phương pháp phân tích kháng sinh cấm enrofloxacin trong nguyên liệu tôm. Enrofloxacin là chất kháng sinh có trong thuốc thú y nhập khẩu từ Trung Quốc để trị bệnh nhiễm trùng cho gia súc, gia cầm. Trong thủy sản, Enrofloxacin được sử dụng để kiểm soát môi trường và phòng trị bệnh cho tôm. Chất này nằm trong danh mục các hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất thủy sản.
KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN MỤC LỤC Trang 1.Đặc điểm nguyên liệu tôm 1.1.Cấu tạo chung tôm .3 1.2 Thành phần hoá học tôm 1.2.1 Protêin 1.2.2 Nước .4 1.2.3.Vitamin chất khoáng 1.2.4 Các sắc tố .5 1.2.5 Các chất ngấm Các tượng hư hỏng thường gặp tôm 2.1 Nguyên nhân học 2.2 Nguyên nhân hoá học Các sản phẩm tôm Tìm hiểu chất ENROFLOXACIN Nguyên nhân ENROFLOXACIN có nguyên liệu tôm .8 Các phương pháp xác định ENROFLOXACIN 6.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Với Detetor huỳnh quang 6.2 Phương Pháp Elisa 17 Cách tiến hành phân tích Enrofloxacin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .18 TÀI LIỆU THAM KHẢO .24 GVHD: Page KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN LỜI MỞ ĐẦU Trong kinh tế quốc dân, thuỷ sản ngành kinh tế kĩ thuật có vai trò quan trọng, nguồn lợi thuỷ sản tài nguyên sinh vật có khả tái tạo, có giá trị kinh tế xã hội có ý nghĩa khoa học phát triển đất nước Việt Nam nằm bên bờ Tây Biển Đông, biển lớn Thái Bình Dương, có diện tích khoảng 3.448.000 km2, có bờ biển dài 3260 km Vùng nội thuỷ lãnh hải rộng 226.000km2, vùng biển đặc quyền kinh tế rộng triệu km với 4.000 đảo, tạo nên 12 vịnh, đầm phá với tổng diện tích 1.160km che chắn tốt dễ trú đậu tàu thuyền Biển Việt Nam có tính đa dạng sinh học cao, nơi phát sinh phát tán nhiều nhóm sinh vật biển vùng nhiệt đới Ấn Độ - Thái Bình Dương với chừng 11.000 loài sinh vật phát Nước ta với hệ thống sông ngòi dày đặc có đường biển dài thuận lợi phát triển hoạt động khai thác nuôi trồng thủy sản Sản lượng thủy sản Việt Nam trì tăng trưởng liên tục 17 năm qua với mức tăng bình quân 9,07%/năm Với chủ trương thúc đẩy phát triển phủ, hoạt động nuôi trồng thủy sản có bước phát triển mạnh, sản lượng liên tục tăng cao năm qua, bình quân đạt 12,77%/năm, đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản nước Hằng năm xuất thuỷ sản đem lại nguồn ngoại tệ lớn cho đất nước Trong tôm mặt hàng xuất chủ lực góp phần không nhỏ vào tăng trưởng kinh tế chung đất nước Nhưng năm gần tình hình sử dụng kháng sinh nuôi tôm tăng cao diễn biến ngày phức tạp đặc biệt kháng sinh Enrofloxacin Dư lượng kháng sinh tôm ngày đe doạ sức khoẻ người tiêu dùng gây khó khăn cho việc xuất thuỷ sản nước Hiểu trăn trở nhóm chúng em định chọn đề tài “ Tìm hiểu kháng sinh cấm Enrofloxacin tôm/ sản phẩm tôm” GVHD: Page KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN 1.Đặc điểm nguyên liệu tôm 1.1.Cấu tạo chung tôm Tôm gồm hai phần, phần trước đầu ngực, phần sau thân Đầu tôm có cấu tạo nguyên thủy, mắt có cuống, chân có đốt, có hai đôi râu xúc giác, phần đầu ngực bao bọc giáp đầu ngực, ba đôi chân biến hoá thành chân hàm dùng để đón thức ăn, năm đôi chân ngực lại dùng để lam chân bò Một số loài tôm chân trước biến thành kềm khoẻ Phần thân tôm gồm có bảy đốt, có bảy đôi chân phân thành hai nhánh, đốt cuối hợp với chân bơi tạo thành chân đuôi để tạo nên bánh lái trình di chuyển Tôm đất Tôm sú Tôm thẻ Bảng 1.Thành phần khối lượng số loài tôm (theo%) Loại tôm Tôm sú Tôm thẻ Tôm Tôm hùm Thịt tôm 59.07 60.00 57.36 36.57 Đầu 31.04 31.00 31.55 52.02 Vỏ 8.09 9.00 1.09 8.39 1.2 Thành phần hoá học tôm Thành phần hoá học tôm bao gồm prôtein, lipit, tro, nước, vitamin, men, muối vô cơ, gluxit Những thành phần tương đối nhiều nước, prôtein số muối vô Thành phần hoá học khác tuỳ theo giống loài, hoàn cảnh sinh sống khác khác Ngoài chúng tuỳ theo trang thái sinh lý, đực cái, mùa vụ, thời tiết… Sự khác thành phần hoá học tôm biến đổi chúng làm ảnh hưởng tới mùi vị, giá trị dinh dưỡng sản phẩm, đến việc bảo quản tươi nguyên liệu Bảng 2: Hàm lượng chất dinh dưỡng tính theo phần trăm thịt tôm tươi Loại Tôm GVHD: Protein Lipid Page Tro Nước KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN Tôm He Tôm Sú Tôm Thẻ Tôm Chì Tôm Rảo Tôm Sắc Tôm Càng Tôm Hùm 20.00 21.00 19.27 18.97 20.05 19.05 18.97 20.81 0.70 1.07 0.92 0.93 0.70 0.60 1.19 1.30 1.63 1.42 1.55 1.28 1.55 1.44 1.14 1.32 77.00 75.90 76.63 76.98 76.32 76.56 76.65 74.57 1.2.1 Protêin Protêin thành phần chủ yếu thịt tôm, chiếm từ 70 – 80 % tỷ lệ thịt theo chất khô Protêin tôm liên quan đến chất hữu cơ, vô khác tạo thành chất có đặc tính sinh học đặc trưng khác Tuỳ theo loại tôm, mùa vụ, trạng thái sinh lý mà hàm lượng prot êin thay đổi khoảng 18 – 23 % Protêin tôm chia làm hai nhóm sau: - Chất hoà tan ( tương ) Bao gồm chất sau: Actin, myozin, troponyozin actomyozin Chúng chiếm 70 -80 % hàm lượng protein, chúng hoà tan dung dịch muối trung tính nồng độ ion cao Myoabumin, globulin enzyme Chúng hoà tan dung dịch muối trung tính với nồng độ ion thấp, chúng chiếm từ 20 – 35 % protein - Chất Calogen, eslactin: Chiếm khoảng 3% protein liên kết, có khoảng 2,5 % protêin không hoàn thiện 1.2.2 Nước Trong tôm hàm lượng nước chiếm tương đối cao từ 70 – 85 % Vì làm cho thân tôm mềm mại, hấp dẫn tăng tính cảm quan làm cho thân tôm mềm dể bị dập nát tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme vi sinh vật phát triển 1.2.3.Vitamin chất khoáng Lượng Vitamin chất khoáng tôm đặc trưng theo loại sau biến theo mùa Nhìn chung thịt tôm giàu Vitamin A, Vitamin B … Về mặt chất khoáng thịt tôm coi nguồn quý calcium photpho nói riêng nguồn quý đồng, sắt Bảng 3: Thành phần khoáng thịt tôm (mg%) Ca GVHD: Photpho Fe Ne Page K Mg Cu KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN 29-50 33-6.6 1.2-5.1 11-127 127-565 0.0421 331- 1.2.4 Các sắc tố Tôm chứa nhiều sắc tố khác chủ yếu astoxanthin, dẫn suất canđen Trong thành phần vỏ tôm astaxanthin tham gia vào thành phần lipoprotein gọi cianin Ngoài tôm có phân ly sắc tố tím, đen tiền astaxanthin tetraxanthin 1.2.5 Các chất ngấm Các chất ngấm chủ yếu chất hoà tan chứa nitơ chất hoà tan nước, phân tử lượng thấp, chứa nitơ với chất phiprotein Khi ngâm thịt tôm vào nước ấm phần chất hoà tan (cùng với chất hoà tan không chứa đạm) ta gọi chất ngấm Hàm lượng chất ngấm chiếm khoảng – % thịt tôm tươi Lượng chất ngấm đứng dinh dưỡng không lớn đứng mặt sinh lý, mùi vị dóng vai trò quan trọng, định mùi vị đặc trưng cho sản phẩm Chất ngấm dễ bị vi sinh vật tác dụng gây thối rửa làm giảm khả bảo quản nguyên liệu Tốc độ phân huỷ nguyên liệu nhanh chậm tính chất số lượng chất ngấm nguyên liệu định Nhóm phiprotein chứa nhiều acid amim tự như: Albumine, lucein, acid alphatic, arinine, tyrosine, protêin Các tượng hư hỏng thường gặp tôm 2.1 Nguyên nhân học: Tôm bị hư hỏng thịt: đứt đầu, dãn đốt, long đầu,… Tác hại: không ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng sản phẩm, ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan nguyên liệu sản phẩm 2.2.Nguyên nhân hóa học: Hiện tượng biến đen: Tôm sau đánh bắt vài xuất chấm đen không bảo quản tốt Chấm đen xuất gần mang, chân, đầu, bảo quản xuất chấm màu nâu, sau chuyển sang vết đen Tác hại: tượng không làm giảm chất lượng tôm làm cho cảm quan tôm bị giảm, ảnh hưởng xấu đến thành phẩm • Hiện tượng biến đỏ Tôm bị biến đỏ: vỏ thịt tôm có màu đỏ Tác hại: làm giảm chất lượng, ngoại hình tôm thay đổi, thân tôm bị đỏ, đàu long khỏi thân, vỏ tôm dễ bị tách khỏi thân thịt, xuất mùi khai thối tôm Các sản phẩm tôm • GVHD: Page KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN HOSO ( đầu, vỏ): Tôm nguyên hình dạng làm sạch, xếp vào khuôn, cấp đông Tuy nhiên, thực hình thức chế biến nguyên nội tạng tôm, phần dễ làm cho tôm phân hủy nhanh không bảo quản kỹ lưỡng từ thu hoạch đông HLSO: headless shell-on: Tôm bỏ đầu vỏ đuôi nguyên PD: peeled and deveined shrimp: Tôm lột vỏ, lấy PUD:peeled undeveined shrimp Tôm lột hết vỏ không rút PTO: peeled tail-on Tom lột vỏ chừa đuôi Chừa lại đốt thứ cuối gai nhọn, cánh đuôi SUSHI Tôm sushi chín loại tôm hấp chế biến theo quy cách khách hàng Nhật Bản Tôm cắt tia tạo hình đóng gói khay, hút chân không Tôm sushi nguyên liệu để thành ăn dân tộc sushi tôm người Nhật NOBASHI: nobashi Ebi Tôm chế biến theo quy cách người Nhật Nobashi tiếng Nhật có nghĩa bóp dãn ra, Ebi tôm Tìm hiểu chất ENROFLOXACIN Enrofloxacin chất kháng sinh có thuốc thú y nhập từ Trung Quốc để trị bệnh nhiễm trùng cho gia súc, gia cầm Trong thủy sản, Enrofloxacin sử dụng để kiểm soát môi trường phòng trị bệnh cho tôm Chất nằm danh mục hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng sản xuất thủy sản Enrofloxacin kháng sinh phổ rộng có khả kháng khuẩn tổng hợp, thuộc nhóm kháng sinh Fluoroquinolone Nó có khả hoạt động chống lại vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm Mycoplasma Cơ chế hoạt động chủ yếu Quinilones ức chế DNA gyrase vi khuẩn, loại enzyme chịu trách nhiệm kiểm soát trình cuộn DNA vi khuẩn trình chép Resealing xoắn kép bị ức chế dẫn đến suy thoái nhiễm sắc thể Fluoroquinolones có hoạt tính chống lại vi khuẩn cách thay đổi tính thấm màng Phospholipid bên tế bào Công thức cấu tạo Enrofloxacin: GVHD: Page KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN * Một số sản phẩm Enrofloxacin thị trường: *Tác hại: GVHD: Page KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN Enrofloxacin kháng sinh có độc tính cao sử dụng với liều định, quy định chặt chẽ thuộc loại kháng sinh cấm sử dụng - Đối với người: Khi ăn phải sản phẩm có chứa dư lượng Enrofloxacin từ 150-200g sản phẩm/ngày lượng Enrofloxacin đưa vào thể khoảng 2μg/ngày Với lượng không gây độc tính ngay, tích luỹ lâu dài ăn nhiều ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ Enrofloxacin phân bố đồng dịch nội bào ngoại bào, phân bố hầu hết quan phổi, gan, mật, xương, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch não tuỷ qua hàng rào thai Nó tiết chủ yếu qua đường tiết niệu dạng nguyên hoạt chất tái hấp thu thụ động thận - Đối với thân tôm: Việc sử dụng kiểm soát kháng sinh nuôi tôm dẫn tới tình trạng kháng thuốc vi khuẩn làm cho việc điều trị bệnh cho tôm sau ngày khó khăn sản phẩm tôm không đảm bảo an toàn thực phẩm Việc lạm dụng kháng sinh làm cho tôm chậm tăng trưởng ảnh hưởng nghiêm trọng đến kinh tế Nguyên nhân ENROFLOXACIN có nguyên liệu tôm - Người nuôi sử dụng Enrofloxacin tràn lang mặc bị liệt vào danh mục kháng sinh cấm Trước thời gian thu hoạch 28 ngày người dân sử dụng Enrofloxacin nên tôm dư lượng kháng sinh Nếu ngưng sử dụng Enrofloxacin 28 ngày trước thu hoạch, tôm không dư lượng chất - Công tác kiểm tra, xử phạt việc buôn bán Enrofloxacin sở kinh doanh thuốc thú y, thuỷ sản người sử dụng lỏng lẻo chưa triệt để - Bản thân nhà máy chế biến khó kiểm soát dư lượng Enrofloxacin tôm nguyên liệu đưa nhà máy Các phương pháp xác định ENROFLOXACIN Việc kiểm nghiệm dư lượng kháng sinh thực phẩm vấn đề cấp thiết để đảm bảo sức khỏe người tiêu dùng nhu cầu xuất hàng hóa Enrofloxacin (ENRa) loại khán sinh tổng hợp từ mười năm trước, nhiên lại nhiều phương pháp phân tích Có hai phương pháp thường dùng để phân tích Enrofloxacin: - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC với detetor huỳnh quang - Phương pháp Elisa 6.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Với Detetor huỳnh quang * Khái niệm: GVHD: Page KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) đời năm 1967-1968 sở phát triển cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC phương pháp chia tách pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn, hay chất mang biến liên kết hóa học với nhóm chức hữu Phương pháp ngày sử dụng rộng rãi phổ biến nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả định lượng tốt, thích hợp tách hợp chất khó bay dễ phân hủy nhiệt Phạm vi ứng dụng phương pháp HPLC rộng, phân tích hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, chất phụ gia thực phẩm lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường… * Nội dung phương pháp: Yêu cầu phương pháp sử dụng hệ sắc ký gồm cột tách, pha dao động cho phù hợp với chất phân tích, đạt hiệu tách cao, độ nhạy cao chọn lọc, nội dung phương pháp bao gồm: − Lựa chọn hệ sắc ký gồm cột tách , pha dao động detetor − Tối ưu hóa vận hành cột gồm lựa chọn pha động tốc độ rửa giải − Đánh giá phương pháp tách cực tiểu phát định lượng, khoáng tuyến tính phép đo, độ xác, độ lặp lại * Phân loại: Dựa vào khác chế tách chiết sử dụng HPLC, người ta chia HPLC thành loại: • Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography) • Sắc ký phân bố (partition chromatography) • Sắc ký ion (ion chromatography) • Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography) • Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) ứng dụng nhiều phân tích hợp chất từ không phân cực đến hợp chất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không lớn ( 7), silic mang pha tĩnh bị hòa tan (SiO2 thành silicat), hệ N giảm số nhánh ghép giảm, mũi rộng thời gian lưu giảm Kết phân tích độ xác Một cách khắc phục tượng dùng chất trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH (gọi tượng end-capping) Lúc ta có loại cột tương tác với chất phân tích có tính baz (cột LC-DB hãng SUPELCO) Hình Cấu trúc cột LC-DB Có cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng nhóm –OH mà không cần tương tác với thay nhóm methyl –Si(CH3)2-C18 nhóm lớn isopropyl để nhóm che nhóm –OH, cản trở tương tác nhóm – OH với chất cần phân tích Hình 5: Cấu trúc cột có gốc isopropyl Người ta ghép lên dây C18 số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực dây C18, làm cột có khả tách chọn lọc hợp chất phân cực mạnh (cột EPS – Expended Polar Selectivity) Ngoài sườn silica, thời gian gần người ta có sử dụng đến nhựa polystyren GVHD: Page 12 KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN (Polystyren Reversed Phase – PRP) cho phép phân tích môi trường pH từ – 13 Cột dễ sử dụng môi trường acid bazơ mạnh * Pha động sắc ký pha đảo Pha động sắc ký lỏng nói chung phải đạt yêu cầu sau: • Hòa tan mẫu phân tích • Phù hợp với đầu dò • Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh • Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao • Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade) Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết sử dụng nhiều dung môi kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) tetrahydrofuran (THF) đạt yêu cầu Nước dung môi cho vào dung môi hữu để giảm khả rửa giải Mỗi dung môi đặc trưng số vật lý số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ rửa giải (eluent strength)… Trong độ phân cực độ rửa giải có tác động lớn lên khả phân tách mũi sắc ký GVHD: Page 13 KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN Bảng 4: Tính chất số pha động sắc ký lỏng Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N, hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α Khi thay đổi thành phần pha động không đem lại kết tách mũi theo yêu cầu phải thay đổi chất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi α Đôi phải thay đổi pha tĩnh Trong trình tách SKPĐ, tương tác hợp chất cần phân tích pha động phụ thuộc nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) tính baz (nhận proton) dung môi Thông thường pha động SKPĐ bao gồm hỗn hợp nước dung dịch đệm với nhiều dung môi hữu phân cực tan nước Nước dung môi phân cực nên không tương tác với nhóm alkyl không phân cực pha tĩnh, coi pha động yếu có tốc độ rửa giải chậm tất dung môi động SKPĐ Hỗn hợp nước dung môi hữu thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột GVHD: Page 14 KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN Hình 6: Độ nhớt hỗn hợp nước dung môi hữu 25oC Việc lựa chọn dung môi thành phần dung môi pha động tối ưu hóa cho hợp chất cần phân tích Thông thường, người ta sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/nước trước, ACN/nước hay THF/nước Với hỗn hợp chất phân tích phức tạp có trộn lẫn dung môi hữu với nước Khi lựa chọn phải chọn hỗn hợp MeOH, ACN THF với nước có độ rửa giải tương đồng Thành phần pha động cố định suốt trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) thay đổi theo chương trình định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu tách tốt * Một số đại lượng phân tích sắc ký + Hệ số phân bố Cân cấu tử X hệ sắc ký mô tả phương trình sau: Hằng số cân K cho cân gọi tỉ lệ phân bố hay số phân bố (partition coefficient) tính sau: GVHD: Page 15 KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN Với CS : nồng độ cấu tử pha tĩnh CM : nồng độ cấu tử pha động Hệ số K tùy thuộc vào chất pha tĩnh, pha động chất phân tích + Thời gian lưu: tR : thời gian lưu cấu tử từ vào cột đến tách ngồi cột tO : thời gian chất lực với pha tĩnh qua cột; thời gian pha động từ đầu cột đến cuối cột gọi thời gian lưu chết tR’ : thời gian lưu thật cấu tử Hình Thời gian lưu cấu tử phân tích +Hệ số dung lượng k’ k’ định nghĩa theo công thức sau: Với VS : thể tích pha tĩnh VM : thể tích pha động Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất nhanh, cột khả giữ chất lại Nếu k’ lớn (tR lớn): chất cột lâu, thời gian phân tích lâu, mũi có khả bị tù Khoảng k’ lý tưởng 2-5, phân tích hỗn hợp phức tạp, k’ chấp nhận khoảng rộng 1-20 + Hiệu Hiệu hay số đĩa lý thuyết N cột đặc trưng cho khả tách mũi sắc ký cấu tử cột N lớn, hiệu tách cao Số đĩa lý thuyết đo sắc ký đồ Người ta chứng minh được: GVHD: Page 16 KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN Hay Với W1/2 chiều rộng mũi sắc ký vị trí ½ chiều cao mũi (phút) W chiều rộng mũi sắc ký vị trí đáy mũi (phút) + Độ chọn lọc Đặc trưng cho khả tách hai chất cột + Độ phân giải: Đây đại lượng biểu thị rõ ba khả cột sắc ký: giải hấp, chọn lọc hiệu tách Nó xác định qua phương trình sau: Hay Với N xác định từ phương trình (2.5) (2.6) 6.2 Phương Pháp Elisa GVHD: Page 17 KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Hay gọi phương pháp ELISA hay EIA kỹ thuật sinh hóa để phát kháng thể hay kháng nguyên mẫu xét nghiệm Hiện ELISA sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học,nông nghiệp đặc biệt quy trình kiểm tra an toàn chất lượng sản phẩm sinh học Nguyên lý ELISA dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể gồm bước sau: (1) Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết gắn bề mặt; (2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước "rửa" qua bề mặt Kháng thể gắn kết với enzyme; (3) Thêm vào chất (substance); enzyme biến đổi chất tạo tín hiệu xác định Đối với ELISA phát quang, ánh sáng phát từ mẫu chứa KN-KT Sự diện phức hợp KN-KT định cường độ sáng phát ra.Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định có mặt hay mặt lượng KN mẫu nghiên cứu Để tiến hành ELISA cần phải có KT đặc hiệu cho KN chưa biết Thông thường KN cố định giếng vi phiếm (polystyrene microtiter plate) - Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt giếng - Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): KN gắn với kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần kiểm tra KT đặc hiệu thêm vào, phản ứng tạo phức hợp KT-KN xảy Nếu KT gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học enzyme làm biến đổi chất giúp phát KN cần kiểm tra Trong trường hợp sử dụng KT thứ cấp (secondary antibody) gắn với enzyme thông qua liên kết cộng hóa trị phân tử sinh học (bioconjugation), KN cần xác định nhận biết qua KT thứ cấp Giữa bước ELISA, protein KT không đặc hiệu, KT không gắn với KN lấy nhờ loại dịch có tác dụng "rửa" Sau bước "rửa" cuối cùng, KT liên kết với KN giữ lại Sau thêm vào, chất chịu tác dụng enzyme liên kết với KT phức hợp KT-KN Phản ứng phát quang (biến đổi chất) xảy Trước chất tạo màu sắc sử dụng ELISA ngày chất phát quang dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu độ xác ELISA Cách tiến hành phân tích Enrofloxacin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) * Thiết bị dụng cụ: - Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang GVHD: Page 18 KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN - Cột sắc ký pha đảo C18, kích thước cột L x ID: 250 x 3mm, kí hiệu 100 – C18 AB, loại Nucleosil - Máy nghiền đồng thể, tốc độ 6000- 30 000 vòng/ phút ( KCH- 1000) - Bể điều nhiệt hoạt động nhiệt độ 20- 1000C (GRANT Y14) - Máy lắc, tốc độ 50- 500 vòng/ phút.( IKA KS 260 basic) - Máy ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút ( Sigama 4K15) - Máy rung trộn mẫu ( HW ASHN technoogy Co 250VM) - Bình khí Nitơ tinh khiết 99.999% - Ống ly tâm thủy tinh dung tích 15,25 50ml - Pasteur pipet với bóp cao su - Pipet định mức 10ml - Bình định mức dung tích: 10; 20; 25; 100; 500 1000ml - Giấy lọc 0,45mm - Cốc có mỏ dung tích 250ml * Hóa chất: Hóa chất phải loại tinh khiết sử dụng để phân tích gồm: Axetonitrile ( CH3CN) dùng cho HPLC Diclorometan (CH2Cl2) dùng cho HPLC Aceton dùng cho HPLC Nước cất dùng cho HPLC Acid phosphoride (H3PO4) đậm đặc dùng cho HPLC Dinatri hydro phosphat ( Na2HPO4) Acid citric GVHD: Page 19 KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN Natri hydroxit ( NaOH) Tác nhân tạo dẫn xuất luorescamin ( Fluram) Chuẩn chất nhóm fluoroquinolone Chuẩn nội enrofloxacin * Dung dịch thử dung dịch chuẩn: - Các dung dịch natri hydroxit + Dung dịch natri hydroxit 10M: hòa tan 40g NaOH nước cất để có 100ml + Dung dịch natri hydroxit 1M: hòa tan 4g NaOH nước cất để có 100ml + Dung dịch natri hydroxit 0,1M: pha loãng 1ml dung dịch NaOH 1M nước cất để có 10ml - Dung dịch acetonitril /H3PO4 pH= 6,0 + Cho 80ml acetonitril 20ml H3PO4 0,02M vào cốc 250 ml Dung dịch để nguội tới nhiệt độ phòng Dùng dung dịch natri hydroxit 1M dung dịch natri hydroxit 0,1M chỉnh pH= 6,0; 0,1 - Dung dịch đệm citrat 0,5M, pH= 3,0 Hòa tan 10,5g axit citric với 100ml nước cất, chỉnh Ph= 3,0; 0,1 dung dịch natri hydroxit 10M, dung dịch natri hydroxit 1M dung dịch natri hydroxit 0,1M - Dung dịch đệm cho tạo dẫn xuất: trộn theo thể tích gồm phần acetonitril/ H 3PO4 Ph= 6,0 với phần dung dịch đệm citrat 0,5M, pH=3,0 - Dung dịch fluorescamin 10mg/ml: hòa tan 50mg tác nhân tạo dẫn xuất fluoroquinolone 5ml aceton - Các chất thuộc nhóm fluoroquinolone + Dung dịch chuẩn nội enrofloxacin 1mg/ml: hòa tan 10mg chuẩn nội fluoroquinolone 10ml metanol + Dung dịch chuẩn nội enrofloxacin 50mg/ml: hút 1ml fluoroquinolone 1mg/ml vào bình định mức 20ml định mức tới vạch methanol + Dung dịch chuẩn nội enrofloxacin 5mg/ml: pha loãng 1ml fluoroquinolone 50mg/ml với nước cất để có 10ml - Các dung dịch chuẩn + Dung dịch chuẩn gốc enrofloxacin 100mg/ml: cân 10,0mg loại chất nhóm fluoroquinolone 100mg/ml Sau đó, hòa tan định mức đến vạch 100ml methanol + Dung dịch chuẩn trung gian fluoroquinolone 1000mg/ml: hút xác 1,0ml dung dịch chuẩn gốc fluoroquinolone 100mg/ml vào bình định mức 100ml Sau đó, định mức đến vạch methenol + Các dung dịch chuẩn fluoroquinolone để đựng đường chuẩn: 0; 1,0 ; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0mg/ml GVHD: Page 20 KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN + Hút 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 5,0 dung dịch fluoroquinolone 1000mg/ml vào bình định mức 500ml Sau đó, định mức tới vạch methenol - Pha động + Dung dịch H3PO4 0,02M: hòa tan 2,3g H3PO4 85% với nước cất định mức thành 1000ml + Hỗn hợp dung dịch methanol acetonitril (tỷ lệ 1:1) hòa tan 500ml methanol 500ml acetonitril * Cách tiến hành: - Chuẩn bị mẫu thử: + Nghiền 200g mẫu máy nghiền đồng thể Cân xác 5,0g mẫu nghiền ( kí hiêu W) cho vào ống ly tâm thủy tinh 25ml + Thêm 10m acetonitril 2,5ml diclorometan vào ống ly tâm thủy tinh 25ml có chứa 5,0g mẫu thử Sau đó, lắc ống 10 phút máy lắc Tiếp theo ly tâm 10 phút tốc độ 6000 vòng/ phút + Dùng pasteur pipet hút lớp vào bình định mức 25ml Thực lại bước chiết gom tất phần dịch chiết vào bình định mức 25ml, làm đầy tới vạch định mức acetonitril + Hút xác 10ml dịch chiết cho vào ống nghiệm thủy tinh 15ml để bay tới cặn khô dòng khí nitrogen nhiệt độ 500C bể điều nhiệt - Chuẩn bị mẫu trắng: Mẫu trắng mẫu thủy sản xác định enrofloxacin Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng chuẩn bị mẫu thử - Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 100g/g Thêm xác 500ml dung dịch chuẩn fluoroquinolone trung gian 1000mg/ml vào 5g mẫu trắng Tiến hành chuấn bị mẫu xác đinh độ thu hồi 100mg/g chuẩn bị mẫu thử - Chuẩn bị dung dịch đường chuẩn: Hút xác 10ml dung dịch chuẩn fluoroquinolone để dựng đường chuẩn vào ống nghiệm thủy tinh 15ml Sau đó, cho dung dịch bay tới cặn khô dòng khí nitrogen nhiệt độ 500c bể điều nhiệt Tiếp tục thực bước tạo dẫn xuất huỳnh quang - Tạo dẫn xuất huỳnh quang: Thêm vào ống nghiệm chứa mẫu chuẩn bị dung dịch gồm: 1ml dung dịch thêm tạo dẫn xuất, 20ml dung dịch chuẩn nội enrofloxacin 5mg/ml 0,2ml dung dịch fluoroquinolone 10mg/ml Sau đó, phản ứng khoảng 30- 50 phút nhiệt độ phòng - Tiến hành phân tích HPLC: GVHD: Page 21 KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN + Điều kiện phân tích Cột sắc ký: cột Nucleosil 250 x 3mm 100-5 C18 AB Chương trình pha động Thời gian Dung dịch H3PO4 0,02M Bắt đầu 20p 25p 39p 40p 50p 51p 58p 60 60 50 50 45 45 60 60 Hỗn hợp dung dịch methanol acetonotri ( tỷ lệ 1:1) 40 40 50 50 55 55 40 40 Tốc độ dòng: 0,6ml/ phút Thể tích tiêm: 10ml Bước sóng kích thích: l= 405nm Bước sóng phát xạ: l= 495nm + Ổn định cột sắc ký 30 phút chế độ làm việc + Tiêm dung dịch chuẩn tạo dẫn xuất huỳnh quang Dựng đường chuẩn tỷ số diện tích peak chuẩn sulfonmite/ diện tích peak chuẩn nội enrofloxacin nồng độ theo quan hệ tuyến tính bậc ( phương trình y= ax+ b) + Tiêm dịch mẫu trắng, dịch mẫu xác định độ thu hồi dịch mẫu thử tạo dẫn xuất huỳnh quang vào hệ thống HPLC, mẫu lần Xác định trị số diện tích peak sulfnamit/ sulfanilamit - Yêu cầu độ tin cậy phép phân tích: + Độ lặp lại lần tiêm: độ lệch chuẩn ( CVS) tính theo diện tích peak sắc ký lần tiêm dung dịch chuẩn phải nhỏ 0,5% + Độ thu hồi (R) : Độ thu hồi xác định cho lần chạy mẫu phải nằm khoảng 60- 70% - Tính kết quả: Hàm lượng enrofloxacin có mẫu tính theo công thức sau: M( mg/kg)= C(X).V/W Trong đó: M hàm lượng enrofloxacin có mẫu, tính theo mg/kg C nồng độ enrofloxacin thu được, tính theo mg/ml V thể tích cuối dung dịch mẫu thử, tính theo ml GVHD: Page 22 KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN W khối lượng mẫu thử TÀI LIỆU THAM KHẢO GVHD: Page 23 KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN [1] Lâm Thế Hải, Nguyễn Thị Ngọc Hoài (2013), Bài giảng Nguyên liệu thuỷ sản công nghệ sau thu hoạch, Khoa Thuỷ Sản, Trường Đại học Công Nghiệp Thực phẩm TP.HCM [2].https://vi.wikipedia.org/wiki/ELISA [3].http://impehcm.org.vn/noi-dung/sot-ret/kit-elisa-kit-diamed-elisa-mot-giai-phap-hotro-cho-ky-thuat-ifat-phat-hien-cac-khang-the-sot-ret.html [4].http://www.authorstream.com/Presentation/duynguyen796774-1732692-phan-tich-duluong-chat-khang-sinh-trong-thuc-pham/ [5]http://tailieu.tv/tai-lieu/phan-tich-du-luong-chat-khang-sinh-trong-thuc-pham-10964/ GVHD: Page 24 ... để tạo nên bánh lái trình di chuyển Tôm đất Tôm sú Tôm thẻ Bảng 1.Thành phần khối lượng số loài tôm (theo%) Loại tôm Tôm sú Tôm thẻ Tôm Tôm hùm Thịt tôm 59.07 60.00 57.36 36.57 Đầu 31.04 31.00... Lipid Page Tro Nước KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN Tôm He Tôm Sú Tôm Thẻ Tôm Chì Tôm Rảo Tôm Sắc Tôm Càng Tôm Hùm 20.00 21.00 19.27 18.97 20.05 19.05 18.97 20.81 0.70 1.07 0.92... Enrofloxacin tôm/ sản phẩm tôm GVHD: Page KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THUỶ SẢN 1.Đặc điểm nguyên liệu tôm 1.1.Cấu tạo chung tôm Tôm gồm hai phần, phần trước đầu ngực, phần sau thân Đầu tôm