Khảo sát ảnh sự hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên Daphnia magna

Header Đồ Page of nghiệp 133 án1tốt GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh Chương 1: MỞ ĐẦU Ô nhiễm môi trường nói chung nước thải nói riêng vấn đề thời thu hút nhiều quan tâm quan chức người dân Hầu hết nhà máy khắp giới thường xử lý nước thải theo nguyên tắc “xả thẳng hay đổ bỏ”, dẫn đến việc nước thải không qua xử lý hay xử lý sơ sài thải môi trường cách tràn lan Nó làm ô nhiễm nguồn nước kênh rạch, ao hồ,… tiêu diệt hệ sinh vật nước, mà thấm vào gây ô nhiễm mạch nước ngầm làm thiếu nước cho sinh hoạt sản xuất Ở Việt Nam, tình hình ô nhiễm nguồn nước nhà máy gây ngày nghiêm trọng, làm cho số lượng ao hồ bị ô nhiễm tăng đến mức báo động Thậm chí nhiều nơi rơi vào tình trạng phục hồi, không loài thủy sinh sống như: kênh Nhiêu Lộc thành phố Hồ Chí Minh, sông Thị Vải Đồng Nai,… Các số liệu quan trắc chất lượng nước nước ta thông thường ý đến yếu tố lý hóa giá trị pH, COD, BOD, NH4, số kim loại nặng (Cu, Zn, Cadium…), số thuốc trừ sâu… chưa có nghiên cứu đánh giá nồng độ chất gây rối loạn hệ nội tiết diện nguồn nước Chất gây rối loạn nội tiết (Endocrine disruptors hay Endocrine disrupting chemical substances), viết tắt EDs hay ECDs, chất tồn đất, nước, không khí, xâm nhập vào thể chúng làm rối loạn chức hệ nội tiết gây tác động ảnh hưởng đến sức khỏe người động vật Qua tài liệu nghiên cứu cho thấy hợp chất nguyên nhân gây bệnh ung thư người, làm giảm lượng tinh trùng nam giới, ung thư vú phụ nữ, gây quái thai,… Đối với hệ động vật SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page of 133 Header Đồ Page of nghiệp 133 án2tốt GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh nước gây ảnh hưởng với nồng độ thấp (ng/l), làm biến đổi hình dạng biến đổi giới tính cá… Trong nghiên cứu gần phòng CNBĐSH (ThS Lê Thị Ánh Hồng) xây dựng phân tích nồng độ chất gây rối loạn nội tiết phân tích nồng độ chất gây rối loạn nội tiết hệ thống kênh rạch Tp.HCM Nhưng chưa sâu nghiên cứu ảnh hưởng chất gây rối loạn nội tiết, đại diện 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol lên thủy sinh động vật, cụ thể Daphnia magna Daphnia magna thực phẩm ấu trùng tôm, cá loài sử dụng thử nghiệm độc tính tiêu chuẩn hóa quốc tế, xem loài có liên quan đến sinh thái cho việc ứng dụng để đánh giá chất gây rối loạn nội tiết môi trường Vì lý nêu trên, xây dựng đề tài “Khảo sát ảnh hưởng chất gây rối loạn nội tiết lên Dapnnia magna” để tìm hiểu ảnh hưởng chất gây rối loạn nội tiết lên số lượng sống sót, phát triển sinh sản Daphnia magna SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page of 133 Header Đồ Page of nghiệp 133 án3tốt GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan chất gây rối loạn nội tiết [16],[25] 2.1.1 Khái niệm hormone Hormone chất hóa học tế bào hay nhóm tế bào tiết thể người động vật sản sinh ra, vận chuyển máu hay dịch não tủy đến điều khiển, hòa hoạt động tế bào hay quan nơi có quan thụ cảm hormone (hormone receptor) Sự kết hợp hormone receptor mang tính đặc hiệu cao (tương tự ta muốn mở cửa phải dùng chìa khóa vậy) dẫn đến trình sinh lý đặc thù cho loại hormone thể Để phát huy tác dụng, hormone phải kết hợp với receptor chúng Ví dụ: hormone sinh dục estrogen (chủ yếu buồng trứng thai tiết ra) vận chuyển đến kết hợp với receptor nhiều quan tử cung, âm đạo, tuyến vú, mô mỡ,… có tác dụng trì đặc điểm sinh dục phụ nữ, động vật chức quan hệ sinh dục, quy định đặc tính liên quan đến khác biệt giới tính trình sinh lý, sinh hóa thể 2.1.2 Khái niệm Estrogen Estrogen loại hormone số quan sinh dục nữ tiết Đó từ tế bào vỏ tế bào hạt nang noãn (hay nang trứng), thể vàng (hay gọi hoàng thể) thai Các thành phần nằm buồng trứng, riêng thai có tử cung thời kỳ có thai SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page of 133 Header Đồ Page of nghiệp 133 án4tốt GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh Estrogen tồn tự nhiên thể ba dạng: 17β-estradiol (ký hiệu E2), estrone estriol Trong 17β-estradiol estrogen tiết nhiều có tác dụng sinh học mạnh Còn estriol estrogen yếu nhất, dạng chuyển hóa 17β-estradiol estrone Cả ba loại có chất hóa học steroid tổng hợp từ cholesterol Estrogen máu lưu hành dạng: dạng tự (là dạng hoạt động), dạng gắn với protein (để lưu hành máu), cuối dạng liên hợp (để thải ngoài) Estrogen tự đến tế bào đích (target cell) khuếch tán qua màng tế bào để đến kết hợp với thụ thể (receptor) bào tương (hay gọi tế bào chất) thành phức hợp Phức hợp vào nhân tế bào, gây hai hiệu quả: chép DNA để nhân đôi tế bào tăng tổng hợp RNA Sau estrogen rời khỏi thụ thể khỏi tế bào, thời gian lưu lại nhân tế bào tùy thuộc vào loại estrogen hoạt tính mạnh hay yếu loại estrogen 2.1.3 Khái niệm chất gây rối loạn hệ nội tiết Các chất gây rối loạn nội tiết (Endocrine Disruptors), chất xâm nhập vào thể từ bên ngoài, hoạt động gần giống hormone hệ nội tiết gây xáo trộn chức sinh lý nội tiết tố Các EDs quan tâm nghiên cứu nhiều chất ảnh hưởng đến hormone sinh dục nữ (estrogen), hormone sinh dục nam (androgen), hormone thể vàng (progesteron), hormone tuyến giáp (thyroid hormone), chất ảnh hưởng tương tự hay ức chế estrogen quan tâm nhiều SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page of 133 Header Đồ Page of nghiệp 133 án5tốt GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh 2.1.4 Nguồn gốc nồng độ gây hại chất gây rối loạn nội tiết Các chất gây rối loạn nội tiết diện phụ gia thực phẩm, mỹ phẩm, thuốc bảo vệ thực vật, đồ nhựa, nước sinh hoạt bị ô nhiễm, chúng sản xuất có chủ định để dùng công nghiệp sản phẩm trình biến đổi từ nhiều chất khác Sự xuất chúng từ nhiều nguồn khác như:  Các hóa chất người sản xuất phenol, dioxin, furan… Ước lượng có khoảng 539 chất tồn  Các chất bảo vệ thực vật, chất chống côn trùng sinh vật gây hại, có khoảng 255 chất liên quan  Dược phẩm mỹ phẩm biết khoảng 58 chất  Các chất vô  Các chất sử dụng sinh hoạt mà đặc biệt sản phẩm làm từ nhựa  Các chất có nguồn gốc từ sinh vật, chủ yếu dẫn xuất steroids như:  Estrogen gồm dẫn xuất như: estrone, 17β-estradiol, estriol  Androgen gồm dẫn xuất như: testosterone, 5α- dihydrotestosterone… Tác động chất gây rối loạn nội tiết lên sinh vật làm tỉ lệ trứng nở giảm dần, tượng đực hóa hóa đực, tượng thay đổi thời gian trưởng thành sinh sản, tượng trọng lượng tăng bất thường chuột chưa trưởng thành, tượng lưỡng tính cá Những tổn thương vĩnh viễn chim gặm nhấm, sinh sản dị dạng động vật lưỡng cư chim,… 17β-estradiol, ethinylestradiol estrone chất thường nghiên cứu nhiều hormone nữ khác ảnh hưởng chúng động vật nồng SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page of 133 Header Đồ Page of nghiệp 133 án6tốt GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh độ thấp so với chất khác, với nồng độ 0.1ng/l ethinylestradiol 1ng/l 17βestradiol gây nên ảnh hưởng cá Các nhà khoa học nghi ngờ chất gây rối loạn nội tiết gây ảnh hưởng người làm giảm khả sinh sản, giảm lượng tinh trùng, gây hại cho hệ sinh sản nam nữ, dậy sớm, gây ung thư vú nữ, ung thư hệ sinh sản nam nhiều tác động khác 2.1.5 Quá trình tác động chất gây rối loạn nội tiết lên sinh vật Cơ quan thụ cảm hormone estrogen, androgen, hormone tuyến giáp protein thành viên liên nhóm quan thụ cảm nhân Chúng thực chức kết hợp với hormone Phức hợp hormone + receptor thông qua yếu tố đáp ứng DNA (hormone response element) dẫn đến trình mã, giải mã gene đích biểu trì, phát triển thực chức quan Thật không may, thụ quan lại khóa có tính “chung chạ” nên nhận “chìa khóa rởm” Các chất có khả trở thành “chìa khóa rởm” sau vào thể người động vật, theo máu đến kết hợp với quan thụ cảm hormone dẫn đến trường hợp sau:  Bắt chước tác dụng hormone  Cạnh tranh với hormone  Ức chế tác dụng hormone SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page of 133 Header Đồ Page of nghiệp 133 án7tốt GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh 2.2 Tổng quan thủy sinh động vật [5],[6],[7] 2.2.1 Các loại sinh vật thủy vực nước Thủy sinh vật nước đa dạng, phân bố rộng rãi Tuy nhiên vùng địa hình có loài thủy sinh đặc trưng riêng Có thể phân biệt thành vùng địa hình cảnh quan chủ yếu: vùng đồi núi, vùng đồng vùng đất ven biển 2.2.1.1 Phân bố loài thủy sinh vật vùng đồi núi Vùng đồi núi có thủy vực đặc trưng sông, suối vùng núi, hồ tự nhiên nhân tạo Trong sông suối vùng núi thường thấy phát triển loài tảo nước ôn đới Ulothrix zonata, Strotonostoc commune fulvaceum, Hapalosiphon welvvischii, Phormidium subcapitatum, Oscillatoria granulate, Lyngbya truncicola, Ceratoneis arcus,… loài ưa nước chảy Cladophora glomerata, C.rhifoides, Ulothrix tenerrina, Chaetomorpha sp Trên tảng chúng có loài bì sinh Chamaesiphon incrustans, Cocconeis placentula Giữa tảng đá sông suối, thường gặp tập đoàn Nostochopsislobatus Bên bờ suối hay sông thường gặp dạng tảo sợi Spirogyra rhifoides,… Ở hồ tự nhiên thành phần loài tảo nước đặc trưng phong phú tảo silic, có tảo bám Gomphonema constrictum, Cocconeis placentula loài nhiệt đới khác Thành phần thực vật hồ chứa chủ yếu tảo lam, tảo silic tảo lục Thành phần loài cá nước vùng núi có loài đặc trưng như: Cyprinus multitaeniata, Lissochilus laocaiensis, Altigena lemassoni, Onychostoma gelarchi loài khác thuộc giống này, Leptobarbus hoevenii, Bagarius yarreli, Gymnostomus lepturus, Daniops namuensis, Garra laichowensis, Channa asiatia loài thuộc giống Gastromyzon, Sinogastromyzon,… SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page of 133 Header Đồ Page of nghiệp 133 án8tốt GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh Đặc trưng thành phần loài động vật không xương sống thủy vực vùng núi đồi thể cấu trúc quần xã, với phong phú nhóm loài ấu trùng, côn trùng nước Ephemeroptera, Trichoptera, Plecoptera, loài cua núi họ Potamidae, giống Ranguna, Potemiscus, Orientalia, ốc suối với giống Thiaridae, Semisucospira, Sulcospira, Antimelania,… 2.2.1.2 Phân bố thủy sinh vật thủy vực vùng đồng Các thủy vực vùng đồng đặc trưng phần hạ lưu sông lớn, sông đào, kênh rạch, đầm ao, ruộng lúa nước Chế độ nước tĩnh nước chảy chậm, độ thấp, đáy mềm bùn, cát đặc điểm thủy vực vùng đồng Những đặc điểm có liên quan chặt chẽ đến đặc điểm cấu trúc quần xã thành phần loài, tập hợp loài thủy sinh vật vùng đồng Trong sông vùng đồng bằng, loài tảo nhiệt đới phát triển mạnh Oscillatoria perornata, O prienceps, Phormidium mucosum, Lyngbya aestuarii, Cymbella japonica, Achnanthes crenulata, Nitzschia obtuse, Epithema cistula,… Nhìn chung thành phần loài số lượng tảo vùng đồng nhiều vùng núi Các nhóm tảo lục, tảo lam phát triển mạnh nhất, tảo silic, tảo giáo, tảo mắt phát triển Thành phần loài tảo ruộng lúa nước vùng đồng chủ yếu tảo lam, loài tảo nhiệt đới cận nhiệt đới, chi Anabaena, Nostoc, Aulosira, Gloeotrichia, Aphanothece,… Khác với vùng núi, thành phần cá nước vùng đồng mang tính chất đặc trưng hơn, với nhiều loài có phân bố rộng, loài cá nuôi số loài cá di cư từ biển vào theo vụ mùa sinh sản, thường thấy loài: Coilia grayi, Altigena lemassoni, Megalobrama terminali, Hemiculter leucisculus,… Ở kênh rạch thấy loại cá đặc trưng cho vùng miền Nam Việt Nam có loài: cá chép, cá măng sữa (Chanos), cá tra (Pangasinus), cá chạch sông (Mastacembelus), cá sặc (Pristolepsis), cá bống tượng (Oxyeleotris), cá lịch (Symbranchus),… SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page of 133 Header Đồ Page of nghiệp 133 án9tốt GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh Đặc trưng phân bố động vật không xương sống nước vùng đồng thể cấu trúc tập hợp loài thành phần loài Ở thủy vực vùng đồng khác với vùng núi có phong phú nhóm giáp xác chân chèo Copepoda – Calanoida, Cladocera, Rotatoria động vật nổi, nhóm Oligochaeta, Polychaeta, Amphipoda, Tanaidacea, tôm Palaemonidae, ốc Viviparidae, Bithyniidae, Pilidae, Assimineidae, trai Unionnidae động vật đáy 2.2.1.3 Phân bố thủy sinh vật vùng cửa sông Thành phần loài vùng nước lợ cửa sông mang tính chất hỗn hợp, bao gồm loài nước lợ, nước mặn nước ngọt, thay đổi theo biến đổi độ mặn theo mùa Trong thành phần tảo thủy vực nước lợ, thường gặp nhóm tảo nước lợ như: Microcystis litoralis, M salina, Spirulina subsala, Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria margaritifera, Ceratium falcatum, Synedra tabulate, Surirella ovalis, Gracilaria verruccosa, Enteromorrpha intestitalis Ngoài gặp loài tảo biển di nhập vào theo nước biển nhóm tảo Chaetoceros, Bidduphia, Coscinodiscus, Skeletonema, Bacteriastrum, Rhizosolema,… nhiều vào sâu nội địa Trong thành phần cá vùng nước lợ có loài như: cá đối (Mugil cephalus), loài cá biển di cư vào mùa sinh sản như: cá mòi Clupanondon thrissa, cá cháy Macruna reevesii, Anguilla japonica, Coilia grayi loài cá nước có phân bố rộng như: Cyprinus carpio, Carassius auratus, Hypophthalmicthys harmandi, Hemiculter leucisculus, Hilsa kanagurata, H toil, Ilisha dussunmisri,… Thành phần động vật không xương sống vùng nước lợ đa dạng, phân biệt nhóm sinh thái khác nhau: SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page of 133 Header Đồ Page 133 án10 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh  Các loài nước lợ thức: sống thường xuyên nước lợ di nhập vào vùng nước phía trên: Brachionus plicatilis (Rotatoria), loài Schmackeria, Pseudodiaptomus (Copepoda – Calanoida), loài Corophium, Grandidierlla, Eohaustorius (Amphipoda),…  Các loài động vật biển di nhập tạm thời vào vùng nước lợ, sống tới thời gian sinh sản, điển hình nhóm tôm he Penaeidae (Metapenaeus ensis, Penaeus merguiensis, P.monodon)  Các loài nước di nhập vào vùng nước lợ mùa mưa, nước nhạt: có nhóm trùng bánh xe Rotatoria, giáp xác chân chèo Copepoda – Calanoida, râu ngành Cladocera, tôm nước ngọt, giun tơ Oligochaeta, trai ốc nhỏ Melanoides tuberculatus, Semyla tortanella 2.2.2 Hiện trạng ô nhiễm số thủy vực nước ảnh hưởng đến thủy sinh vật 2.2.2.1 Hiện trạng ô nhiễm số thủy vực nước Hiện trạng ô nhiễm hữu cơ, ô nhiễm vi sinh vật ô nhiễm chất dinh dưỡng phổ biến hầu hết thủy vực tiếp nhận nước thải đô thị kênh mương tiêu thoát đô thị lớn Sự ô nhiễm số chất độc diễn số sở sản xuất công nghiệp tập trung đô thị khu công nghiệp Việt Trì, khu công nghiệp Sài Gòn – Biên Hòa,… Tại vùng xung quanh cửa cống đổ nước thải vào hồ, chất dinh dưỡng có hàm lượng cao nhất, khu vực gần cửa cống, nước màu đen sủi bọt, lượng oxy thường thấp, chí không oxy, môi trường nước yếm khí Loại nước thải phức tạp thành phần Tùy theo loại công nghiệp mà nước thải chứa nhiều chất hữu chưa phân hủy (nhà máy thực phẩm), nhiều sợi cellulose, sude (nhà máy giấy), sản phẩm dầu hỏa, muối độc vô hữu (nhuộm, thuộc da, hóa chất, luyện kim, than đá) Hậu muối dinh dưỡng nitơ bị khử SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 10 of 133 10 Header Đồ Page 133 án41 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh Dựa vào bảng 4.6 4.7 ta thấy tỷ lệ % D magna bất động sau 48h ngày chất 17α-Ethynylestradiol, 17β-Estradiol khác biệt 4.1.4.3 Sau 21 ngày Bảng 4.8: Tỷ lệ % D magna bất động sau 21 ngày 17α-Ethynylestradiol Nồng độ % D magna bất động COMBO α1 36,7 41,7 17β-Estradiol α2 α3 α4 61,7 83,4 81,7 COMBO β1 16,7 16,7 β2 β3 β4 β5 26,6 85 92,5 85 Đối với chất 17α-Ethynylestradiol sau 21 ngày tỷ lệ D magna bất động môi trường COMBO thấp 36,7% tỷ lệ tăng theo nồng độ, nồng độ thứ (50µg/l) tỷ lệ D magna bất động cao 83,4% Đối với chất 17β-Estradiol sau 21 ngày tỷ lệ D magna bất động môi trường COMBO nồng độ thứ (1µg/l) thấp 16,7%, tỷ lệ cao nồng độ thứ (100µg/l) 92,5% 4.1.5 Ảnh hưởng chất gây rối loạn nội tiết lên thời gian phát triển D magna Trong môi trường tự nhiên D magna bắt đầu sinh sản sau tuần, thí nghiệm D magna nuôi môi trường COMBO nên thời gian sinh sản rút ngắn xuống khoảng ngày tùy theo nồng độ chất gây rối loạn nội tiết khác thời gian sinh sản khác 4.1.5.1 17α-Ethynylestradiol SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 41 of 133 41 Header Đồ Page 133 án42 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh Bảng 4.9: Thời gian D magna bắt đầu sinh sản môi trường 17α-Ethynylestradiol COMBO α1 α2 α3 α4 Lần lặp lại 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3 Ngày sinh sản 11 11 10 17 7 11 15 15 12 11 11 12 Dựa vào bảng 4.9 ta thấy môi trường COMBO D magna bắt đầu sinh sản từ ngày thứ – 11.Ở nồng độ thứ (10µg/l) có kích thích sinh sản, D magna sinh sản sau ngày nồng độ thứ (50µg/l) có ức chế sinh sản, D magna sinh sản từ ngày 12 đến ngày 15 số lượng D magna sinh nồng độ thấp 4.1.5.2 17β-Estradiol Bảng 4.10: Thời gian D magna bắt đầu sinh sản môi trường 17β-Estradiol COMBO β1 β2 β3 β4 β5 Lần lặp lại 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.2 3.3 4.1 4.2 5.1 5.2 Ngày sinh sản 8 8 8 8 11 15 11 11 11 Dựa vào bảng 4.10 ta thấy môi trường COMBO D magna bắt đầu sinh sản từ ngày thứ nồng độ thứ (1µg/l) thứ (10µg/l) ảnh hưởng đến thời gian sinh sản D magna (bắt đầu sinh sản từ ngày thứ 8) Sự ức chế sinh sản xảy nồng độ thứ (100µg/l) thứ (200µg/l), D magna bắt đầu sinh sản từ ngày 11 – 15 4.1.6 Sự đáp ứng dòng đời D magna với chất gây rối loạn nội tiết SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 42 of 133 42 Header Đồ Page 133 án43 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh 4.1.6.1 Chất 17α-Ethynylestradiol Bảng 4.11: Thời gian D magna tồn môi trường 17α-Ethynylestradiol COMBO α1 α2 α3 α4 Lần lặp lại 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3 Ngày chết 43 61 49 47 54 39 46 48 18 34 40 46 46 41 40 Dựa vào bảng 4.11 ta thấy môi trường COMBO thời gian sống sót D magna cao 51 ngày (trung bình lần bố trí), thời gian sống sót D magna tỷ lệ nghịch với nồng độ 17α-Ethynylestradiol, nồng độ tăng thời gian sống sót giảm Dòng đời trung bình D magna khoảng tháng, với nồng độ bố trí nhận thấy khác biệt rõ ràng nồng độ, nhiên nồng độ cao số ngày tuổi D magna giảm 4.1.6.2 Chất 17β-Estradiol Bảng 4.12: Thời gian D magna tồn môi trường 17β-Estradiol COMBO β1 β2 β3 β4 β5 Lần lặp lại 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.2 3.3 4.1 4.2 5.1 5.2 Ngày chết 65 68 67 68 65 64 59 61 59 45 47 29 43 43 44 Dựa vào bảng 4.12 ta thấy môi trường COMBO thời gian sống sót D magna cao 66,7 ngày (trung bình lần bố trí) thời gian giảm theo nồng độ tăng dần 17β-Estradiol Dòng đời trung bình D magna khoảng tháng với kết SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 43 of 133 43 Header Đồ Page 133 án44 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh nhận thấy nồng độ thứ (100µg/l) 17β-Estradiol làm cho dòng đời D magna giảm 36 ngày 4.2 Ảnh hưởng chất gây rối loạn nội tiết lên Daphnia magna đời F1 Những D magna 24h tuổi bố trí thí nghiệm chọn để bố trí thí nghiệm với chất gây rối loạn nội tiết nồng độ bảng 4.1 4.2 4.2.1 Tỷ lệ % D magna sống sót sau 21 ngày bố trí thí nghiệm Bảng 4.13: Bảng tỷ lệ % D magna sống sót sau 21 ngày bố trí 17α-Ethynylestradiol % D magna sống sót 17β-Estradiol COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 83,6 73,3 87,5 20 30 85 85 80 20 15 7,5 Sau 21 ngày bố trí nhận thấy tỷ lệ D magna mẹ sống sót môi trường COMBO cao 83,6% đợt bố trí thí nghiệm 17α-Ethynylestradiol 85% đợt bố trí thí nghiệm 17β-Estradiol Đối với đợt bố trí thí nghiệm 17α-Ethynylestradiol nhận thấy nồng độ thứ (50µg/l) thứ (100 µg/l) có tỷ lệ D magna sống sót thấp 20% 30%.Ở nồng độ thứ (10µg/l) có tỷ lệ D magna sống sót cao 87,5% Như chứng tỏ nồng độ 17α-Ethynylestradiol thấp lượng D magna tồn tương đương với mẫu đối chứng Đối với đợt bố trí thí nghiệm 17β-Estradiol nhận thấy nồng độ thứ (200µg/l) có tỷ lệ D magna sống sót thấp 7,5% Ở nồng độ (1µg/l) SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 44 of 133 44 Header Đồ Page 133 án45 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh (10µg/l) có tỷ lệ D magna sống sót cao 85% 80% Như chứng tỏ nồng độ 17β-Estradiol thấp lượng D magna tồn tương đương với mẫu đối chứng 4.2.2 Số lượng D magna sinh D magna mẹ sau 21 ngày bố trí thí nghiệm Bảng 4.14: Số lượng D magna sinh D magna mẹ 21 ngày bố trí 17α-Ethynylestradiol COMBO α1 Số lượng 44 D.magna 43,9 17β-Estradiol α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 33,9 23,2 36,3 38 37,8 53,5 27,9 50,3 37 Kết thử nghiệm bảng 4.14 cho thấy: Số lượng trung bình D magna D magna mẹ 21 ngày bố trí thí nghiệm với 17α-Ethynylestradiol nồng độ thứ (1µg/l) tương đương với môi trường COMBO Sự ức chế sinh sản xảy từ nồng độ thứ (10µg/l) đến nồng độ thứ (100µg/l) Số lượng trung bình D magna D magna mẹ 21 ngày bố trí thí nghiệm với 17β-Estradiol nồng độ thứ (1µg/l) thứ (10µg/l) tương đương với môi trường COMBO.Ở nồng độ thứ (100µg/l) số lượng D magna D magna mẹ thấp 27,9, hai nồng độ thứ (50µg/l) thứ (200µg/l) số lượng D magna D magna mẹ cao Với kết nhận thấy 17β-Estradiol có khả kích thích sinh sản nồng độ thứ (50µg/l) SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 45 of 133 45 Header Đồ Page 133 án46 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh Tuy nhiên thời gian thực đề tài có hạn nên chưa kịp kiểm chứng lại 4.2.3 Sự phát triển bất thường D magna Bảng 4.15: Tổng số trứng cyst D magna mẹ tạo 17α-Ethynylestradiol COMBO 13 Số trứng cyst α1 α2 α3 23 17β-Estradiol α4 COMBO 11 β1 β2 β3 β4 17 β5 Sau thực thí nghiệm nhận thấy: Đối với chất 17α-Ethynylestradiol tất nồng độ có xuất trứng cyst, riêng nồng độ thứ (50µg/l ) xuất trứng cyst cao 46% nồng độ (100 µg/l) xuất trứng cyst thấp 4%.Tương ứng với tạo trứng cyst nhận thấy số lượng D magna nồng độ thứ (50µg/l ) thấp Đối với chất 17β-Estradiol nồng độ thứ (50µg/l ) xuất trứng cyst, trứng cyst xuất nhiều nồng độ thứ (100µg/l) chiếm 37,7% nồng độ thứ (1µg/l) trứng cyst thấp 6,6% Tương ứng với tạo trứng cyst nhận thấy số lượng D magna nồng độ thứ (100µg/l ) thấp Với kết nhận thấy môi trường dùng làm đối chứng COMBO cho trứng cyst cao điều kiện nhiệt độ bị thay đổi, nhiên nồng độ 1µg/l 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol hạn chế tạo thành trứng cyst điều kiện nhiệt độ bất lợi SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 46 of 133 46 Header Đồ Page 133 án47 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh 4.2.4 Ảnh hưởng gây chết Với hai chất 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol, nhận thấy với nồng độ chúng bất động sau 48h, sau ngày sau 21 ngày là: 4.2.4.1 Sau 48 Bảng 4.16: Bảng tỷ lệ % D magna bất động sau 48h 17α-Ethynylestradiol Nồng độ % D magna bất động COMBO α1 6,6 α2 α3 α4 10 80 58,3 11,6 17β-Estradiol COMBO β1 1,6 8,3 β2 β3 β4 β5 20 82,5 80 Đối với chất 17α-Ethynylestradiol sau 48h tỷ lệ D magna bất động môi trường COMBO thấp 6,6% tỷ lệ tăng dần theo nồng độ, nồng độ thứ (50µg/l) tỷ lệ D magna bất động cao 80% Đối với chất 17β-Estradiol sau 48h tỷ lệ D magna bất động môi trường COMBO thấp 1,6%, tỷ lệ tăng dần theo nồng độ, hai nồng độ thứ (100µg/l) thứ (200µg/l) ta thấy tỷ lệ D magna bất động cao 82,5% 80% 4.2.4.2 Sau ngày Bảng 4.17: Bảng tỷ lệ % D magna bất động sau ngày 17α-Ethynylestradiol Nồng độ % D magna bất động COMBO α1 6,6 SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 47 of 133 16 α2 α3 α4 10 80 66,6 17β-Estradiol COMBO β1 6,6 11,6 β2 β3 β4 β5 8,3 45 82,5 85 47 Header Đồ Page 133 án48 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh Đối với chất 17α-Ethynylestradiol sau ngày tỷ lệ D magna bất động môi trường COMBO thấp 6,6% tỷ lệ tăng dần theo nồng độ, nồng độ thứ (50µg/l) tỷ lệ D magna bất động cao 80% Đối với chất 17β-Estradiol sau ngày tỷ lệ D magna bất động môi trường COMBO thấp 6,6%, tỷ lệ tăng dần theo nồng độ, hai nồng độ thứ (100µg/l) thứ (200µg/l) ta thấy tỷ lệ D magna bất động cao 82,5% 85% 4.2.4.3 Sau 21 ngày Bảng 4.18: Bảng tỷ lệ % D magna bất động sau 21 ngày 17α-Ethynylestradiol Nồng độ % D magna bất động COMBO α1 16,6 28,3 17β-Estradiol α2 α3 α4 COMB O 12,5 80 70 15 β1 15 β2 20 β3 β4 β5 80 85 92,5 Đối với chất 17α-Ethynylestradiol sau 21 ngày tỷ lệ D magna bất động môi trường COMBO 16,6% tỷ lệ thấp nồng độ thứ (10µg/l), nồng độ thứ (50µg/l) tỷ lệ D magna bất động cao 80% Đối với chất 17β-Estradiol sau 21 ngày tỷ lệ D magna bất động môi trường COMBO nồng độ thứ (1µg/l) bằng15%, tỷ lệ tăng dần theo nồng độ, nồng độ thứ (200µg/l) ta thấy tỷ lệ D magna bất động cao 92,5% 4.2.5 Ảnh hưởng chất gây rối loạn nội tiết lên thời gian phát triển D magna 4.2.5.1 Chất 17α-Ethynylestradiol SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 48 of 133 48 Header Đồ Page 133 án49 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh Bảng 4.19: Thời gian D magna bắt đầu sinh sản môi trường 17α-Ethynylestradiol COMBO Ngày sinh sản α1 α2 α3 α4 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3 8 8 8 14 17 17 11 15 15 Dựa vào bảng 4.19 ta thấy môi trường COMBO nồng độ thứ (1µg/l), thứ (10µg/l) D magna bắt đầu sinh sản từ ngày thứ Ở nồng độ thứ (50µg/l) thứ (100µg/l) có ức chế sinh sản, ức chế cao nồng độ thứ (50µg/l) bắt đầu sinh sản từ ngày 14 đến ngày 17 số lượng D magna sinh nồng độ thấp 4.2.5.2 Chất 17β-Estradiol Bảng 4.20: Thời gian D magna bắt đầu sinh sản môi trường 17β-Estradiol COMBO Ngày sinh sản β1 β2 β3 β4 β5 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.2 3.3 4.1 4.2 5.1 5.2 7 7 7 7 7 12 11 12 10 Dựa vào bảng 4.20 ta thấy từ môi trường COMBO đến nồng độ thứ (50µg/l) ức chế sinh sản D magna bắt đầu sinh sản từ ngày thứ 7-8, hai nồng độ lại có ức chế sinh sản D magna bắt đầu sinh sản từ ngày thứ 10-12 SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 49 of 133 49 Header Đồ Page 133 án50 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh 4.2.6 Sự đáp ứng dòng đời D magna với chất gây rối loạn nội tiết 4.2.6.1 Chất 17α-Ethynylestradiol Bảng 4.21: Thời gian D magna tồn môi trường 17α-Ethynylestradiol COMBO Ngày chết α1 α2 α3 α4 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3 58 60 60 59 60 56 58 66 41 42 34 53 49 45 Dựa vào bảng 4.21 ta thấy từ môi trường COMBO đến nồng độ thứ (10µg/l) thời gian sống sót D magna khác biệt đáng kể từ 56-66 ngày Thời gian sống sót D magna giảm dần nồng độ thứ (50µg/l) thứ (100µg/l) nên có ảnh hưởng đến số lượng D magna sinh 4.2.6.2 Chất 17β-Estradiol Bảng 4.22: Thời gian D magna tồn môi trường 17β-Estradiol COMBO Ngày chết β1 β2 β3 β4 β5 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.2 3.3 4.1 4.2 5.1 5.2 64 65 64 65 63 65 62 60 61 44 55 42 29 28 25 Dựa vào bảng 4.22 ta thấy từ môi trường COMBO đến nồng độ thứ (10µg/l) thời gian sống sót D magna khác biệt đáng kể từ 60-65 ngày.Thời gian sống sót giảm dần từ nồng độ thứ (50µg/l) đến thứ (200µg/l) đạt thấp nồng độ thứ (200µg/l), số lượng D magna sinh nồng độ thấp SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 50 of 133 50 Header Đồ Page 133 án51 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh 4.3 Khảo sát hàm lượng chất gây rối loạn nội tiết kênh rạch Thành Phố Hồ Chí Minh Tại phòng CNBĐSH lấy mẫu số vị trí kênh rạch Tp Hồ Chí Minh phân tích hàm lượng chất gây rối loạn nội tiết 4.3.1 Xác định vị trí lấy mẫu Mẫu thu vị trí kênh rạch Tp Hồ Chí Minh, bố trí sơ đồ lấy mẫu cho vị trí lấy mẫu phải có vị trí nước bị ô nhiễm nặng vị trí cầu Tham Lương, cầu tạm Chữ Y, cầu Thị Nghè…và số vị trí nước cầu Sài Gòn, cầu Đồng Nai…Vị trí lấy mẫu xác định GPS (máy định vị toàn cầu).Thu mẫu vào lúc nước đạt mức thủy triều cao ngày theo lịch thủy triều Bảng 4.23: vị trí thu mẫu Vị trí STT Địa điểm Ký hiệu mẫu Kinh độ Vĩ độ 01 Cầu Tham Lương KR1 10049’41.9”N 106046’09.6”E 02 Cầu tạm Chữ Y KR2 10045’02.2”N 106041’00.3”E 03 Cầu Chữ Y KR3 10044’47.7”N 106040’35.8”E 04 Cầu Kênh Tẻ KR4 10045’41.9”N 106042’06.7”E 05 Cầu Thị Nghè KR5 10047’28.5”N 106054’22.7”E 06 Cầu Sài Gòn KR6 10047’53.1”N 106043’44.1”E 07 Cầu Đồng Nai KR7 10054’21.4”N 106050’28.8”E SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 51 of 133 51 Header Đồ Page 133 án52 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh 4.3.2 Kết phân tích nồng độ chất gây rối loạn nội tiết Các mẫu nước sau thu vận chuyển phòng thí nghiệm phân tích xác định hàm lượng chất gây rối loạn nội tiết (EDs) phương pháp YES(ThS.Lê Thị Ánh Hồng, [phụ lục 1]) với nấm men chuyển gen Estrogen Receptor Chất chuẩn 17β-Estradiol số liệu thu nồng độ chất gây rối loạn nội tiết tương đương nồng độ 17β-Estradiol (ng/l) Bảng 4.24: Kết phân tích nồng độ (ng/l) chất gây rối loạn nội tiết Số lần lấy mẫu Địa điểm lấy mẫu 01 02 03 KR1 6.207 1.169 0.895 KR2 2.878 0.635 0.800 KR3 2.718 0.550 0.610 KR4 1.031 0.515 0.929 KR5 2.678 0.442 0.29 KR6 2.991 0.332 0.167 KR7 1.573 0.113 0.068 Do ảnh hưởng thủy triều lượng nước mưa nên lần phân tích EDs mẫu khác lớn vị trí KR1 lần 6,207 ng/l lần 0,895 ng/l Mẫu vị trí cầu Tham Lương có hàm lượng EDs cao 6,207ng/l tất mẫu phân tích SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 52 of 133 52 Header Đồ Page 133 án53 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh Xếp theo thứ tự nồng độ EDs từ cao tới thấp nhận thấy sau: KR1 > KR6 > KR2 > KR3 > KR5 > KR7 > KR4 Theo báo cáo Univeritat Bremen [14 ] thì: Đối với 17β-Estradiol : - 8.0µM_21 ngày không ảnh hưởng đến đời sống, không ảnh hưởng đến trình sinh sản, không ảnh hưởng đến phát triển F1 - 270µg/l không ảnh hưởng đến giới tính, sinh sản - LC50 2,97mg/l 48h_giảm sinh sản - 1_100µg/l ngày không ảnh hưởng đến giới tính, sinh sản Đối với 17α-Ethynylestradiol : - 100ppb – 5ppm giảm sinh sản, không ảnh hưởng đến râu giới tính Vậy với nồng độ EDs phân tích mẫu nước phân tích từ 6,207 – 1,573 ng/l kênh rạch Tp Hồ Chí Minh không gây ảnh hưởng đến Daphnia sp.Tuy nhiên ảnh hưởng đến loài có kích thước nhỏ Ceriodaphnia sp hay Brachionus sp SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 53 of 133 53 Header Đồ Page 133 án54 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau tháng thực đề tài “ khảo sát ảnh hưởng chất gây rối loạn nội tiết lên Daphnia magna ’’ thu kết :  Ảnh hưởng 17α-Ethynylestradiol  Tỷ lệ sống sót Daphnia magna bố trí thí nghiệm thấp so với đối chứng  Ở nồng độ 100µg/l 17α-Ethynylestradiol sau 48h số lượng Daphnia magna chết đến 81,7%  Thời gian sinh sản ngày với nồng độ 17α-Ethynylestradiol 1µg/l 15 ngày với nồng độ 17α-Ethynylestradiol 50µg/l  Vòng đời Daphnia magna bị rút ngắn xuống 40 ngày so với đối chứng 61 ngày  Tỷ lệ sinh sản cao nồng độ 100µg/l 54,4 D magna D magna mẹ so với đối chứng 25,4 D magna D magna mẹ  Ảnh hưởng của17β-Estradiol  Tỷ lệ sống sót Daphnia magna bố trí thí nghiệm thấp so với đối chứng  Ở nồng độ 100µg/l 17β-Estradiol sau 48h số lượng Daphnia magna chết đến 90% SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 54 of 133 54 Header Đồ Page 133 án55 tốtofnghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh  Thời gian sinh sản ngày với nồng độ 17β-Estradiol 1µg/l, 10µg/l 15 ngày với nồng độ 17β-Estradiol 100µg/l  Vòng đời Daphnia magna bị rút ngắn xuống 43 ngày so với đối chứng 67 ngày  Tỷ lệ sinh sản cao nồng độ 50µg/l 64,7 D magna D magna mẹ so với đối chứng 32,7 D magna D magna mẹ Khi bố trí Daphnia magna đời F1 cho kết tương tự Daphnia magna mẹ 5.2 Kiến nghị Do thời gian thực đề tài có hạn nên chưa thực hết yêu cầu đề tài Do có kiến nghị sau: Bố trí thêm lần thí nghiệm để đưa vào phần mềm thống kê, xếp hạng để kết xác (do bố trí sinh vật nên có sai số lớn) Thử nghiệm trực tiếp Daphnia magna nguồn nước ô nhiễm để đánh giá nguy ảnh hưởng nguồn nước đến động vật thủy sinh Khảo sát ảnh hưởng chất gây rối loạn nội tiết lên loài thủy sinh diện nhiều Việt Nam như: Ceriodaphnia cornuta, Brachionus calyciflorus,… SVTH: Nguyễn Duy Tân Footer Page 55 of 133 55 ... chất gây rối loạn nội tiết môi trường Vì lý nêu trên, xây dựng đề tài Khảo sát ảnh hưởng chất gây rối loạn nội tiết lên Dapnnia magna để tìm hiểu ảnh hưởng chất gây rối loạn nội tiết lên số lượng... niệm chất gây rối loạn hệ nội tiết Các chất gây rối loạn nội tiết (Endocrine Disruptors), chất xâm nhập vào thể từ bên ngoài, hoạt động gần giống hormone hệ nội tiết gây xáo trộn chức sinh lý nội. .. phân tích nồng độ chất gây rối loạn nội tiết hệ thống kênh rạch Tp.HCM Nhưng chưa sâu nghiên cứu ảnh hưởng chất gây rối loạn nội tiết, đại diện 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol lên thủy sinh động