PHÂN TÍCH PROTIDE ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG MÔN KIỂM NGHIỆM CÁC SẢN PHẨM SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH PROTIDE GVHD: Hoàng Xuân Thế SVTH: Nguyễn Thị Tiết Mến Phong 2208152004 Trần Bảo 2208150009 Nguyễn Phạm Thúy Trinh Lê Tường Vi 2208150018 2208150022 PROTIT THÔ • Protit chất hữu mà thành phần cấu tạo gồm C,H,O N, có có thêm P S • Protit bao gồm axit amin hợp chất (petit, protein) thủy phân cho nhiều loại axit amin PROTIT THÔ Phương pháp Kendan (Kjeldahl): Xác định hàm lượng Nitơ tổng Nguyên lý: • Vô hóa thực phẩm H2SO4 đậm đặc chất xúc tác Dùng kiềm mạnh (NaOH KOH) đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành thể tự Định lượng NH3 axit • Xác định phương pháp Kjendanl máy cất đạm Pacnat Vacne (Panazz- Wagner) • Xác định hàm lượng nitơ toàn phần xác định hàm lượng N tất hợp chất có chứa nitơ PROTIT THÔ  Lấy mẫu: Tùy hàm lượng protein có thực phẩm tùy theo dạng sản phẩm cách lấy mẫu sau: • Sản phẩm khô Hàm lượng protein nhiều: cân 0,3 – 0,5g mẫu cân phân tích Hàm lượng protein ít: cân – 2g mẫu cân phân tích Sản phẩm khô sau cân gói vào giấy lọc không tro, cho vào bình hút ẩm • Sản phẩm ướt Tùy mẫu có hay nhiều protein mà cân lượng mẫu, thường cân 1g vào cốc Chuyển mẫu vào bình Kiendan, cho nước cất tráng cốc cho vào bình Kiendan (dùng nước tốt) • Sản phẩm lỏng (nước mắm, nước chấm…) Dùng pipet lấy xác - ml mẫu cho vào bình Kiendan PROTIT THÔ  Vô hóa mẫu - Thêm vào bình Kiendan chứa mẫu 1g K2SO4, 2g CuSO4, 3ml H2SO4 đậm đặc, dùng nước tráng cổ bình, đặt miệng phễu lên miệng bình Kiendan, cặp bình Kiendan vào giá, đáy bình đặt nghiêng góc 450 đặt bếp điện hay đèn cồn - Đun nhẹ, sau vài phút chuyển sang đun mạnh toàn dung dịch bình Kiendan có màu xanh sunfat đồng hay xanh vàng ngừng - Để nguội bình đến nhiệt độ phòng, chuyển sang bình định mức 100 ml, tráng bình Kiendan nước cất thêm nước cất đến vạch định mức, lắc PROTIT THÔ Cất mẫu Tiến hành máy cất đạm - Đun xong, để nguội lắp bình Kiendan vào máy cất đạm - Hút 20ml H2SO4 0,1N cho vào bình tam giác 250ml, – 10 ml nước cất 2-3 giọt thị fenolftalein đặt bình vào đầu sinh hàn máy cất đạm, cho đầu ống sinh hàn phải nhúng ngập vào dung dịch bình tam giác - Dùng pipet lấy 10ml dung dịch bình định mức cho vào bầu cất c máy cất đạm, thêm vào 10 – 15 ml NaOH 30% (nhỏ vào giọt chất thị fenolftalein 0,1% cho từ từ NaOH 30% qua phễu vào bình cất, dung dịch bình cất chưa chuyển qua màu hồng cho thêm NaOH đến xuất màu hồng đậm), nút kín - Cho nước cất vào khoảng 2/3 thể tích bình cầu a, mở nước làm lạnh chảy vào ống làm lạnh - Đun sôi dung dịch bình cầu khoảng 20 – 25 phút, dùng giấy quỳ thử nước ngưng thoát không phản ứng kiềm Cất xong dùng bình tia rửa acid bám ống ngưng nhúng bình tam giác Chuẩn độ: Chuẩn độ lượng H2SO4 0,1N dư bình tam giác NaOH 0,1N đến dung dịch bình tam giác chuyển sang màu hồng Cất mẫu trắng: Cất mẫu trắng với lượng thuốc thử thao tác thay 100ml dung dịch bình định mức 10ml nước cất PROTIT THÔ  Tính kết  Video Phương pháp Kendan (Kjeldahl): Xác định hàm lượng Nitơ tổng https://www.youtube.com/watch?v=wmhmAESv72E&t=86s PROTEIN A- PHƯƠNG PHÁP THƯỜNG ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN Phương pháp Stutzer – Barnstein Nguyên tắc: • Chiết protein từ thực phẩm nước Kết tủa protein dịch chiết CuSO4 Tách kết tủa, rửa định lượng nitơ toàn phần kết tủa phương pháp Kendan Phương pháp dùng axit tricoaxetic Nguyên tắc: • Chiết protein từ thực phẩm nước Kết tủa protein dịch chiết axit tricoaxetic Tách kết tủa, rửa định lượng nitơ toàn phần kết tủa phương pháp Kendan A- PHƯƠNG PHÁP THƯỜNG ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN Phương pháp sử dụng tananh Nguyên tắc: • Chiết protein từ thực phẩm nước Kết tủa protein dịch chiết tananh Tách kết tủa, rửa định lượng nitơ toàn phần kết tủa phương pháp Kendan Phương pháp sử dụng natri sunfat cồn môi trường axit Nguyên tắc: • Kết tủa protein dung dịch natri sunfat bão hòa cồn 78o môi trường axit Định lượng phần nitơ phi protein dịch lọc phương pháp Ken-dan • Nitơ protein= Nitơ toàn phần – Nitơ phi protein Tiến hành thử  Chuẩn độ dung dịch natri thiosunfat 0,01M dung dịch có màu vàng nhạt Thêm - giọt dung dịch tinh bột 1%, dung dịch có màu xanh Chuẩn độ tiếp dung dịch vừa màu Ghi lượng dung dịch natri thiosun-fat 0,01M dùng để chuẩn độ  Tiến hành xác định mẫu trắng với tất lượng hóa chất bước thí nghiệm trên, thay dịch mẫu thử nước cất Kết Hàm lượng nitơ axit amin (X11) tính g/l, theo công thức: Trong đó:  V1 – Thể tích dung dịch Na2S2O3 0,01M tiêu tốn chuẩn độ mẫu thử, tính ml;  V2 – Thể tích dung dịch Na2S2O3 0,01M tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng, tính ml;  – Thể tích mẫu thử pha loãng 20 lần, tính ml  25 - Thể tích toàn hỗn hợp dịch trước lọc, tính ml;  10 – Thể tích dung dịch lọc lấy xác định, tính ml;  0,00028 – Số g nitơ axit amin tương ứng với 1ml dung dịch Na2S2O3 0,01M;  1000 – Hệ số tính g/l;  Chú thích:  Để nhận kết xác, cần loại bỏ hoàn toàn đồng phốtphat thừa, cách lọc thật cẩn thận hỗn hợp dịch mẫu thử cho nhận dịch suốt  Video số phương pháp định lượng acid amin https://www.youtube.com/watch?v=wmhmAESv72E&t=86s AXIT AMIN ĐỊNH LƯỢNG CÁC AXIT AMIN BẰNG SẮC KÍ TRÊN GIẤY Tách protein khỏi thức ăn Gồm ba giai đoạn:  Lựa chọn nguyên liệu: - Nên chọn nguyên liệu thời vụ gần nhất, làm khô nhiệt độ thường - Tránh lấy nguyên liệu để lâu làm khô nhiệt độ cao  Chuẩn bị nguyên liệu: - Cân từ 100g – 500g nguyên liệu khô ( tùy theo hàm lượng protein) Xay nghiền nhỏ thành bột, loại chất béo sắc tố benzen hau ete dầu hỏa phương pháp soxhlet - Nguyên tắc: Dựa vào tính tan hoàn toàn chất béo vào dung môi hữu Dùng dung môi hữu trích ly chất béo có sản phẩm thực phẩm Sau làm bay hết dung môi, chất béo lại đem cân, tính hàm lượng chất béo có sản phẩm thực phẩm - Lọc qua giấy lọc, tráng rửa bột dung môi Trải bột để khô không khí - Xay nghiền nhỏ lại, bảo quản kín tiến hành tách protein  Tách protein khỏi nguyên liệu: - Tùy theo nguyên liệu tính chất protein, cách tách protein có khác AXIT AMIN ĐỊNH LƯỢNG CÁC AXIT AMIN BẰNG SẮC KÍ TRÊN GIẤY Thủy phân protein thành axit amin tự Cho vào bình định mức khoảng 30ml nước cất, cho từ từ HCl đậm đặc, vừa cho vừa lắc Để nguội, cho thêm nước cất vừa đủ 1000ml Lắc Dung dịch axeton + HCl (Axeton 100ml+ HCl đậm đặc 1ml) Dung dịch rượu izopropylic 10% (Rượu izopropylic10ml+ Nước cất vừa đủ 100ml)  Tiến hành thủy phân: Cho vào ống nghiệm + Protein khô 100g + HCl 6N Hàn kín ống nghiệm: Chú ý không để dịch thủy phân đầy ống Đun cách dầu 1250C để vào tủ sấy 1250C 24h Loại HCl cách cất chân không tới cặn khô Hòa cặn bình định mức 10ml với dung dịch rượu izopropylic 10% vừa đủ 10ml Ly tâm, lấy phần trên, giữ tủ lạnh 1-2 tuần AMONIAC I Phương pháp định lượng hàm lượng amoniac Phương pháp định lượng focmôn Nguyên tắc: ammoniac thực phẩm dạng tự hay muối amoni, gặp focmôn xảy phản ứng: 4NH4Cl + 6HCHO => (CH2)6N4 + 6H2O + 4HCl Nếu dung dịch muối amoni trung tính dung dịch focmôn trung tính HCl hình thành hoàn toàn từ muối amoni Từ số lượng NaOH dùng để định lượng HCl để tính hàm lượng nitơ amoni Phương pháp định lượng focmôn + Nếu sản phẩm có muối amoni tác dụng với Foocmon tạo thành acid: 4NH4Cl + 6HCHO → 4HCl + (CH2)6N4 + 6H2O Acid tạo thành tác dụng với kiềm chuẩn độ Để kết thúc trình chuẩn độ, người ta chọn chất thị Tùy thuộc vào chất thị ta có phương pháp Sorensen hay phương pháp thị hỗn hợp Phương pháp định lượng focmôn  Sản phẩm đặc: nghiền nhuyễn, cân xác 3-5g mẫu cho vào bình định mức dung tích 100ml, thêm 50ml nước cất, lắc mạnh cho tan hết, thêm nước cất đến vạch định mức, lắc đều, để yên 10 phút, lọc qua giấy lọc  Sản phẩm lỏng: dùng pipet lấy xác 10ml cho vào bình định mức 100ml, cho nước cất đến vạch định mức  Trung hòa mẫu Dùng pipet lấy xác 20ml dung dịch mẫu cho vào bình nón dung tích 250ml, cho tiếp ml phenolphtalein 0,5%, 20ml nước cất, trung hòa dung dịch với NaOH 0,1N mẫu có tính axit đến màu hồng nhạt trung hòa dung dịch mẫu với HCl 0,1N mẫu có tính bazơ đến không màu lấy lại màu hồng nhạt vài giọt NaOH 0,1N Phương pháp định lượng focmôn Chuẩn độ: theo giai đoạn: - Giai đoạn 1: chuẩn độ dung dịch trung hòa NaOH 0,1N từ màu hồng nhạt sang màu hồng - Giai đoạn 2: tiếp tục chuẩn độ dung dịch NaOH 0,2N từ màu hồng nhạt sang màu đỏ thắm (pH = 9,1) - Giai đoạn 3: cho 10ml foocmon trung tính dung dịch màu, tiếp tục chuẩn độ dung dịch NaOH 0,2N đến có màu hồng nhạt (pH = 8,3) - Giai đoạn 4:tiếp tục chuẩn độ dung dịch NaOH 0,2N từ màu hồng sang màu đỏ thắm (giống màu tiêu chuẩn) (pH = 9,6) Phương pháp định lượng focmôn Phương pháp định lượng cách cất kéo nước  Nguyên tắc: Đẩy muối amoni thể tự chất kiềm mạnh amoniac không mạnh (như Mg(OH)2 hay Na2CO3) để tránh ảnh hưởng thực phẩm Dùng nước kéo amoniac giải phóng thể tự sang bình chuẩn độ định lượng H2SO4 0,1N với alizarin natri sunfonat làm thị màu 2NH4Cl + Mg(OH)2 => 2NH3 + 2H2O + MgCl2 2NH3 + H2SO4 => (NH4)2SO4 Phương pháp định lượng so màu  Nguyên tắc: đẩy ammoniac thể tự MgO, cất kéo nước định lượng ammoniac với thuốc thử Nessler, so màu vàng hình thành với thang mẫu quang sắc kế II TIÊU CHUẨN VIỆT NAM (TCVN_3076_90): THỦY SẢN - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ AMONIAC Nguyên tắc chung : Dùng kiềm nhẹ đẩy amoniac khỏi mẫu thử, chưng cất vào dung dịch axit sunfuric Dựa vào lượng axit dư chuẩn độ dung dịch natri hydroxyt 0,1N để tính hàm lượng amoniac  Cách tiến hành Cân 10 – 15g mẫu vào bình định mức dung tích 250ml Thêm nước cất đến 200ml lắc phút, để yên phút, lặp lại lần Thêm nước cất đến vạch mức, lắc sau lọc Lấy 200ml dung dịch axit sunfuric 0,1N vào bình 250ml giọt thị hỗn hợp Đặt bình vào đầu ống sinh hàn máy cất đạm cho đầu ống sinh hàn ngập hẳn vào dung dịch Dùng pipet lấy 50ml dịch lọc mẫu thử cho vào bình cất máy cất đạm Thêm 20ml nước cất, giọt phenolphlatein 1% cho dung dịch magie oxyt 5% vào dung dịch bình xuất màu hồng Cho nước lạnh chảy qua ống sinh hàn cất liên tục 30 phút Hạ bình hứng để ống sinh hàn lên khỏi mặt nước Sau hứng nước ngưng chảy đầu ống sinh hàn, thử giấy pH, phản ứng kiềm Dùng natri hydroxyt 0,1N chuẩn độ lượng axit dư bình hứng dung dịch chuyển từ màu tím sang xanh mạ ... sau: • Sản phẩm khô Hàm lượng protein nhiều: cân 0,3 – 0,5g mẫu cân phân tích Hàm lượng protein ít: cân – 2g mẫu cân phân tích Sản phẩm khô sau cân gói vào giấy lọc không tro, cho vào bình hút... Trong đó:  V1 – Thể tích dung dịch Na2S2O3 0,01M tiêu tốn chuẩn độ mẫu thử, tính ml;  V2 – Thể tích dung dịch Na2S2O3 0,01M tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng, tính ml;  – Thể tích mẫu thử pha loãng... trắng, tính ml;  – Thể tích mẫu thử pha loãng 20 lần, tính ml  25 - Thể tích toàn hỗn hợp dịch trước lọc, tính ml;  10 – Thể tích dung dịch lọc lấy xác định, tính ml;  0,00028 – Số g nitơ axit