Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong lá cây lược vàng ở tỉnh Quảng Nam

Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: PGS TS PHẠM VĂN HAI TRẦN THỊ ÁNH HỒNG Phản biện 1: PGS TS LÊ TỰ HẢI NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG THÂN VÀ LÁ CÂY LƯỢC VÀNG Ở TỈNH QUẢNG NAM Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ Mã số: 60 44 27 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Footer Page of 126 Đà Nẵng- Năm 2011 Phản biện 2: PGS TS LÊ THỊ LIÊN THANH Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng chấm luận văn tốt nghiệp thạc sĩ khoa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 24, 25, 26 tháng năm 2011 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm thông tin- Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viên trường Đại học sư phạm, Đại học Đà Nẵng Header Page of 126 MỞ ĐẦU Mục ñích nghiên cứu Đặt vấn ñề Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt ñới gió mùa nên có Xác ñịnh thành phần hóa học thân Lược vàng Quảng Nam nguồn thực vật vô phong phú ña dạng sinh học với nhiều ñược dùng làm dược liệu quý Nhiều hợp chất thiên nhiên tách ñược Phân lập xác ñịnh cấu trúc số cấu tử có thân Lược vàng từ thuốc thể hoạt tính chữa bệnh ñộc ñáo Thử hoạt tính sinh học dịch chiết từ cấu tử ñã tách ñịnh hướng ñể người tổng hợp tìm ñược nhiều loại thuốc Phương pháp nghiên cứu Hiện nay, Y học dân gian ñang quan tâm nhiều tới Lược Nghiên cứu lý thuyết vàng Về mặt thực vật học, Lược vàng có tên khoa học Callisia Phương pháp chiết fragrans, họ Thài Lài (Commelinaceace) Gần ñây, thông tin Phương pháp xác ñịnh số vật lý hóa học ñại chúng, Lược vàng ñược xem “thần dược” trị bách bệnh mụn nhọt, dị ứng, ñau họng, ñau răng, ñến bệnh nan y ung thư, tiểu ñường… Trong ñó cho ñến nay, giới, có chưa nhiều công bố khoa học thành phần hóa học tác dụng sinh học loài này, chủ yếu tài liệu Liên bang Nga ñề cập kinh nghiệm sử dụng Lược vàng phòng chữa bệnh Tại Việt Nam, có vài công trình nghiên cứu sơ thực vật Vấn ñề ñặt nghiên cứu hóa thực vật sâu Phương pháp xác ñịnh thành phần hóa học, ñịnh danh, tách phân lập, xác ñịnh cấu trúc cấu tử phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) , sắc ký cột (SKC), sắc ký mỏng (SKBM),1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, COSY, HMBC, HSQC Ý nghĩa khoa học thực tiễn ñề tài Từ nghiên cứu trên, luận văn ñã thu ñược số kết với ñóng góp thiết thực sau: Lược vàng ñể xác ñịnh thành phần hóa học làm sở Cung cấp thông tin khoa học thành phần, cấu tạo số hợp ñề xuất sử dụng thích hợp hữu hiệu ñồng thời giúp người dân chất hoạt tính sinh học có dịch chiết thân Lược bảo tồn, phát triển thuốc Việt Nam Nhằm góp phần ñóng vàng góp phần nâng cao giá trị sử dụng Lược vàng, nhằm góp phần nhỏ bé hiểu biết thêm thành phần hóa học ñịnh hướng cho việc quy hoạch khai thác sau thuốc dân gian này, ñề xuất thực ñề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học Lược vàng (Callisia fragrans), tỉnh Quảng Nam” Footer Page of 126 Thăm dò hoạt tính sinh học chất phân lập ñược ñể ñịnh hướng cho việc ứng dụng thực tế Header Page of 126 5 Bố cục luận văn Luận văn gồm 68 trang, có bảng 11 hình Phần mở ñầu trang, kết luận trang tài liệu tham khảo trang 1.1.5 Callisia ornata (small) G C Tucker 1.1.6 Callisia repens (Jacquin) Linnaeus1.1.6 Callisia repens (Jacquin) Linnaeus Nội dung luận văn chia làm chương: 1.1.7 Callisia rosea (Ventenat) D.R Hunt Chương 1: Tổng quan 1.1.8 Callisia navicularis (Ortgies) D R Hunt Chương 2: Những nghiên cứu thực nghiệm 1.1.9 Callisia Coleotrype Chương 3: Kết thảo luận 1.1.10 Callisia Dichorisandra CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 KHÁI QUÁT VỀ CÁC THỰC VẬT CHI CALLISIA 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG THỰC VẬT CHI CALLISIA Trong chi Callisia nhà khoa học ñã phân lập ñược từ loài Cây Lược vàng có tên khoa học (Callisia fragrans) thuộc chi Callisia thuộc họ Thài Lài (Commelinaceace) Callisia fragrans flavonoit, glucosid, coumarin có hoạt tính sinh Trên giới họ Thài lài có 40 chi 625 loài sống chủ yếu học cao số hợp chất khác axit phenolic, ñường, axit amin, vùng nhiệt ñới, số sống vùng cận nhiệt ñới ôn pectin, tanin Ngoài ra, chứa nguyên tố K, Ca, Mn, ñới nóng Cây phân bố bãi hoang, ñất ẩm, bờ nước, số Co, Ni, Cu, Zn, Zr…[12, 13, 14, 15, 16, 27, 28] Những nghiên cứu loài khác chi Callisia làm cảnh [25, 26, 27] Ở Việt Nam theo thống kê nhà thực vật học họ khiêm tốn ñược ñề cập có 15 chi 47 loài [2], theo Phạm Hoàng Hộ ñã công bố họ 1.3 VỀ CÂY LƯỢC VÀNG ( RIA VÀNG, LAN VÒI ) Commelinaceae gồm 13 chi với 60 loài [3] Còn theo công trình 1.3.1 Đặc ñiểm thực vật học, phân bố “Danh mục loài thực vật Việt Nam” tập nhà khoa học Cây Lược vàng có nguồn gốc Mexico, ñược di thực sang Liên bang thuộc Trường Đại học quốc gia Hà nội Viện Sinh thái Tài Nga, ñến Việt Nam (ñiểm ñến ñầu tiên tỉnh Thanh Hoá) Nay nguyên sinh vật ñã thống kê họ có 15 chi với 58 loài [1] ñã phát triển nhanh, rộng nhiều tỉnh thành khác nước Đặc ñiểm số loài thuộc chi Callisia ñược cho thực vật có nhiều tác dụng ñiều trị bệnh khác 1.1.1 Callisia fragrans (Lindl.) Woodson 1.1.2 Callisia cordifolia (Swartz) E S Anderson & Woodson Cây Lược vàng có tên khoa học Callisia fragrans thuộc họ 1.1.3 Callisia graminea (Small) G C Tucker Commelinaceace nhà khoa học R.E Woodson xác ñịnh từ năm 1.1.4 Callisia micrantha (Torrey) D R Hunt Footer Page of 126 1942 Tại Việt Nam, ñược Tiến sĩ Trần Văn Ơn – Bộ môn Header Page of 126 thực vật- Trường Đại học Dược Hà Nội xác ñịnh tên khoa học 2.1.2 Nội dung nghiên cứu Xác ñịnh hàm lượng nước mẫu Lược vàng Callisia fragrans (Lindl.) Woodson Ngoài ra, dân gian gọi tên khác như: Lan vòi, Lan rũ, Địa lan vòi, Ria vàng, Vàng ria mép, … tươi Thu nhận dịch chiết cặn chiết Lược vàng với 1.3.2 Đặc ñiểm sinh thái [10], [25], [27] dung môi có ñộ phân cực tăng dần: n- hexan, etyl axetat, 1.3.2.1 Dạng metanol Cây Lược vàng thảo nhiều năm, thân mọng nước, dài tới 1m, phân nhánh từ thân gốc vòi vươn 1.3.2.2 Lá Lá Lược vàng mọc tập trung thân, rải rác phía dưới, dạng mác thuôn, dài 18 – 25 cm, rộng 3,5 – cm, cuống có gân rõ, ôm thân, có lông mịn thường có sọc tía 1.3.2.3 Cụm hoa Hoa mọc thành cụm – hoa dạng xim phát hoa hình chuỳ dài tới 60cm , cặp xim ñược ôm bắc dạng cưa (3 Khảo sát ñịnh tính lớp chất có cặn chiết Lược vàng Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh ñối với số cặn chiết Phân lập xác ñịnh cấu trúc hóa học phương pháp phổ ñại (IR, EI-MS, HR-MS, 1D 2D-NMR, ) số hợp chất từ cặn chiết 2.1.3 Phương pháp nghiên cứu răng) dài 10 – 15cm Lá ñài suốt, màu trắng, khô xác, dạng Phương pháp thu hái xử lý mẫu nghiên cứu mác, dài – mm Cánh hoa bóng, suốt, màu trắng, mỏng, có 2.Phương pháp ngâm chiết ñể thu nhận dịch chiết, sau ñó dạng trứng hẹp Nhị Ra hoa vào mùa xuân ñuổi dung môi thiết bị cất quay áp suất giảm, nhiệt ñộ thấp (< 1.3.3 Ứng dụng Lược vàng 50 0C) ñể thu nhận cặn chiết 1.3.4 Tình hình nghiên cứu Lược vàng 1.3.4.1 Tình hình nghiên cứu Lược vàng giới 1.3.4.2 Tình hình nghiên cứu Lược vàng Việt Nam CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 2.1 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp hóa học thích hợp ñịnh tính lớp chất từ Lược vàng Phương pháp sắc ký như: sắc ký cột(CC), sắc ký lớp mỏng (TLC) phương pháp kết tinh phân ñoạn ñể phân lập chất từ dịch chiết Phương pháp vật lý ñại ñể xác ñịnh cấu trúc như: Phổ 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu hồng ngoại (IR), Phổ khối va chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng - Đối tượng nghiên cứu: Lá Lược vàng trồng tỉnh Quảng Nam phân giải cao (FT-ICR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1H- NMR, 13C- NMR, DEPT, phổ 1D 2D-NMR, … Footer Page of 126 Header Page of 126 10 2.2 DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.3.2 Xác ñịnh hàm lượng nước mẫu Lược vàng tươi 2.2.1 Dụng cụ 2.3.3 Khảo sát ñịnh tính lớp chất thân Lược vàng 2.2.2 Hóa chất cặn chiết 2.2.3 Thiết bị nghiên cứu 2.3.3.1 Định tính hợp chất sterol 2.3 THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU 2.3.3.2 Định tính ancaloid 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu chiết tách 2.3.3.3 Định tính flavonoid 2.3.1.1 Thu hái sử lý mẫu nghiên cứu 2.3.3.4 Định tính coumarin 2.3.1.2 Ngâm chiết mẫu nghiên cứu 2.3.3.5 Định tính glycosid tim Sơ ñồ 2.1: Sơ ñồ ngâm chiết mẫu Lược vàng (Callisia 2.3.3.6 Định tính saponin 2.4 THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH fragrans) 2.5 PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT Mẫu Lược vàng khô nghiền nhỏ(1,2 kg) 2.5.1 Phân lập tinh chế chất từ cặn chiết n-hexan Để phân lập chất từ dịch chiết n-hexan Lược Chiết 5×5l n-hexan Kiệt ñuổi dung môi vàng, sử dụng phương pháp sắc ký cột Lấy 18,4g cặn chiết n-hexan cho lên cột có khóa nút thủy Cặn n-hexan (HLVH)(18,4g ) Cặn EtOAc (HLVE)(45,3g) Cặn MeOH (HLVM) (109,6g) Bã I Chiết 5×5l EtOAc Kiệt ñuổi d/ môi tinh ñầu cuối cột ñã ñược nhồi ướt silicagen ổn ñịnh Lần lượt rửa giải cột hệ dung môi n-hexan:etyl axetat với tỷ lệ etyl axetat tăng dần từ 0% ñến 100% Dịch rửa ñược thu lại phân ñoạn khác nhau, theo dõi trình rửa giải sắc ký lớp Chiết 5×5l MeOH Kiệt ñuổi d/ môi mỏng (SKLM) Các phân ñoạn giống ñược gộp lại với Bã II ñem cất ñuổi dung môi Các phân ñoạn có cấu tử ñược tinh chế phương pháp kết tinh lại kiểm tra ñộ tinh khiết sắc ký lớp Loại bỏ Bã III mỏng, ño nhiệt ñộ nóng chảy Trong trình tiến hành phân lập sắc ký cột cặn n-hexan thu ñược chất sau: Footer Page of 126 Header Page of 126 11 12 2.5.1.1 Hợp chất HLVH1 (hỗn hợp triterpenoid) Rửa giải cột hệ dung môi n- hexan:etyl axetat 50:1 thu ñược lọ axeton thu ñược tinh thể không màu, nóng chảy 155 – 1570C, [α]25D có chứa dịch không màu, thử mỏng chạy với hệ dung môi ñịnh cấu trúc HLVH3 H:E = 8:1 Soi thiết bị ñèn UV ñể xác ñịnh chất Sau ñó, phun thuốc thử Vanilin + H2SO4 sấy 100 0C thấy xuất vết tròn màu hồng có Rf = 0,6 = - 430 (c=0,05; CHCl3), Rf = 0,52 Sau ñó tiến hành ño phổ ñể xác 2.5.2 Phân lập tinh chế chất từ cặn chiết etyl axetat Làm tương tự mục 2.5.1, lấy 25g cặn etyl axetat thô ñem tách cột silicagen Rửa giải cột hệ dung môi cloroform: Để bay hết dung môi thu ñược chất rắn vô ñịnh hình màu metanol có tỷ lệ tăng dần từ – 100%, dịch rửa giải thoát từ cột trắng, kết tinh lại metanol thu ñược tinh thể hình kim (3mg), có thu khoảng cách nhỏ (5- 10 ml/ phân ñoạn) Kiểm tra cặn nhiệt ñộ nóng chảy 160 – 163 C Do lượng chất thu ñược ít, ghi ñược phổ 1H, 13CNMR HLVH1 Trên sở số liệu phổ NMR, chất HLVH1 ñược dự ñoán hỗn hợp triterpen 2.5.1.2 Hợp chất HLVH2 (β-sitosterol) Tiếp tục rửa giải hệ dung môi n- hexan:etyl axetat 30:1 thu ñược khối chất rắn màu trắng, hình kim, có khối lượng 72,3mg, thu ñược sắc ký lớp mỏng màu thuốc thử Vanilin– H2SO4 10%, sau ñó phân ñoạn giống ñược dồn lại ñem cất loại dung môi, thu ñược chất sau: 2.5.2.1 Hợp chất HLVE2 Tiếp tục rửa giải cột hệ dung môi cloroform: metanol 9:1, thu ñược chất rắn màu trắng kí hiệu HLVE2 có Rf = 0,5 hệ cloroform: metanol = 7:1, khối lượng 26 mg Ít tan metanol, hiệu xuất 6,03x10-3% Tan tốt cloroform, metanol có nhiệt clorofom sạch, tan tốt hệ dung môi cloroform : metanol / ñộ nóng chảy 136 – 1380C Trên mỏng với hệ dung môi H : E = 1:1 Điều chứng tỏ hợp chất HLVE2 hợp chất gồm phần: 4: 1, sau phun thuốc thử sấy thấy màu tím ñen Rf = 0,65 phần có chứa gốc phân cực (các nhóm hidroxy-OH) Sau ñó tiến hành ño phổ ñể xác ñịnh cấu trúc HLVH2 phần gồm chuỗi ankyl mạch dài không phân cực 2.5.1.3 Hợp chất HLVH3 (stigmasterol) Tiếp tục rửa giải cột hệ dung môi n- hexan:etyl axetat theo tỷ lệ 5:1 thu ñược khối chất rắn vô ñịnh hình Tinh chế lại khối chất cột silicagen cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, dùng hệ dung môi rửa giải n- hexan: etyl axetat theo tỷ lệ 5:1 thu ñược dung dịch không màu Chấm dịch hệ chạy mỏng n- hexan: etyl axetat = 2:1 thấy xuất vết tròn màu xanh lơ Đem kết tinh lại Footer Page of 126 Lấy mg chất HLVE2, 15 ml metanol vào bình cầu 50ml có nút nhám N29, thêm vào 2ml pyridin, ml anhydrid axetic (Ac2O) khuấy ñều nhiệt ñộ phòng, phản ứng thực qua ñêm Sau kết thúc phản ứng, (kiểm tra sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi nhexan/etylaxetat theo tỷ lệ 5:1), thêm vào 10ml nước, lắc ñều trung hoà HCl (pH=7), sau ñó chiết 3x20 ml CHCl3, làm khan Header Page of 126 14 13 dịch chiết cất loại dung môi thu ñược cặn tinh thể hình kim, không màu, khối lượng 3,4 mg, ký hiệu Peracetyl-HLVE2 Lấy 20 mg chất HLVE2 vào bình cầu ñáy tròn (50 ml), thêm Hoà tan mẫu chất rắn vào nước cho tác dụng với dung dịch AgNO3 thấy xuất kết tủa trắng chứng tỏ mẫu chất rắn có gốc clorua (Cl − ) ml dung dịch axit HCl 1N 10 ml metanol, phản ứng ñược ñun Cl − + Ag + → AgCl ↓ trắng hồi lưu 18 Sau phản ứng kết thúc (kiểm tra SKLM), ñể Thí nghiệm (xác ñịnh có mặt anion NO3-): nguội, chiết với 3×20 ml n-hexan Dịch chiết ñược rửa nước Hoà tan mẫu chất rắn vào nước, cho thêm vài ml dung dịch ñến pH = 7, sau ñó làm khan Na2SO4 lọc, ñuổi hết dung môi HCl ñồng nhỏ vào ñun nóng nhẹ Nếu dung dịch chuyển cho sản phẩm metyleste axit béo chất 2-hydroxyhexacosanoic sang màu xanh lam có khí không màu hoá nâu không khí axít (ký hiệu sản phẩm HLVE2.1) Phần nước lại ñược kiềm chứng tỏ mẫu chất rắn có gốc nitrat (NO3 - ) hoá NH4OH ñến pH = 10, chiết dietylete làm khan 3Cu + 8H+ + 2NO3- → 3Cu2+ + 2NO + 4H2O Na2SO4, cất loại dung môi thu cặn chứa aminoancol mạch dài Thí nghiệm (xác ñịnh có mặt anion SO42-): 2.5.2.2 Hợp chất HLVE1 Tiếp tục rửa giải cột hệ dung môi cloroform/metanol với Hoà tan mẫu chất rắn vào nước cho vài ml dung dịch BaCl2 thấy có kết tủa, chứng tỏ mẫu chất rắn có gốc sunfat tỉ lệ 7:1, thu ñược khối chất rắn vô ñịnh hình màu trắng, Rf = 0,45; (SO4 2-) khối lượng 31 mg, hiệu xuất 2,58x10-3 %, nóng chảy 273 – 275 0C Tiến hành ghi phổ chất HLVE1 ñể xác ñịnh cấu trúc HLVE1 Ba2+ + SO42- → BaSO4 ↓ trắng Thí nghiệm (xác ñịnh có mặt cation K+): Hoà tan mẫu chất rắn vào nước cho vài ml dung dịch 2.5.3 Phân lập chất từ dịch metanol Hợp chất HLVM1 (Hỗn hợp muối KNO3 KCl) Hợp chất HLVM1 (khối lượng 54 g, hiệu xuất 4,5%) thu ñược từ cặn chiết metanol Chúng ñã tiến hành khảo sát số thí nghiệm ñể xác ñịnh công thức phân tử hợp chất vô sở số vật lý (ñiểm nóng chảy > 330 0C, ñốt không cháy) tài liệu ñã công bố thành phần hóa học Lược vàng [10b] Thí nghiệm (xác ñịnh có mặt anion Cl-): Footer Page of 126 Natri cobantinitrit Na3[Co(NO2)6 ] thấy xuất kết tủa màu vàng, chứng tỏ mẫu chất rắn có ion kali (K +) Na3[Co(NO2)6 ] + 2K+ → K2Na[Co(NO2)6 ] ↓ vàng + 2Na+ Header Page of 126 15 16 ñến CHƯƠNG III màu ñỏ nhạt KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 XÁC ĐỊNH ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT VÀ THỬ H2SO4 ñặc Hồng nhạt + + HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT CÂY LƯỢC NaOH ñặc Vàng + + + + - + - - - - VÀNG (CALLISIA FRAGRANS ) 3.1.1 Xác ñịnh lớp chất thân Lược vàng Xanh FeCl3 5% Khi tiến hành ngâm chiết mẫu thường sử dụng dung môi hữu có ñộ phân cực tăng dần, thu ñược cặn Coumarin chiết có ñộ phân cực khác Việc chiết mẫu Lược vàng ñược thực theo sơ ñồ 2.1, kết thu ñược cặn hexan (HLVH) 18,4g chiếm 1,53%; cặn etyl axetat (HLVE) 45,3g chiếm 3,77 %; Glycosid tim thẫm Phản ứng tạo kết FeCl3 + H2SO4 + CH3COOH cặn metanol (HLVM) 109,6g chiếm 9,13% so với mẫu khô nghiên cứu ban ñầu Saponin Phản ứng tạo bọt * Kết phân tích ñịnh tính nhóm chất Bọt bền NaOH (-) Phản ứng âm tính vàng Sterol rõ (++) Phản ứng dương tính rõ Bảng 3.1: Kết ñịnh tính nhóm chất Lược Vàng nâu Ghi chú: (+) Phản ứng dương tính Lược vàng (Callisia fragrans) ñược nêu bảng 3.1 STT Nhóm chất Thuốc thử Có kết tủa Hiện tượng HLVH HLVE Lieberman- Màu xanh Bourchard vàng Kết quả: *) Trong cặn hexan HLVH có sterol flavonoit ++ ++ *) Trong cặn etyl axetat HLVE có flavonoit, sterol, coumarin Ancaloid Dragendorff Vàng da cam - - *) Cả cặn ñều ancaloit glucosid tim Như vậy, Lược vàng có sterol, flavonoid, coumarin, ancaloid glucosid tim Flavonoid Zn(Mg) HCl Footer Page of 126 + Dung dịch nhạt màu + + Header Page of 126 18 17 Tôi nhận thấy rằng: Nghiên cứu Viện dược liệu cho thấy 3.1.2 Thử hoạt tính sinh học cặn chiết Lược vàng Kết thử hoạt tính sinh học cặn chiết Lược chủng vi khuẩn thường gặp, cao chiết thân Lược vàng có tác dụng kháng khuẩn ñối với Staphylococcus aureus , vàng ñược trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2: Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh nghiên cứu lại tác dụng, sử dụng cặn chiết Lược vàng (Callisia fragrans) phần cao chiết từ Lược vàng Quảng Nam, Viện dược liệu sử dụng cao chiết thân Lược vàng nơi khác Điều ñó \ chứng tỏ tùy theo ñiều kiện thổ nhưỡng thành phần hóa học Nồng ñộ ức chế tối thiểu (MIC :µ µg/ml) Vi khuẩn Vi khuẩn Gr(-) Gr(+) Nấm mốc Lược vàng thay ñổi Nấm men 3.2 PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CÁC CHẤT TỪ DỊCH S Kí E P S B As F.O S C.an CHIẾT Kết ñã phân lập ñược hợp chất hữu thuộc nhóm chất T hiệu co aerugin Au Subtill p xys b steroit, glicosid lượng lớn muối vô T mẫu li osa reu is Nig poru re v m ican 3.2.1 Hợp chất vô (HLVM1) s er ce s Sau ngâm chiết mẫu Lược vàng n- isi hexan etyl axetat, dịch chiết metanol sau ñuổi kiệt dung ae môi, tủa ñược rửa nhiều lần metanol lạnh (T ~ 00C), cặn thu HLVH (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) ñược kết tinh lại metanol nóng thu ñược tinh thể HLVE (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) hình kim không màu, có khối lượng 54g (4,5% so với mẫu nghiên HLVM (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) cứu ban ñầu), tan tốt metanol nước ñốt không (-) cháy Nó có ñiểm chảy 333 – 334 0C, nhiệt nóng chảy hỗn hợp Trong ñó mẫu thô có MIC ( nồng ñộ ức chế tối thiểu ) ≤ với KNO3 chuẩn không thay ñổi Khi nung hợp chất nhiệt ñộ 200 µg/ml có hoạt tính 350 0C thời gian dài, thu ñược hợp chất có ñiểm Ghi chú: (+) Phản ứng dương tính nóng chảy cao 441 0C ñây sản phẩm nitrit kali (KNO2) (-) Phản ứng âm tính Nhận xét: Các mẫu thử ñều không biểu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh Footer Page of 126 ñược tạo thành KNO3 bị phân hủy Qua việc khảo sát số thí nghiệm ñể xác ñịnh công thức phân tử hợp chất vô mục 2.5.3.1, ñã xác ñịnh ñược thành phần HLVM1 có Header Page 10 of 126 20 19 chứa ion kali (K + ), anion nitrat (NO3 - ), chứa anion clorua sunphat (Cl − , SO42-) Do vậy, cách so sánh số vật lý với KNO3 chuẩn cách làm khẳng ñịnh hợp chất thu ñược HLVM1 kali nirat (KNO3) 3.2.2 Hợp chất HLVH2 (β-sitosterol) Từ kết phân tích thành phần hoá học, tính chất vật lý, tính chất quang phổ dựa sở so sánh số liệu phổ chất HLVH2 với phổ chất β-sitosterol chuẩn, kết hợp với việc 3.2.4 Hợp chất HLVE2 (Calliceramide) xác ñịnh ñiểm chảy hỗn hợp HLVH2 với β-sitosterol không Qua việc phân tích số liệu phổ HLVE2, sản ñổi, cho phép quy kết chất HLVH2 ñã phân lập ñược từ phẩm acyl hóa thủy phân axít metanol nó, kết hợp so Lược vàng 24R-stigmasta-5-en-3-β-ol hay β-sitosterol, cấu trúc sánh số liệu phổ 1H 13C-NMR cerebrozit tương tự [23, HLVH2 sau: 24, 25, 26], ñã chứng tỏ chất HLVE2 cerebrosid có công thức phân tử: C42H85NO5 (M=683) ñược hình thành axit 2hydroxyhexacosanoic 2-amino-hexadeca-1,3,4-triol với cấu trúc hóa học (2S, 3S, 4R)-2-(2’R-hydroxyhexacosanoyl)-amino- hexadeca-1,3,4-triol ñặt tên Calliceramide, với công thức cấu tạo hình 3.9, số liệu phổ HLVE2 ñược nêu bảng 3.5 3.2.3 Hợp chất HLVH3 (Stigmasterol) Từ kết phân tích thành phần hoá học, tính chất vật lý, tính chất quang phổ dựa sở so sánh số liệu phổ chất HLVH3 với phổ chất stigmasterol hoàn toàn cho phép quy kết chất HLVH3 ñã phân lập ñược từ Lược vàng stigmasterol cấu trúc HLVH3 là: Footer Page 10 of 126 Sản phẩm acyl hóa Peracetyl HLVE2 tạo thành theo phản ứng ñây: Header Page 11 of 126 22 21 Từ số liệu phổ cho thấy chất HLVE1 phân lập ñược từ lược vàng 3-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-sitosterol với cấu trúc hóa học sau: Peracetyl HLVE2 Còn sản phẩm HLVE2.1 HLVE2.2 ñược hình thành theo phản ứng thủy phân axít metanol theo phương trình phản ứng sau: Footer Page 11 of 126 3-O-(β β -D-glucopyranosyl)-β β-sitosterol Header Page 12 of 126 23 24 KẾT LUẬN Lần ñầu tiên Lược vàng trồng Quảng Nam ñược thu hái, KIẾN NGHỊ Sau trình thực ñề tài này, có số kiến nghị sau: xác ñịnh tên khoa học Callisia fragrans Đã xác lập ñược qui trình ngâm chiết thích hợp cho việc phân Tùy ñiều kiện thổ nhưỡng vùng khác nên lập chất Lược vàng ñã phân tích ñịnh tính số chất có Lược vàng khác cần phải thực lớp chất có là: sterol, coumarin, flavonoid thí nghiệm nhiều vùng khác ñể tìm ñược Đã phân lập, ño số vật lý, phổ (IR, MS, 1D 2D- chất có nhiều ứng dụng thực tế NMR) cho chất xác ñịnh ñược cấu trúc hóa học chất Tiếp tục nghiên cứu hợp chất có thân Lược Chúng gồm: β-sitosterol (HLVH2), stigmasterol (HLVH3), 3- vàng dung môi có ñộ phân cực khác tương tự O-β-D-glucopyranosyl-β-sitosterol Lược vàng ñể so sánh ñược thành phần thân (HLVE1), calliceramide (HLVE2) chất vô KNO3 (HLVM1) với hàm lượng cao (khoảng 4,5% so với mẫu khô) Hợp chất calliceramide (HLVE2) lần ñầu tiên phân lập ñược từ Lược vàng, chất Đã thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh cho dịch chiết n- nhằm phục vụ tốt cho nghiên cứu sau Tiếp tục thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh cho dịch chiết metanol (HLVM) ñể tìm kết Hợp chất calliceramide (HLVE2) lần ñầu tiên phân lập hexan (HLVH) dịch chiết etyl axetat (HLVE) ñều cho kết ñược từ Lược vàng, chất cần ñược tiếp tục âm tính nghiên cứu ñể biết ứng dông cụ thể Footer Page 12 of 126  ... Tình hình nghiên cứu Lược vàng 1.3.4.1 Tình hình nghiên cứu Lược vàng giới 1.3.4.2 Tình hình nghiên cứu Lược vàng Việt Nam CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 2.1 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU... bang Nga ñề cập kinh nghiệm sử dụng Lược vàng phòng chữa bệnh Tại Việt Nam, có vài công trình nghiên cứu sơ thực vật Vấn ñề ñặt nghiên cứu hóa thực vật sâu Phương pháp xác ñịnh thành phần hóa học,... Ca, Mn, ñới nóng Cây phân bố bãi hoang, ñất ẩm, bờ nước, số Co, Ni, Cu, Zn, Zr…[12, 13, 14, 15, 16, 27, 28] Những nghiên cứu loài khác chi Callisia làm cảnh [25, 26, 27] Ở Việt Nam theo thống kê