤC NAM, TỈNH BẮC GIANG Nguyễn Hữu Quân, Nguyễn Thị Hồng Liên, Đỗ Thị Yến Linh TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành nhằm xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết hẹ ( Allium tuberosum Rotller ex Spreng) trồng xã Cẩm Lý, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang chủng vi khuẩn: Stapylococus aurenus, Serratia marcescens, Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa Kết cho thấy, dịch chiết từ phận hẹ (rễ, thân, lá) có khả ức chế loài vi khuẩn nghiên cứu Trong đó, dịch chiết từ thân, rễ có khả kháng S aurenus, B subtilis cao so với S marcescens P aeruginosa 1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Hiện nay, việc sử dụng kháng sinh điều trị bệnh vi khuẩn gây nên ngày phổ biến Việt Nam, giới Một hạn chế gặp phải tình trạng nhờn thuốc kháng sinh điều trị Theo nghiên cứu Lê Văn Tạo (2006) cho thấy, vi khuẩn Escherichia coli kháng lúc với nhiều loại kháng sinh, có 12% số chủng đa kháng với loại kháng sinh, 32% đa kháng với loại kháng sinh, 40% đa kháng với loại kháng sinh, 10% đa kháng với loại kháng sinh So với kháng sinh tân dược, thuốc có chứa kháng sinh tự nhiên không mạnh đủ để chữa khỏi nhiều bệnh nhiễm khuẩn Kháng sinh thực vật có nhiều ưu điểm mà thuốc kháng sinh tân dược Ưu điểm bật kháng sinh thực vật độc, không gây tai biến nguy hiểm Vì vậy, gần đây, người ta nhắc nhiều đến kháng sinh thực vật có xu hướng trở lại với thuốc, sử dụng kháng sinh tự nhiên cỏ Cây hẹ (Allium tuberosum Rotller ex Spreng) trồng phổ biến vùng nông thôn nước ta Theo kinh nghiệm dân gian, hẹ dùng để chữa ho cho trẻ em, hẹ đồng thời gia vị cho số ăn Thành phần hẹ có chứa số kháng sinh thực vật mạnh allcin, orodin, sunfit Nhờ chúng chữa số bệnh ghẻ, chín mé, nhiễm trùng da cách đắp giã nhỏ lên vết thương, tiện lợi cho việc điều trị giun kim trẻ nhỏ mà không sợ tác dụng phụ thuốc tân dược Xuất phát từ lý trên, lựa chọn đề tài nghiên cứu: Xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ Hẹ (Allium tuberosum Rotller ex Spreng) trồng xã Cẩm Lý, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang PHÁT BIỂU GIẢ THUYẾT KHOA HỌC, CÂU HỎI NGHIÊN CỨU, MỤC TIÊU KĨ THUẬT, KẾT QUẢ MONG ĐỢI - Giả thuyết khoa học: Trong Hẹ có chứa số kháng sinh thực vật orodin, sunfua, alicin nên dịch chiết từ Hẹ có khả kháng khuẩn - Câu hỏi nghiên cứu: Dịch chiết từ Hẹ (Allium tuberosum Rotller ex Spreng) trồng xã Cẩm Lý, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang có khả kháng khuẩn không? - Mục tiêu kĩ thuật: Xác định hoạt tính kháng số loài vi khuẩn dịch chiết từ Hẹ thông qua số kĩ thuật sinh học phổ thông - Kết mong đợi: Xác định hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết Hẹ trồng xã Cẩm Lý, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Kế hoạch nghiên cứu Bảng Kế hoạch nghiên cứu STT Các nội dung, công việc chủ yêu cần thực Nghiên cứu tài liệu, tìm hiểu tình hình sử dụng thuốc kháng sinh nay, tìm hiểu Hẹ, kháng sinh thực vật có hẹ Lấy mẫu hẹ số địa điểm thuộc xã Cẩm Lý Tìm hiểu phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn Kết phải đạt Báo cáo tổng quan loại kháng sinh thực vật có Hẹ Thu mẫu Hẹ Tìm phương pháp phù hợp để xác định hoạt tính kháng khuẩn Hẹ Xác định tính kháng khuẩn từ dịch Báo cáo kết kháng chiết Hẹ số khuẩn dịch chiết từ phương pháp truyền thống Hẹ Viết báo cáo Báo cáo trước hội đồng khoa học nhà trường Ghi 3.2 Vật liệu Cây Hẹ trồng xã Cẩm Lý, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang Nguyên liệu thu điều kiện khô ráo, không bị sâu bệnh vào thời gian 12/9/2016 Các chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu gồm: Staphylococus aurenus, Bacillus subtilis, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên cung cấp - Môi trường nghiên cứu: Môi trường LB có thành phần gồm cao nấm men 0,5%, NaCl 1,0%, pepton 1,0% Môi trường LB đặc bổ sung 2% thạch agar - Thí nghiệm tiến hành phòng thí nghiệm Sinh học – THPT Cẩm Lý, phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào phòng Vi sinh – Đại học Sư phạm Thái Nguyên 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Xác định tính kháng khuẩn từ dịch chiết Hẹ - Chuẩn bị dịch chiết: Các phần Hẹ (rễ, thân lá) có khối lượng 2,5g; 5g; 7,5g 10g nghiền lát cối sứ, sau bổ sung 5ml nước cất, hòa lọc bỏ cặn để thu dịch chiết - Nuôi vi khuẩn thử nghiệm: loài vi khuẩn ống thạch nghiêng ria đĩa môi trường LB đặc nuôi 30°C, qua đêm Lấy khuẩn lạc nuôi lọ chứa 3ml môi trường LB lỏng nuôi qua đêm để thử nghiệm - Tiến hành thử nghiệm dịch chiết từ Hẹ vi khuẩn: + Chuẩn bị môi trường LB đặc, khử trùng, đổ đĩa petri + Hút 30µl dịch nuôi vi khuẩn loại nhỏ vào đĩa môi trường, dùng que chang trải mặt thạch khô + Dùng khoan nút chai vô trùng có đường kính 1mm đục lỗ đĩa thạch nhỏ 100 µl dịch chiết từ rễ, thân vào giếng (giếng đối chứng bổ sung 100 µl nước) + Đặt đĩa petri bổ sung dịch vào tủ lạnh 4°C khoảng 1-2h cho dịch chiết khuếch tán môi trường Sau đó, đặt vào tủ ấm nuôi 28°C, từ 18-24h Đo đường kính vòng vô khuẩn, chụp hình ghi lại kết Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Đường kính vòng kháng khuẩn xác định theo công thức: H = D – d (mm) đó: D đường kính vòng vô khuẩn tính từ tâm đục lỗ (mm) d đường kính đục lỗ thạch (mm) 3.3.2 Xử lý số liệu Số liệu thí nghiệm thu xử lý thống kê phần mềm Excel 2007 Phân tích phương sai so sánh trung bình mức ý nghĩa α = 0,05 phần mềm SAS 9.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khả kháng vi khuẩn Staphylococus aurenus từ dịch chiết Hẹ Vi khuẩn S aurenus xem ba tác nhân gây vụ ngộ độc thực phẩm sau Samolena Clostridium pefrigen Vi khuẩn S aurenus loài vi khuẩn có khả kháng thuốc mạnh Khảo sát tính kháng kháng sinh S aurenus thành phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy chủng S aurenus có đến 91,4% chủng kháng với penicilin; 52,9% kháng với ciprofloxacin; 12,5% kháng gentamicin (Nguyễn Thị Kê cs, 2006) Kết xác định hoạt tính kháng vi khuẩn S aurenus dịch chiết từ Hẹ trình bày bảng hình Kết bảng cho thấy, dịch chiết từ Hẹ có khả ức chế vi khuẩn S aurenus phát triển Dịch chiết từ rễ, thân Hẹ ức chế vi khuẩn S aurenus phát triển tăng dần theo nồng đồ có khác Dịch chiết từ rễ, hoạt tính ức chế tăng từ 14,01 mm nồng độ 0,5 đến 17,19 mm nồng độ 2g/ml Đối với dịch chiết từ lá, hoạt tính ức chế tăng từ 18,25mm nồng độ 0,5 g/ml đến 32,23 mm nồng độ 2g/ml Hoạt tính ức chế vi khuẩn tăng từ 16,35mm nồng độ 0,5 g/ml đến 20,11 mm nồng độ 2g/ml dịch chiết từ thân Như vậy, nồng độ khảo sát hoạt tính ức chế vi khuẩn S aureus mạnh dịch chiết từ Hẹ, tiếp đến dịch chiết từ thân Hẹ thấp dịch chiết từ rễ Hẹ Bảng Đường kính vòng vô khuẩn dịch chiết từ Hẹ vi khuẩn S aureus nồng độ khảo sát (mm) STT Mẫu Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ 0,5g/ml 1g/ml 1,5g/ml 2g/ml Thân 16,35 ± 0.04 18,24 ± 0.02 19,28 ± 0.01 20,11 ± 0.02 Lá 18,25 ± 0.02 30,32 ± 0.03 31,26 ± 0.01 32,23 ± 0.01 Rễ 14,01 ± 0.01 16,48 ± 0.01 16.5 ± 0.02 17,19 ± 0.04 A B C D Hình Khả kháng khuẩn dịch chiết từ thân, lá, rễ Hẹ S aurenus A Nồng độ 0.5g/ml B Nồng độ 1g/ml C Nồng độ 1.5g/ml D Nồng độ 2g/ml 4.2 Khả kháng vi khuẩn Bacilus subtilis dịch chiết từ Hẹ Khảo sát khả kháng B subtilis dịch chiết từ Hẹ cho thấy: dịch chiết từ Hẹ có khả ức chế vi khuẩn B subtilis phát triển Sự ức chế khả phát triển B subtilis khác thân, rễ Kết trình bày bảng hình Số liệu bảng cho thấy, tăng nồng độ dịch chiết từ 0,5g/ml, 1g/ml, 1,5g/ml, 2g/ml thấy ức chế vi khuẩn tăng lên Ở nồng độ 2g/ml dịch chiết từ thân, lá, rễ Hẹ ức chế vi khuẩn B subtilis phát triển mạnh Dịch chiết thu từ Hẹ có đường kính vòng kháng khuẩn cao Bảng Đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết từ Hẹ vi khuẩn B subtitis STT Mẫu Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ 0,5g/ml 1g/ml 1,5g/ml 2g/ml Thân 12,22 ± 0.01 16,56 ± 0.02 17,46 ± 0.03 18,67 ± 0.05 Lá 21,29 ± 0.02 24,35 ± 0.01 25,15 ± 0.01 26,53 ± 0.01 Rễ 15,17 ± 0.03 14,49 ± 0.01 15,22 ± 0.04 16,28 ± 0.02 A B Hình Khả kháng khuẩn dịch chiết từ thân, lá, rễ Hẹ vi khuẩn B subtilis A Nồng độ 0,5g/ml B Nồng độ 1g/ml 4.3 Khả kháng vi khuẩn Serratia marcescens dịch chiết từ Hẹ Vi khuẩn S marcescens gây nên bệnh viêm phổi, nhiễm trùng huyết, viêm màng não, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng mắt Khảo sát khả kháng vi khuẩn S marcescens dịch chiết từ Hẹ cho thấy: dịch chiết từ Hẹ có khả ức chế vi khuẩn S marcescens phát triển Sự ức chế khả phát triển vi khuẩn S marcescens khác thân, rễ Kết trình bày bảng hình Kết bảng cho thấy, tăng nồng độ dịch chiết từ 0,5g/ml, 1g/ml, 1,5g/ml, 2g/ml thấy ức chế vi khuẩn tăng lên Ở nồng độ 2g/ml, dịch chiết từ Hẹ có khả ức chế vi khuẩn S marcescens phát triển mạnh Bảng Đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết từ Hẹ vi khuẩn S marcescens STT Mẫu Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ 0,5g/ml 1g/ml 1,5g/ml 2g/ml Thân 15,16 ± 0.01 18,45 ± 0.02 19,11 ± 0.03 19,15 ± 0.02 Lá 18,23 ± 0.02 21,37 ± 0.01 23,29 ± 0.01 25,28 ± 0.01 Rễ 14,25 ± 0.01 19,23 ± 0.04 20,14 ± 0.02 22,37 ± 0.03 So sánh đường kính vòng kháng khuẩn vi khuẩn S marcescens với đường kính vòng kháng khuẩn vi khuẩn B subtilis S aurenus nhận thấy đường kính vòng kháng khuẩn vi khuẩn S marcescens nhỏ hơn, chứng tỏ khả ức chế vi khuẩn dịch chiết Hẹ vi khuẩn S marcescens Hình Khả kháng khuẩn dịch chiết từ thân, lá, rễ Hẹ vi khuẩn S marcescens nồng độ 1g/ml 4.4 Khả kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dịch chiết từ Hẹ Vi khuẩn P aeruginosa (hay gọi trực khuẩn mủ xanh) vi khuẩn phổ biến gây bệnh động vật người Khảo sát khả kháng vi khuẩn P aeruginosa dịch chiết từ Hẹ cho thấy: dịch chiết từ Hẹ có khả ức chế vi khuẩn P aeruginosa phát triển Sự ức chế khả phát triển vi khuẩn P aeruginosa khác thân, rễ Kết trình bày bảng hình Kết bảng cho thấy, tăng nồng độ dịch chiết thân, rễ Hẹ từ 0,5g/ml, 1g/ml, 1,5g/ml, 2g/ml thấy ức chế vi khuẩn tăng lên, nhiên đường kính vòng kháng khuẩn tăng lên không lớn Ở nồng độ 2g/ml ức chế vi khuẩn phát triển mạnh Dịch chiết thu từ Hẹ có đường kính vòng kháng khuẩn cao đạt 16,19 mm Bảng Đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết từ Hẹ vi khuẩn P aeruginosa STT Mẫu Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ 0,5g/ml 1g/ml 1,5g/ml 2g/ml Thân 11,16 ± 0.01 12,27 ± 0.02 13,18 ± 0.04 14,25 ± 0.01 Lá 13,25 ± 0.02 14,05 ± 0.01 15,29 ± 0.01 16,19 ± 0.02 Rễ 10,21 ± 0.01 12,41 ± 0.03 13,22 ± 0.02 14,28 ± 0.01 Hình Khả kháng khuẩn dịch chiết từ thân, lá, rễ Hẹ vi khuẩn P aeruginosa nồng độ 1g/ml So sánh đường kính vòng kháng khuẩn loài vi khuẩn khảo sát cho thấy, đường kính vòng kháng khuẩn vi khuẩn S aurenus B subtilis cao so với vi khuẩn S marcescens P aeruginosa Như khẳng định rằng, dịch chiết từ thân, rễ Hẹ có khả kháng vi khuẩn S aurenus, B subtilis cao so với vi khuẩn S marcescens P aeruginosa Kết bước đầu cho thấy, tác động dịch chiết từ Hẹ lên vi khuẩn Gram dương (S aurenus, B subtilis) mạnh vi khuẩn Gram âm (S marcescens, P aeruginosa) Điều giải thích khác thành tế bào hai loại vi khuẩn gram âm gram dương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.KẾT LUẬN - Xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ Hẹ vi khuẩn S aureus, S marcescens, B subtilis, P aeruginosa phương pháp vòng kháng khuẩn - Dịch chiết từ phận rễ, thân Hẹ có khả ức chế vi khuẩn S aurenus S marcescens cao so với vi khuẩn P aeruginosa B subtilis Dịch chiết thu từ thân có khả ức chế chủng vi khuẩn cao so với dịch chiết thu từ rễ 5.2 ĐỀ NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu khả kháng khuẩn dịch chiết từ Hẹ tinh sạch, xác định cấu trúc, tính chất chất có dịch chiết từ Hẹ có khả kháng khuẩn để tìm nồng độ ức chế hoàn toàn số loài vi khuẩn kiểm định TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Tất Lợi (2003), Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Hoàng Lan, Bùi Quang Thuật, Lê Danh Tuyên, Nguyễn Thị Ngọc Duyên (2015), Khả kháng khuẩn tinh dầu tía tô, Tạp chí Khoa học phát triển, tập 13, số 2, tr 245 – 250 Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2003, Thí nghiệm Công nghệ sinh học, NXB ĐH Quốc gia, HCM, tập – Thí nghiệm vi sinh vật Nguyễn Thị Kê, Nguyễn Xuân Mai, Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Thương, Bùi Thị Kiều Nương, Nguyễn Trần Chính, Cao Minh Nga, Cao Ngọc Nga (2006), Khảo sát tính kháng kháng sinh số chủng vi sinh vật lây qua đường tiêu hóa, Y học thành phố Hồ Chí Minh, số đặc biệt chuyên đề y tế công cộng y tế cộng đồng, phụ tập 10, tr 406- 411 Trần Mỹ Linh, Vũ Hương Giang, Lê Quỳnh Liên, Nguyễn Tường Vân, Ninh Khắc Bản, Châu Văn Minh (2013), Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn kiểm định số loài thực vật ngập mặn vườn quốc gia Giao Thủy, Nam Định, Tạp chí Sinh học, tập 35, tr 342 – 347 ... có Hẹ Thu mẫu Hẹ Tìm phương pháp phù hợp để xác định hoạt tính kháng khuẩn Hẹ Xác định tính kháng khuẩn từ dịch Báo cáo kết kháng chiết Hẹ số khuẩn dịch chiết từ phương pháp truyền thống Hẹ Viết... khuẩn dịch chiết Hẹ vi khuẩn S marcescens Hình Khả kháng khuẩn dịch chiết từ thân, lá, rễ Hẹ vi khuẩn S marcescens nồng độ 1g/ml 4.4 Khả kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dịch chiết từ Hẹ Vi khuẩn. .. chiết từ thân Như vậy, nồng độ khảo sát hoạt tính ức chế vi khuẩn S aureus mạnh dịch chiết từ Hẹ, tiếp đến dịch chiết từ thân Hẹ thấp dịch chiết từ rễ Hẹ Bảng Đường kính vòng vô khuẩn dịch chiết từ