Nghiên cứu khả năng ứng dụng enzym glucose oxidase cố định trong sản xuất axit gluconic

Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ĐẶNG THỊ THANH XUÂN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG ENZYM GLUCOSE OXIDASE CỐ ĐỊNH TRONG SẢN XUẤT AXIT GLUCONIC Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Đồ uống Mã ngành: 60 54 02 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT Đà Nẵng – Năm 2011 Footer Page of 126 Header Page of 126 Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: TS ĐẶNG MINH NHẬT Phản biện 1: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh Phản biện 2: TS Huỳnh Ngọc Thạch Luận văn ñược bảo vệ trước Hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ kỹ thuật họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 03 tháng 12 năm 2011 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin – Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Axít gluconic sản phẩm thu ñược từ trình oxy hóa βD-Glucozơ nhờ enzym glucose oxidase, ñược phát lần ñầu tiên vào năm 1870 Hasiwetz Habermann Trong công nghiệp, axít gluconic muối ñược ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực như: y dược, dệt, thuộc da, sản xuất xi măng, luyện kim thực phẩm Hàng năm giới axít gluconic ñược sản xuất với sản lượng ñạt khoảng 100.000 tấn/năm Trong ñó, khoảng 60% sản phẩm thu ñược chủ yếu trình sinh hoá oxy hóa với tác nhân enzym glucose oxidase nấm mốc (Asp niger) hay glucose dehydrogenaza vi khuẩn (Gluconobacter).Tuy nhiên, sử dụng vi sinh vật ñể lên men gặp hạn chế thời gian lên men kéo dài, sản phẩm không tinh khiết, cần giai ñoạn tách vi sinh vật… Với việc sử dụng enzym glucose oxidase, 100% glucozơ chuyển hóa thành axít gluconic thời gian ngắn Tuy nhiên, việc sử dụng enzym hòa tan bị giới hạn ức chế sản phẩm cuối, giá thành sản phẩm cao, không ổn ñịnh, khả tái sử dụng khó thu hồi Vì vậy, kỹ thuật cố ñịnh enzym giá thể tạo dạng enzym cố ñịnh (enzym không hòa tan) ñang ñược quan tâm nghiên cứu Trên giới, ña phần nghiên cứu cố ñịnh enzym glucose oxidase ñều tập trung vào việc nghiên cứu ứng dụng enzym glucose oxidase cố ñịnh ngành công nghiệp dệt hay làm cảm biến sinh học Ở Việt Nam, trình oxy hóa chọn lọc glucozơ tạo thành axít gluconic chưa ñược quan tâm nghiên cứu Footer Page of 126 Header Page of 126 Vì vậy, chọn ñề tài “Nghiên cứu khả ứng dụng enzym glucose oxidase cố ñịnh sản xuất axít gluconic” nhằm góp phần nhỏ vào giải pháp công nghệ cho ngành công nghiệp sản xuất axít gluconic MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Khảo sát hiệu trình cố ñịnh enzym glucose oxidase, nghiên cứu thông số kỹ thuật thích hợp cho trình chuyển hóa glucose thành axít gluconic Từ ñó, xây dựng quy trình sản xuất axít gluconic quy mô phòng thí nghiệm, sử dụng enzym glucose oxidase cố ñịnh ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Đối tương nghiên cứu : + Glucozơ + Enzym glucose oxidase + Natri alginat dạng sợi - Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu quy mô phòng thí nghiệm PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4.1 Phương pháp hóa lý + Xác ñịnh pH dung dịch pH kế + Xác ñịnh ñộ hòa tan hạt gel 4.2 Phương pháp hóa học Xác ñịnh hàm lượng ñường khử phương pháp DNS 4.3 Phương pháp hóa sinh Xác ñịnh hoạt ñộ enzym glucose oxidase 4.4 Phương pháp công nghệ + Phương pháp tạo gel + Phương pháp oxy hóa glucozơ thành axít gluconic Footer Page of 126 Header Page of 126 5 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI Các số liệu nghiên cứu ñược phân tích phương pháp phân tích khoa học, xác ñáng tin cậy Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Đề tài mở khả ứng dụng enzym glucose oxidase cố ñịnh công nghệ sản xuất axít gluconic ñặt sở cho việc xây dựng công nghệ sản xuất axít gluconic Việt Nam KẾT CẤU CỦA LUẬN VĂN Các phần luận văn bao gồm: Chương – Tổng quan tài liệu Chương – Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Chương – Kết thảo luận Footer Page of 126 Header Page of 126 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 D – GLUCOZƠ 1.1.1 Cấu tạo tính chất D-glucozơ 1.1.2 Quá trình oxy hóa D-glucozơ 1.1.2.1 Phương pháp cổ ñiển oxy hóa glucozơ 1.1.2.2 Phản ứng oxy hoá glucozơ với xúc tác enzym 1.2 ENZYM GLUCOSE OXIDASE (GOD) 1.2.1 Cấu trúc enzym 1.2.2 Cơ chế xúc tác enzym glucose oxidase Glucose oxidase oxy hóa β-D-glucozơ tạo thành Dglucono-1,5-lacton, D-glucono-1,5-lacton sau ñó tự ñộng thủy phân ñể tạo gluconic axít C6H12O6 + H2O + ½ O2 C6H12O7 + H2O2 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến vận tốc phản ứng enzym glucose oxidase 1.2.3.1 Ảnh hưởng nồng ñộ enzym 1.2.3.2 Ảnh hưởng chất 1.2.3.3 Ảnh hưởng pH 1.2.3.4 Ảnh hưởng nhiệt ñộ 1.2.3.5 Ảnh hưởng cường ñộ O2 1.2.3.6 Ảnh hưởng chất kìm hãm 1.2.4 Ứng dụng enzym GOD 1.2.4.1 Ứng dụng GOD công nghiệp thực phẩm 1.2.4.2 Ứng dụng enzym GOD công nghiệp sản xuất axít gluconic 1.2.4.3 Sử dụng glucose oxidase phương pháp ño hàm lượng glucozơ máu 1.3 ENZYM CỐ ĐỊNH Footer Page of 126 Header Page of 126 1.3.1 Khái niệm, ñặc ñiểm enzym cố ñịnh 1.3.1.1 Khái niệm 1.3.1.2 Đặc ñiểm 1.3.2 Chất mang dùng ñể cố ñịnh enzym Chất mang chất ñể enzym gắn lên (thường chất làm giá thể có tích ñiện liên kết bền với enzym), chất mang vật chất nhốt giữ enzym không gian ñịnh Chất mang phải không tan môi trường hoạt ñộng enzym, phải không ñộc, trơ với vi sinh vật hóa chất (không bị phân hủy), phải có nhiều vị trí ñể enzym gắn vào, dễ kiếm rẻ Ngoài chất mang phải có ñộ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn 1.3.2.1 Chất mang polyme hữu Chất mang polyme tự nhiên - Chất mang polysacarit (gluxit) : xenlulozơ, aga, dextran, alginat, caragenan, sephadex dẫn xuất chúng - Chất mang protein : Chất mang protein thường dùng gelatin, keratin, albumin Chất mang polyme tổng hợp 1.3.2.2 Chất mang vô 1.3 Các phương pháp cố ñịnh enzym 1.3.3.1 Phương pháp hấp phụ 1.3.3.2 Phương pháp cộng hóa trị 1.3.3.3 Phương pháp bẫy enzym 1.3.3.4 Phương pháp bao gói (nhốt) enzym Đây phương pháp ñơn giản, enzym bị biến ñổi trình cố ñịnh Phương pháp cố ñịnh nhiều enzym Footer Page of 126 Header Page of 126 lúc Giới hạn phương pháp hạn chế khả tiếp xúc enzym chất, ñó hoạt ñộ enzym thường thấp, trường hợp chất có trọng lượng phân tử lớn Enzym ñược bao bọc màng không thẩm thấu ñối với enzym chất có trọng lượng phân tử cao, lại cho chất sản phẩm thẩm thấu qua cách dễ dàng Nhốt cấu trúc mạng gel Phương pháp bao gồm việc nhốt giữ phân tử enzym khe cấu trúc gel liên kết chéo không tan nước Phương pháp nhốt gel hệ sợi Phương pháp gói bao vi thể Phương pháp siêu lọc 1.3.4 Ứng dụng enzym cố ñịnh 1.3.4.1 Trong công nghiệp 1.3.4.2 Trong y học 1.3.4.3 Trong nghiên cứu khoa học 1.4 ALGINAT 1.4.1 Cấu trúc alginat 1.4.2 Cơ chế tạo gel 1.4.2.1 Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên Nhỏ dung dịch alginat vào dung dịch có chứa cation có khả tạo gel (thường gặp Ca2+) Bề mặt hạt alginat bị gel hóa Tiếp theo ñó, cation tạo gel bên hạt tiếp tục khuếch tán vào bên làm cho phân tử alginat bên tiếp tục bị gel hóa Quá trình xảy bề mặt hạt phát triển vào bên Footer Page of 126 Header Page of 126 1.4.2.2 Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên 1.4.3 Ưu, nhược ñiểm việc cố ñịnh enzym gel lginat 1.4.3.1 Ưu ñiểm 1.4.3.2 Nhược ñiểm 1.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng ñến ñộ bền gel alginate 1.4.4.1 Ảnh hưởng thành phần alginat 1.4.4.2 Ảnh hưởng nồng ñộ alginat 1.4.4.3 Ảnh hưởng pH tạo gel 1.4.4.4 Ảnh hưởng nhiệt ñộ tạo gel 1.5 AXÍT D-GLUCONIC 1.5.1 Axít D-gluconic muối gluconat 1.5.1.1 Cấu tạo axít D-gluconic 1.5.1.2 Tính chất axít gluconic muối gluconat 1.5.1.3 Ứng dụng axít gluconic muối gluconat 1.5.2 Sản xuất axít gluconic muối gluconat 1.5.2.1 Sản xuất từ Aspergillus niger Penicillium luteum 1.5.2.2 Sản xuất gluconic axít từ vi khuẩn 1.5.2.3 Sản xuất gluconic axít từ enzym glucose oxidase 1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYM GLUCOSE OXIDASE VÀ ỨNG DỤNG ENZYM TRONG SẢN XUẤT AXÍT GLUCONIC Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.1.1 D-Glucozơ 2.1.1.2 Enzym Glucose oxidase Enzym Glucose oxidase từ Aspergillus niger ñược mua từ công ty Sigma –Aldrich với ñặc tính sau: - Hoạt ñộ enzym: 2.000 – 10.000 UI/g - pHopt = 5.1 - topt = 35oC - Điều kiện bảo quản: -20oC 2.1.1.3 Alginat 2.1.2 Hóa chất phương tiện nghiên cứu 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp cố ñịnh enzym 2.2.1.1 Quy trình cố ñịnh enzym - Tạo dung dịch sodium alginat Trộn ñều enzym dung dịch natri alginat theo tỉ lệ tạo hỗn hợp enzym glucose oxidase–natri alginat - Cho hỗn hợp nhỏ giọt xuống dung dịch CaCl2 từ khoảng cách 20cm tạo thành hạt có kích thước từ 3–4 mm Để yên ñể hạt gel tủa lại Enzym ñã ñược bao bọc bên hạt gel - Rửa hạt gel nước cất (2 lần) ñể loại bỏ hoàn toàn lượng enzym chưa ñược cố ñịnh Sau ñó sấy nhẹ 40oC ñể hạt gel khô giữ tủ lạnh ñể sử dụng cho thí nghiệm sau Footer Page 10 of 126 Header Page 12 of 126 12 t: thời gian thực phản ứng với enzym (phút) me: khối lượng enzym sử dụng (mg) Vm: thể tích dung dịch glucozơ tham gia phản ứng xúc tác với enzym (ml) Vpư: thể tích dung dịch glucozơ tham gia phản ứng DNS (ml) 2.2.4 Phương pháp khảo sát hoạt ñộ enzym 2.2.4.1 Khảo sát hoạt ñộ enzym tự (hòa tan) Hòa tan 10mg enzym GOD 10ml dung dịch ñệm axetat Khuấy ñều hút 1ml dung dịch enzym cho phản ứng với 1ml dung dịch glucozơ 0.32M Sau 10 phút phản ứng, hút hỗn hợp xác ñịnh hàm lượng glucozơ lại theo phương pháp DNS 2.2.4.2 Khảo sát hoạt ñộ enzym cố ñịnh 15 mg enzym GOD ñược cố ñịnh gel canxi alginat theo mục 2.2.1 Cho lượng enzym cố ñịnh xúc tác phản ứng chuyển hóa glucozơ thành axít gluconic Sau 10 phút phản ứng, lọc thu enzym cố ñịnh dung dịch sau phản ứng, xác ñịnh hàm lượng glucozơ lại dung dịch Từ ñó xác ñịnh hoạt ñộ enzym cố ñịnh 2.2.4.3 Xác ñịnh hiệu suất cố ñịnh enzym (2.3) Trong ñó: HñA0: Hoạt ñộ enzym tự ban ñầu dùng ñể cố ñịnh (UI/mg) HñA: Hoạt ñộ enzym sau cố ñịnh (UI/mg) Footer Page 12 of 126 Header Page 13 of 126 13 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA CHẾ PHẨM ENZYM Trước ñưa enzym vào nghiên cứu kiểm tra hoạt ñộ enzym ñể ñánh giá chất lượng sản phẩm Hoạt ñộ enzyme ñược xác ñịnh dựa vào ñường chuẩn glucozơ Hình 3.1 Đường chuẩn Glucozơ Phương trình ñường chuẩn glucozơ: y = 2.762x-0.009 với R = 0.998 Hoạt ñộ enzym GOD ñược xác ñịnh 9.7 UI/mg, kết phù hợp với thông số công nghệ sản phẩm nhà sản xuất công bố (2-10UI/mg) Như vậy, enzym giữ ñược hoạt ñộ thời gian bảo quản phù hợp ñể sử dụng cho nghiên cứu 3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ TẠO GEL ĐẾN HOẠT ĐỘ ENZYM GOD CỐ ĐỊNH 3.2.1 Xác ñịnh ñộ bền axít gel canxi alginat Cố ñịnh enzym phương pháp bao gói gel ñược nghiên cứu nhiều khả cố ñịnh cao, enzym không bị thất thoát nhiều, số lần tái sử dụng cao trình cố ñịnh diễn nhanh, ñơn giản an toàn Tham khảo nghiên cứu so sánh ñặc tính loại gel, chọn alginat làm chất mang ñể cố ñịnh enzym glucose Footer Page 13 of 126 Header Page 14 of 126 14 oxidase CaCl2 làm chất hỗ trợ tạo gel Gel ñược tạo thành theo phương pháp tạo gel từ bên Độ hòa tan hạt gel alginat ñược thể bảng 3.1 Bảng 3.1 Độ hòa tan gel canxi alginat môi trường axít pH 3.5 Độ hoà tan 20% 11.76% 4.5 3.57% 0.6% 0% Ở pH 4.5 hạt gel giữ nguyên trạng thái ban ñầu thời gian ngâm pH4%) hạt gel bền cứng hơn, cố ñịnh ñược nhiều enzym hàm lượng alginat cao ñồng nghĩa với ñộ nhớt dung dịch cao, kích thước lỗ gel nhỏ, ñó ngăn cản khuếch tán chất vào bên hạt gel ñể tiếp xúc với enzym khuếch tán sản phẩm Sản phẩm tạo thành tích lũy tâm hạt gel ức chế hoạt ñộng enzym cố ñịnh bên Do vậy, hàm lượng alginat cao, hoạt ñộ enzym giảm Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng ñộ alginat ñến hoạt ñộ enzym GOD cố ñịnh 3.2.3 Ảnh hưởng nồng ñộ ion canxi ñến hoạt ñộ enzym GOD cố ñịnh Tiến hành cố ñịnh enzym GOD nồng ñộ alginat 3% dung dịch CaCl2 từ 0.1 ñến 0.3M Hoạt ñộ enzym cố ñịnh cao sử dụng CaCl2 0.2M Khi thay ñổi nồng ñộ CaCl2 hoạt ñộ enzym giảm xuống nồng ñộ CaCl2 thay ñổi lực ion môi trường gel thay ñổi theo ñã làm ảnh hưởng ñến hoạt ñộ enzym cố ñịnh Footer Page 15 of 126 Header Page 16 of 126 16 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng ñộ ion canxi ñến hoạt ñộ enzym cố ñịnh Như enzym GOD cho hoạt ñộ cao sử dụng alginat có nồng ñộ 3% dung dịch CaCl2 0.2M Đây thông số ñể cố ñịnh enzym GOD sử dụng cho nghiên cứu tác giả 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA pH, NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT ĐỘ CỦA ENZYM GOD 3.3.1 Ảnh hưởng pH ñến hoạt ñộ enzyme GOD 3.3.1.1 Ảnh hưởng pH ñến hoạt ñộ enzym GOD hòa tan 3.3.1.2 Ảnh hưởng pH ñến hoạt ñộ enzym GOD cố ñịnh Khi khảo sát ñể so sánh hoạt ñộ enzym tự cố ñịnh môi trường pH từ ñến 8, nhiệt ñộ 35oC 10 phút ta thấy: enzym tự cố ñịnh ñều hoạt ñộng mạnh khoảng pH 56 Khi tăng pH môi trường ñến hoạt ñộ enzym thấp Tuy nhiên, enzym cố ñịnh lại có tính ổn ñịnh cao so với enzym hòa tan pH môi trường thay ñổi Footer Page 16 of 126 Header Page 17 of 126 17 Hình 3.7 Hoạt ñộ tương ñối enzym GOD hòa tan cố ñịnh theo biến thiên pH môi trường 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt ñộ enzym GOD 3.3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt ñộ enzym GOD hòa tan Nhiệt ñộ tối thích cho hoạt ñộng enzym từ 35 ñến o 40 C (cao 35oC) Nhiệt ñộ tăng cao enzym hoạt ñộng Khi nhiệt ñộ tăng lên 45oC hoạt ñộ enzym giảm dần 3.3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt ñộ enzym GOD cố ñịnh Tiến hành cố ñịnh enzym gel alginat 3%, cho xúc tác phản ứng chuyển hóa glucozơ pH = 5.1, nhiệt ñộ thay ñổi khoảng 30-80oC Enzym GOD có khoảng nhiệt ñộ hoạt ñộng tối ưu từ 30oC ñến 40oC cao 40oC, tăng 5oC so với enzym hòa tan Nhiệt ñộ tăng hoạt ñộ enzym giảm Enzym GOD cố ñịnh có khả chịu nhiệt tốt so với enzym hòa tan Tăng nhiệt ñộ lên 80oC, hoạt ñộ enzym hòa tan giảm 27.1% enzym cố ñịnh giảm 35.81% (hình 3.10) Việc trì cấu trúc bậc enzym yếu tố quan trọng làm tăng tính chịu nhiệt enzym cố ñinh Như vậy, gel alginat không Footer Page 17 of 126 Header Page 18 of 126 18 làm thay ñổi nhiệt ñộ tối ưu enzym mà làm tăng khả chịu nhiệt enzym Hình 3.10 Hoạt ñộ tương ñối enzym GOD hòa tan cố ñịnh theo biến thiên nhiệt ñộ 3.4 KHẢO SÁT HIỆU QUẢ SỬ DỤNG CỦA ENZYM GOD CỐ ĐỊNH Hiệu sử dụng enzym GOD cố ñịnh ñược xác ñịnh thông qua lần sử dụng (7 giờ/lần) Sau lần sử dụng, enzym ñược lấy khỏi dung dịch phản ứng cách dễ dàng, rửa ngâm vào dung dịch ñệm axetat có pH 5.1 ñể hoạt hóa trở lại Kết cho thấy sau lần sử dụng, hoạt ñộ enzym giảm dần thất thoát enzym lần rửa Hoạt dộ enzym sau lần sử dụng 29.64% so với hoạt ñộ ban ñầu Như vậy, nên tái sử dụng enzyme GOD lần ñể ñảm bảo hiệu suất sản xuất Hình 3.13 Hoạt ñộ tương ñối enzym GOD cố ñịnh Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 19 trình tái sử dụng XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT AXÍT GLUCONIC BẰNG ENZYM GLUCOSE OXIDASE CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINAT Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng ñộ glucozơ ñến hiệu suất chuyển hóa glucozơ Khảo sát thời gian chuyển hóa dung dịch glucozơ có nồng ñộ từ 25 – 40% với tỷ lệ bổ sung enzym cố ñịnh 28UI/g glucozơ theo lần: lần thứ bắt ñầu phản ứng lần thứ hai sau phản ứng xảy 10 giờ, sử dụng dung dịch Ca(OH)2 bổ sung dư hàng ñể ñịnh tính khả chuyển hóa glucozơ thành axít gluconic với dung dịch phenolphthalein 1% làm chất thị Thời ñiểm kết thúc phản ứng ñược coi thời ñiểm dung dịch phản ứng (có màu hồng nhạt) không bị ñổi màu sau Sau phản ứng kết thúc, tiến hành xác ñịnh hàm lượng glucozơ lại theo phương pháp DNS ñường chuẩn Hiệu suất chuyển hóa ñược xác ñịnh theo công thức sau: Trong ñó: C1: hàm lượng glucozơ ban ñầu sử dụng cho phản ứng (g/l) C2: hàm lượng glucozơ lại sau phản ứng kết thúc (g/l) Kết bảng 3.2 cho thấy hiệu suất chuyển hóa glucozơ enzym GOD cố ñịnh ñều nhỏ 100% thời ñiểm kết thúc phản ứng, ñiều có nghĩa hàm lượng nhỏ glucozơ sót lại dung dịch, không bị oxy hóa enzym GOD cố Footer Page 19 of 126 Header Page 20 of 126 20 ñịnh khoảng thời gian trước kết thúc phản ứng Từ ñó, nhận xét chủ quan enzym GOD cố ñịnh ñã bị vô hoạt thời ñiểm nên khả xúc tác chuyển hóa phản ứng Bảng 3.2 Hiệu suất chuyển hóa glucozơ thành axít gluconic tương ứng với nồng ñộ glucozơ khác Nồng ñộ glucozơ Thời gian phản ứng hoàn toàn Hiệu suất chuyển 25% 30% 35% 40% 22 24 30 38 99.4% 99.25% 99.32% 99.5% hóa Như vậy, thời gian chuyển hóa hoàn toàn glucozơ thành axít gluconic ñược xem thời gian cần thiết ñể chuyển hóa 99% chất Ở ñây, chọn thời gian chuyển hóa hoàn toàn thời ñiểm trước thời ñiểm kết thúc phản ứng Kết ñược thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Thời gian chuyển hóa hoàn toàn dung dịch glucozơ thành axít gluconic Nồng ñộ glucozơ Thời gian chuyển hóa hoàn toàn 25% 30% 35% 40% 20 22 28 36 Về nguyên tắc, nồng ñộ chất thấp tương ứng với nồng ñộ enzym cao tốc ñộ phản ứng cao, thời gian phản ứng nhanh Khi sử dụng glucozơ 25% enzym 20 ñể chuyển hóa hoàn toàn, sử dụng glucozơ 30% 22 Tiếp tục tăng nồng ñộ glucozơ lên 35% 40% 28 36 giờ, Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 21 chênh lệch khoảng thời gian lớn so với việc sử dụng glucozơ nồng ñộ thấp Nguyên nhân kết nồng ñộ chất cao ñộ nhớt dung dịch cao làm cản trở trình khuyếch tán chất vào gel ñể phản ứng với enzym, ñồng thời oxy khó lưu thông dung dịch phản ứng, làm giảm khả xúc tác phản ứng enzym, làm cho thời gian chuyển hóa kéo dài Ngoài ra, nhà máy sản xuất glucozơ, nồng ñộ siro glucozơ thường 30-40% [60] Do vậy, nồng ñộ dung dịch glucozơ 30% ñược xem thích hợp ñể làm nguyên liệu sản xuất axít gluconic 3.5.2 Ảnh hưởng nồng ñộ dung dịch Ca(OH)2 ñến kết thu nhận canxi gluconat Khi tiến hành so sánh khả thu hồi canxi gluconat sử dụng dung dịch Ca(OH)2 bão hòa dung dịch Ca(OH)2 bão hòa (6g/100ml) cho thấy: khối lượng canxi gluconat thu ñược sử dụng dung dịch bão hòa Ca(OH)2 39.7g, sử dụng dung dịch Ca(OH)2 bão hòa có 5.8gam Như vậy, sử dụng dung dịch bão hòa Ca(OH)2 cho hiệu suất thu nhận sản phẩm cao so với Ca(OH)2 bão hòa 3.5.3 Khảo sát ñộ cồn thích hợp cho trình kết tủa canxi gluconat Để thu nhận canxi gluconat sản phẩm trung gian sử dụng etanl (cồn) ñể kết tủa Khảo sát trình kết tủa canxi gluconat dung dịch cồn từ 70 ñến 99.5 ñộ vởi tỷ lệ bổ sung 1:1 thể tích so với dung dịch Kết thu ñược cho thấy sử dụng cồn tuyệt ñối cho kết tủa canxi gluconat lớn (bảng 3.4) Footer Page 21 of 126 Header Page 22 of 126 22 Bảng 3.4 Khối lượng canxi gluconat thu ñược theo dung dịch cồn Độ cồn 70 80 90 99.5 mCanxi gluconat (g) 33.79 34.63 38.86 39.70 Tiếp tục khảo sát tỷ lệ dung dịch cồn tuyệt ñối dung dịch sau phản ứng với tỷ lệ 1:1, 1.5:1 0.5:1 thể tích, ta có kết thể bảng 3.5 Bảng 3.5 Khối lượng canxi gluconat thu ñược theo tỷ lệ bổ sung cồn tuyệt ñối so với dung dịch sau phản ứng Tỷ lệ cồn:dung dịch 0.5:1 1:1 1.5:1 38.8 39.7 39.7 phản ứng mcanxi gluconat (g) Như vậy, ñể kết tủa canxi gluconat hiệu nhất, ta sử dụng cồn tuyệt ñối với tỷ lệ 1:1 so với dung dịch phản ứng (về thể tích) Footer Page 22 of 126 Header Page 23 of 126 23 3.5.4 Quy trình công nghệ sản xuất axít gluconic quy mô phòng thí nghiệm 3.5.4.1 Quy trình công nghệ Oxy hóa (pH=5-7, t=35-400C) 3.5.4.2 Thuyết minh quy trình a Chuẩn bị nguyên liệu: - Dung dịch glucozơ 30% Enzym GOD cố ñịnh b Quá trình chuyển hóa glucozơ thành axít gluconic: Điều kiện thích hợp cho hoạt ñộng enzym ñiều kiện ñể sản xuất axít gluconic ñạt hiệu Từ ñó, chọn thông số trình sản xuất pH = - nhiệt ñộ = 35 - 40oC Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 24 Với tỷ lệ 28UI enzym/1g glucozơ, enzym GOD cố ñịnh ñược cho vào dung dịch glucozơ 30% ñược giữ 40oC (bằng tủ ấm) Trong thời gian chuyển hóa, lượng axít gluconic tạo thành làm pH dung dịch giảm xuống, ta sử dụng dung dịch bão hòa Ca(OH)2 (6g/100ml) ñể ñiều chỉnh pH khoảng 5-7, ñồng thời tạo muối canxi gluconat Phản ứng chuyển hóa glucozơ phản ứng oxy hóa, cần cung cấp oxy cho phản ứng cách khuấy sục khí nhẹ Sau 22 phản ứng, tách enzym khỏi dung dịch cách lọc, enzym ñược rửa hoạt hóa cách ngâm dung dịch ñệm axetat Dung dịch thu ñược cô ñặc ñể tăng nồng ñộ canxi gluconat bổ sung cồn tuyệt ñối theo tỷ lệ 1:1 thể tích Để yên 12 giờ, ly tâm thu kết tủa sấy 70oC ta thu ñược canxi gluconat Sử dụng dung dịch H2SO4 2M ñể hòa tan canxi gluconat, lượng H2SO4 sử dụng phải vừa ñủ với lượng canxi gluconat Sau phản ứng, ly tâm tách kết tủa CaSO4, ta thu ñược dung dịch thu gluconic c Kết quả: - Khối lượng glucozơ sử dụng: 52.14g Khối lượng canxi gluconat tạo thành theo lý thuyết (mlt): 57.19g - Khối lượng canxi gluconat thu ñược thực tế (mtt): 39.7g Hiệu suất thu nhận canxi gluconat: H = (mlt/mtt)*100 = 69.4% - Lượng axít gluconic thu ñược: 46.1 ml dung dịch axít gluconic 78.4% Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu số liệu thực nghiệm, rút số kết luận sau: Đã cố ñịnh thành công enzym glucose oxidase gel alginat 3% chất hỗ trợ CaCl2 0.2M phương pháp bao gói với hiệu suất cố ñịnh 77.09% Hạt gel tạo thành có kích thước 34mm Enzym GOD cố ñịnh có pH tối ưu 5-6 (cao pH = 5), giống enzym hòa tan Tuy nhiên enzym cố ñịnh có tính ổn ñịnh cao so với enzym hòa tan pH môi trường thay ñổi Nhiệt ñộ tối ưu enzym GOD cố ñịnh gel alginat từ 30-40oC (cao 40oC), tăng 5oC so với enzym hòa tan Như vậy, bao gói enzym gel alginat, enzym có tính chịu nhiệt bền nhiệt cao so với enzym không ñược cố ñịnh Lợi mở ứng dụng rộng cho enzym GOD ñiều kiện ñòi hỏi cao nhiệt ñộ tác ñộng môi trường Ưu ñiểm enzym cố ñịnh khả tái sử dụng Tuy nhiên, sử dụng enzym GOD cố ñịnh hoạt ñộ enzym giảm dần sau lần kết thúc chu kỳ phản ứng Kết sau chu kỳ sử dụng , enzym GOD cố ñịnh trì 29.64% hoạt ñộ so với ban ñầu Chỉ nên tái sử dụng enzym GOD cố ñịnh lần ñể ñảm bảo hiệu suất sản xuất Đã xây dựng ñược quy trình sản xuất axít gluconic phòng thí nghiệm với thông số sau: nồng ñộ glucozơ 30%, nhiệt ñộ 35-40oC, pH=5-7, tỷ lệ enzym GOD cố ñịnh bổ sung Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 26 28UI/g chất Để thu nhận canxi gluconat sản phẩm trung gian trình phản ứng, ta sử dụng dung dịch bão hòa Ca(OH)2 (6g/100ml) kết tủa sản phẩm dung dịch cồn tuyệt ñối với tỷ lệ 1:1 thể tích Hiệu suất sản xuất 69.1% II KIẾN NGHỊ Do hạn chế thời gian nên mở rộng ñề tài Tôi xin ñề xuất ñịnh hướng phát triển ñề tài sau: So sánh hiệu suất cố ñịnh phương pháp cố ñịnh enzym: vi bao bao gói gel alginat Từ ñó lựa chọn phương pháp thích hợp ñể cố ñịnh enzym GOD Nghiên cứu thu hồi lượng glucozơ sót lại sau phản ứng lượng canxi gluconat dung dịch sau lọc kết tuả cồn Kết tinh axít gluconic ñể tạo sản phẩm dạng rắn Footer Page 26 of 126 ... 1.5.2.1 Sản xuất từ Aspergillus niger Penicillium luteum 1.5.2.2 Sản xuất gluconic axít từ vi khuẩn 1.5.2.3 Sản xuất gluconic axít từ enzym glucose oxidase 1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYM GLUCOSE. .. dựng quy trình sản xuất axít gluconic quy mô phòng thí nghiệm, sử dụng enzym glucose oxidase cố ñịnh ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Đối tương nghiên cứu : + Glucozơ + Enzym glucose oxidase + Natri... công nghiệp sản xuất axít gluconic MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Khảo sát hiệu trình cố ñịnh enzym glucose oxidase, nghiên cứu thông số kỹ thuật thích hợp cho trình chuyển hóa glucose thành axít gluconic