Sac ky long HNC

MỤC LỤC PHẦN I : CƠ SỞ LÝ THUYẾT I.1 Khái niệm I.2 Phân loại sắc ký : I.3 Đặc điểm ứng dụng loại: I.4 Các trình tách cột sắc ký X(MP) + SP = X(SP) + MP I.5 Các đại lượng đặc trưng HPLC .9 I.6 Cơ chế tách phương pháp HPLC: 14 PHẦN II: HỆ THỐNG HPLC 14 II.1 Bình chứa dung môi giải ly cột 15 II.2 Bộ khử khí (Degasse ) 17 II.3 Bơm cao áp : .17 II.4 Bộ phận tiêm mẫu ( injection) 18 II.5 Cột sắc ký : 19 II.6 Detector ( đầu dò) .20 II.6.1 Đầu dò hấp thu tia tử ngoại (UV (Ultraviolet detector) .22 II.6.2 Đầu dò mạng diod quang (Photodiode array spectrophotometer) 22 II.6.3 Đầu dò phát huỳnh quang (Fluorescence detector) 23 II.6.4 Đầu dò số khúc xạ (Refractive index detector) 23 II.6.5 Đầu dò đo độ dẫn điện ( Conductivity detector) 23 II.6.6 Đầu dò ampe kế (Amperometric detector) 23 II.6.7 Đầu dò LC – IR 23 II.6.8 Đầu dò LC – MS 23 II.7 Bộ phận ghi tín hiệu 24 II.8 In kết quả: 25 Phần III : CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 25 III.1 Pha tĩnh .25 III.1.1 Các yêu cầu pha tĩnh sử dụng HPLC 25 III.1.2 Các nguyên liệu sử dụng làm pha tĩnh 25 III.1.3 Các loại pha tĩnh HPLC .26 III.2 Pha động 29 III.3.1 Vai trò ảnh hưởng pha động: 29 III.3.2 Các yêu cầu pha động sử dụng HPLC 30 III.3.3 Các loại pha động: .31 III.3 Một số yếu tố khác ảnh hưởng đến trình sắc kí 32 III.3.1 Ảnh hưởng cấu trúc mẫu phân tích .32 III.3.2 Ảnh hưởng thể tích nạp mẫu 33 III.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ .33 PHẦN IV : TIẾN HÀNH SẮC KÍ 34 IV.1 Các cách tiến hành sắc kí 34 IV.1.1 Phương pháp tiền lưu 34 IV.1.2 Phương pháp rửa giải 35 IV.1.3 Phương pháp rửa đẩy 35 IV.2 Chuẩn bị máy 36 IV.3 Chuẩn bị pha động 36 IV.4 Chuẩn bị mẫu 37 PHẦN V : CÁC LĨNH VỰC ỨNG DỤNG 41 V.1 Phân tích hàm lượng kháng sinh nhóm tetracyclin thủy sản sắc kí lỏng hiệu cao 41 V.1.1 Phạm vi áp dụng 41 V.1.2 Phương pháp tham chiếu 42 V.1.3 Nguyên tắc 42 V.1.4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn dung dịch thử 42 V.1.5 Phương pháp tiến hành 44 V.1.6 Tính kết 46 V.2 Xác định hàm lượng Vitamin C mẫu ớt sắc ký lỏng hiệu cao 48 V.3.1 Thiết bị, dụng cụ 48 V.3.2 Hoá chất .48 V.3.3 Dung dịch chuẩn dung dịch thử 49 V.3.4 Chuẩn bị mẫu 49 V.3.5 Tiến hành phân tích HPLC 49 V.3.6 Tính Kết Quả 50 V.3 Xác định hàm lượng độc tố aflatoxin (B1, B2, G1, G2) thủy sản sản phẩm thủy sản HPLC 51 V.3.1 Thiết bị, dụng cụ 51 V.3.2 Hóa chất .52 V.3.3 Dung dịch chuẩn dung dịch thử .52 V.3.4 Phương pháp tiến hành 53 V.3.5 Tính kết 55 PHẦN I : CƠ SỞ LÝ THUYẾT HPLC chữ viết tắt 04 chữ đầu tiếng Anh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ( High Performance Liquid Chromatography), trước gọi phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp đời từ năm 1967-1968 sở phát triển cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện phương pháp HPLC ngày phát triển đại hoá cao nhờ phát triển nhanh chóng ngành chế tạo máy phân tích Hiện áp dụng lớn nhiều ngành kiểm nghiệm đặc biệt ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm Thuốc Và công cụ đắc lực phân tích thuốc đa thành phần cho phép định tính định lượng I.1 Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu cao phương pháp chia tách pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn ,hay chất mang biến đổi liên kết hoá học với nhóm chức hữu Quá trình sắc ký lỏng dựa chế hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử) I.2 Phân loại sắc ký : Trong HPLC, tùy chất qúa trình sắc ký pha tĩnh (SP) cột tách mà người ta chia thành: I.2.1 Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC) I.2.2 Sắc ký hấp phụ, có loại: + Pha thường (Normal phase: NP-HPLC), + Pha ngược hay pha đảo (Reverse phase: RP- HPLC), I.2.3 Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) cặp ion (IP-HPLC) I.2.4 Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC) - Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) ứng dụng nhiều phân tích hợp chất từ không phân cực đến hợp chất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không lớn (1000 đv.C) + Trong lĩnh vực Polime I.4 Các trình tách cột sắc ký I.4.1 Sự tương tác Xi -SP-MP cột tách - Nếu gọi : Chất phân tích : Xi, Pha tĩnh: SP, Pha động: MP Khi chạy sắc ký, trình hấp phụ giải hấp liên tục xẩy ra, từ lúc nạp chất mẫu vào lúc chất khỏi cột sắc ký, cột tách luôn có tương tác: + Tương tác pha tĩnh (SP) với chất phân tích (Xi), có lực F1 + Tương tác pha động (MP) với chất phân tích (Xi), có lực F2 + Tương tác pha động (MP) với pha tĩnh (SP), có lực F3 - Chúng ta mô hình sau : - Trong tương tác : + F3 không đổi (trong hệ pha) + F1 F2 ngược chiều + F1 giữ chất phân tích Xi lại pha tĩnh (SP) + F2 kéo chất phân tích Xi vào pha động (MP) Như lực lưu giữ chất trình sắc ký tổng đại số lực tương tác đó, nghĩa ta có : F = ( F1 + F + F ) Do hỗn hợp mẫu, chất phân tích nào: + Có lực F nhỏ khỏi cột tách trước tiên + Có lực F lớn sau Vì mà tạo trình sắc ký tách chất + Những chất có F nhau, hay gần không tách khỏi nhau, chúng trùng nhau, hay chen lấn I.4.2 Các cân động học cột tách - Quá tình sắc ký cột tách cân động học Có dạng chung: Kn X(MP) + SP = X(SP) + MP Kt Trong đó: + Kt: Hấp phụ chất X lên SP + Kn : giải hấp chất X vào MP + X(MP) X(SP) : Biểu thị chất X MP SP - Cân động học phân bố chất cột sắc ký : + Theo quy luật phân bố nhiệt động học Lang-Mua + Xảy liên tục + Chất Xi bị hấp phụ vào pha SP, lại bị rửa giải vào MP + Làm chất Xi có hàng ngàn lần bị SP hấp phụ, bị MP rửa giải + Cứ diễn biến từ đầu cột đến cuối cột tách + Cuối chất Xi chảy khỏi cột tách - Cân phân bố có dạng: + Dạng tuyến tính, nồng độ chất Xi nhỏ (hình 1) dạng cho: * Pic sắc ký cân đối, không doãng chân *Hiệu tách cao (tức H nhỏ) + Dạng không tuyến tính, nồng độ chất lớn (hình 1b và 1c) Dạng này: * Pic sắc ký không cân đối, pic sắc ký doãng chân * Hiệu tách nhỏ (tức H lớn) Trường hợp có kiểu: - Phân bố lồi, chân pic SK doãng phía trước (hình 1c) - Phân bố lõm, chân pic sắc ký doãng phía sau (hình 1b) Như trình tách tốt : Hỗn hợp mẫu có chất, thu sắc đồ có nhiêu píc sắc ký riêng biệt (hình ví dụ tách không tách chất) - Các cân tương tác cột tách là: Có loại Cân động học tương tác: + Tương tác hấp phụ (Rắn-Lỏng), là: Hấp phụ pha thường (NP), Hấp phụ pha ngược (RP) + Tương tác tĩnh điện (tương tác ĐL Cu-Lông), + Tương tác phân bố Lỏng-Lỏng (Sắc ký chiết) (a) (b) (c) Hình 1.Quy luật phân bố chất và pic sắc ký Hình 2: Sơ đồ tách sắc ký chất Loại Tương tác hấp phụ (NP- & RP-HPLC), gồm có: + Sự hấp phụ: + Sự rửa giải: (SP) + Xi (SP).Xi + (MP) = (SP).Xi = (MP).Xi + (SP) Loại : Tương tác tĩnh điện ion (IE- IPE-HPLC) Gồm có: - Trao đổi ion (IE -HPLC): (SP)-Na + Xi+ + Trao đổi: = (SP)-Xi + Na+ + Rửa giải: (SP)-Xi + (MP)-H = (SP)-H + (MP)-Xi - Trao đổi kiểu cặp ion (IPEx-HPLC): + Tạo cặp: (SP) + R-SO3Na = (SP).R-SO3Na + Trao đổi: (SP).R-SO3Na + Xi+ = (SP).R-SO3-Xi + Na+ + Rửa giải: (SP).R-SO3Xi +(MP)-H = (SP).R-SO3Na + (MP)-Xi Trong đó: -SO3Na : Chất tạo cặp, ví dụ: SDS (Na-Dodecyl-SO3) Loại Tương tác chiết Lỏng-Lỏng (L-LP-HPLC) + Phân bố vào SP: Xi + (SP) = (SP).Xi + Phân bố vào MP: Xi + (MP) = (MP).Xi + Và chúng có CB: (SP).Xi = (MP).Xi có Kpb Loại Tương tác theo độ lớn Phân tử (GEL-HPLC) Là tương tác hấp phụ vào lỗ xốp hạt SP, theo theo độ lớn chất Xi sau + Sự hấp phụ: + Sự rửa giải: (SP) + Xi (SP).Xi + (MP) = (SP).Xi = (MP).Xi + (SP) Của trình rây phân tử chất phân tích Xi I.5 Các đại lượng đặc trưng HPLC I.5.1 Các phương trình lưu giữ - Thời gian lưu giữ : Các chất tan hỗn hợp mẫu phân tích, nạp vào cột sắc ký , chúng bị lưu giữ cột tách (trên pha tĩnh) theo thời gian định Đó thời gian lưu hệ cột cho Thời gian tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký lúc chất tan rữa giải khỏi cột điểm có nồng độ cực đại Như vậy, gọi t Ri thời gian lưu tổng cộng chất tan i có : Trong đó: t0 : thời gian chất lực với pha tĩnh qua cột; thời gian pha động từ đầu cột đến cuối cột gọi thời gian lưu chế t’Ri : thời gian lưu giữ thực chất i cột sắc ký Nếu hai chất A B sắc đồ có : α = ( t’B / t’A ) α gọi thời gian lưu tương đối hai chất A B, hay hệ số tách hai chất Đại lượng α lớn tách hai chất A B rõ ràng Còn đại lượng 1, tách sắc ký hai chất A B, lúc hai chất A B nằm pic sắc ký Còn α gần 1, pic sắc ký hai chất A B có chung vùng Nghĩa chúng chập tách thành hai pic riêng biệt đặc trưng cho hai chất - Thể tích lưu : thể tích lưu chất thể tích pha động chảy qua cột sắc ký khoảng thời gian kể từ lúc mẫu bơm vào cột chất tan rửa giải thời điểm có nồng độ cực đại; nghĩa tương đương với thời gian lưu t’ Ri Nếu chất tan không bị lưu giữ cột tách thể tích lưu thể tích V m pha động chảy qua cột Như vậy, gọi F (ml/pH) tốc độ pha động bơm qua cột sắc ký, có: VRo = Vm = tRo F VRi = F tRi Hay VRi = VRo ( + K’i) Mặt khác ta có : ( Vs + Vm ) = V0 10  Ethylenđiamintetraaxetic (viết tắt EDTA) ngậm phân tử nước tinh khiết, loại dùng cho phân tích  Axít oxalic ngậm phân tử nước, tinh khiết, loại dùng cho phân tích  Metanol loại dùng cho HPLC  Acetonitril loại dùng cho HPLC c) Dung dịch chuẩn dung dịch thử  Dung dịch đệm McIlvaine (pH 4,0) gồm: - Dung dịch A: hoà tan 28,4 g Na2HPO4 khan nước cất bình định mức dung tích 000 ml Ðịnh mức tới vạch - Dung dịch B: hoà tan 21,0 g axít citric nước cất bình định mức Ðịnh mức tới vạch Cho từ từ 625 ml dung dịch A vào 000 ml dung dịch B Chỉnh pH tới 4,0 (+/0,05) cách cho giọt dung dịch HCl nồng độ 0,1M dung dịch NaOH nồng độ 0,1M (sử dụng pH kế để xác định pH) Chú ý: Dung dịch bền vòng tuần nhiệt độ phòng  Dung dịch đệm McIlvaine – EDTA Hoà tan 60,5 g EDTA vào 1625 ml dung dịch đệm McIlvaine Chú ý: Dung dịch bền vòng tuần nhiệt độ phòng  Dung dịch axit oxalic-metanol: hoà tan 1,26 g axít oxalic metanol bình định mức 1000 ml Ðịnh mức tới vạch Chú ý: Dung dịch chiết không bền, pha trước sử dụng  Pha động cho HPLC: hoà tan 1,26 g axít oxalíc nước cất bình định mức 1000 ml Ðịnh mức tới vạch Thêm vào dung dịch 500 ml axetonitril 166 ml metanol Lọc đuổi khí Chú ý: Dung dịch pha động không bền, pha trước sử dụng  Dung dịch chuẩn gốc 1000 μg/ml: cân 108 mg loại kháng sinh chuẩn (TC, OTC CTC) loại có giấy chứng nhận hàm lượng (lượng cân điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh ghi giấy chứng nhận) vào bình định mức dung tích 100 ml riêng biệt Hòa tan định mức tới vạch 100 ml metanol Chú ý: Bảo quản dung dịch nhiệt độ -20 0C Dung dịch bền vòng tháng 43  Dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 μg/ml: hút xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 100 ml Ðịnh mức tới vạch metanol  Dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 μg/ml: hút xác 2,5 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 μg/ml vào bình định mức 10 ml Ðịnh mức tới vạch metanol Chú thích: Bảo quản dung dịch tủ lạnh nhiệt độ từ đến 5oC Dung dịch bền vòng tuần  Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,05; 0,10; 0,25; 0,50 1,00μg/ml: hút xác 20, 40, 100, 200, 400 μl dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 μg/ml vào bình định mức 10 ml Thêm ml dung dịch axít oxalic-metanol vào bình Ðịnh mức tới vạch nước cất Chú ý: Bảo quản dung dịch tủ lạnh nhiệt độ từ đến oC Dung dịch bền vòng tuần V.1.5 Phương pháp tiến hành a) Chuẩn bị mẫu thử  Cân 5,00 g mẫu (m) băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh thứ Thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA vào ống nghiền 30 giây máy nghiền đồng thể Sau đó, ly tâm ống máy ly tâm 10 phút tốc độ 3000 vòng/phút  Gạn dịch ống thứ vào ống ly tâm thủy tinh thứ Cho thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ Trộn đều, ly tâm ống 10 phút tốc độ 000 vòng/phút lại gạn dịch vào ống ly tâm thủy tinh thứ  Cho thêm 10 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ Trộn ly tâm ống 10 phút tốc độ 000 vòng/phút Tiếp tục gạn dịch vào ống ly tâm thủy tinh thứ  Ly tâm ống thủy tinh thứ 20 phút tốc độ 000 vòng/phút Sau đó, lọc dịch qua giấy lọc phễu Buch-ner Rửa ống ly tâm lần, lần rửa sử dụng ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA b) Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng định nghĩa mẫu thủy sản xác định kháng sinh thuộc nhóm TC Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị với mẫu thử 44 c) Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 100 μl dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 μg/ml vào 5,00 g mẫu trắng Ðồng mẫu máy nghiền đồng thể.Tiến hành chuẩn bị mẫu giống chuẩn bị với mẫu thử d) Làm dịch chiết Chuẩn bị cột Nối cột Sep - Pak C18 vào đầu xi lanh thủy tinh dung tích 100 ml Thêm 20 ml metanol, 20 ml nước cất vào xi lanh thủy tinh Loại bỏ dung dịch chảy qua cột Làm dịch chiết Cho dịch chiết ống ly tâm vào cột Sep - Pak chuẩn bị Tráng rửa bình chứa 2,0 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA Trong giai đoạn này, kháng sinh nhóm tetracyclin hấp phụ lên bề mặt hạt rắn chứa cột Chú ý: Không cột Sep - Pak khô hai giai đoạn chuẩn bị cột làm dịch chiết Ðiều chỉnh cho dịch chảy khỏi cột giọt  Cho 20 ml nước cất vào xi lanh thủy tinh cho chảy qua cột Loại bỏ dịch chảy khỏi cột Làm khô cột dòng không khí phút  Giải hấp kháng sinh nhóm tetracyclin cách cho 6,0 ml dung dịch axít oxalic-metanol chảy qua cột với tốc độ 1,5 ml/phút Thu dịch khỏi cột vào bình định mức 10 ml Ðịnh mức tới vạch (thể tích V) nước cất Tiến hành phân tích dịch thu HPLC e) Chạy máy  Ðiều kiện phân tích a Cột sắc ký : Cột pha đảo C8, L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt μm b Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng c Pha động: Hỗn hợp dung dịch axit oxalic-metanol-axetonitrile d Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút đ Bước sóng cài đặt cho đầu dò UV 350 nm e Thể tích tiêm: 60 μl  Ổn định cột sắc ký 30 phút pha động 45  Tiêm dung dịch chuẩn vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao Mỗi dung dịch tiêm lần, tính chiều cao pic trung bình Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ chiều cao pic thu nồng độ (μg/ml) loại kháng sinh theo quan hệ tuyến tính bậc (phương trình y = ax + b)  Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC Mỗi dung dịch mẫu tiêm lần Tính giá trị trung bình Chú ý: Sau phân tích xong, làm hệ thống HPLC (bao gồm cột sắc ký) hỗn hợp: nước cất - metanol - axetonitrile theo tỷ lệ thể tích 7-1-2 30 phút f) Yêu cầu độ tin cậy phép phân tích  Ðộ lặp lại lần tiêm Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo chiều cao pic sắc ký lần tiêm dung dịch chuẩn phải nhỏ 0,5 %  Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi xác định cho lần chạy mẫu phải lớn 80 %  Ðường chuẩn kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn 0,995  Ðối với mẫu chứa 0,5 μg/g kháng sinh nhóm TC, phải kiểm tra xác nhận kết cách tiêm lại dịch chiết mẫu dung dịch chuẩn cột C18 chạy chế độ cột C8 so sánh thời gian lưu píc mẫu píc chuẩn V.1.6 Tính kết Hàm lượng kháng sinh có mẫu tính sở đường chuẩn thu (5.5.3) Với đường chuẩn dạng y = ax + b, hàm lượng kháng sinh có mẫu tính theo công thức sau: C (μg/kg) = (Y-b)/a.F.1000 Trong đó: - C nồng độ kháng sinh có mẫu, tính theo μg/kg - Y hiệu số chiều cao pic dịch chiết chiều cao pic có mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị độ dài - a, b thông số đường chuẩn y = ax + b, 46 47 - F hệ số pha loãng mẫu có giá trị tỉ số thể tích dịch chiết thu sau làm V khối lượng mẫu m sử dụng V.2 X ác định hàm lượng Vitamin C mẫu ớt sắc ký lỏng hiệu cao V.3.1 Thiết bị, dụng cụ - Hệ thống máy HPLC với đầu dò UV - Cột RP-18e, kích thước cột LxID: 150x4.6mm, kích thước hạt µm - Cân phân Tích có độ xác 0.1 mg - Bình định mức 10ml - Pipet loại 0.1ml;0.5ml,1ml, 2ml, 5ml, 10ml,… - Ống Hatch - Dụng cụ thuỷ tinh loại : becher, erlen,… V.3.2 Hoá chất - Nước dùng cho HPLC - Metanol, HPLC - Acid phosphoric , tinh khiết phân tích 48 - Chuẩn Vitamin C V.3.3 Dung dịch chuẩn dung dịch thử - Dung dịch acid phosphoric pH = 3: lấy 900ml nước cất, chỉnh pH=3 acid phosphoric Lọc qua lọc dung môi đuổi hết bọt khí bể siêu âm - Dung dịch chuẩn gốc 1000µg/ml:cân 10mg (±0.1mg) vitaminC chuẩn vào bình định mức dung tích 10ml Hoà tan định mức tới vạch Metanol - Dung dịch chuẩn 10µg/ml : hút xác 0.1ml dung dịch chuẩn gốc 1000µg/ml vào bình định mức 10 ml Định mức tới vạch dung dịch pha động - Dung dịch chuẩn 0.5, 1, µg/ml hút xác 0.5,1,5 ml dung dịch chuẩn 10µg/ml vào bình định mức 10ml Định mức tới vạch dung dịch pha động V.3.4 Chuẩn bị mẫu  Mẫu thuốc: - Nghiền nhuyễn - Cân xác khoảng 10mg thuốc nghiền cho vào bình định mức 50ml, định mức H2O (pH3), Vorex phút Lọc (0.45µm) Pha loãng 50 lần dung dịch sau lọc tiến hành định lượng HPLC  Mẫu ớt: Cân khoảng 1.0g (±0.1g) mẫu thử đồng cho vào bình định mức 50ml Định mức H2O(pH 3), Vortex phút Dung dịch thu sau lọc qua giấy lọc 0.45 µm định lượng máy sắc ký lỏng hiệu cao V.3.5 Tiến hành phân tích HPLC  Điều kiện phân tích : - Cột sắc ký : cột pha đảo (3.1.2) - Pha động: Hỗn hợp (metanol: acid phosohoric pH3/5:95) - Tốc độ dòng : 0.7ml/phút - Bước sóng cài đặt cho đầu dò : 254nm  Tiêm dung dịch mẫu thử nghiệm theo thứ tự : - Các dung dịch chuẩn Dựng đường chuẩn nồng độ vitamin C diện tích chuẩn Vitamin C Tính toán hệ số tương quan hồi quy tuyến tính 49 - Các dung dịch mẫu thử nghiệm Tính hàm lượng Vitamin C dịch chiết (Co) thông qua đường chuẩn xây dựng bước  Đảm bảo chất lượng : Đường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quang hồi quy tuyến tính (R2) phải lớn 99 V.3.6 Tính Kết Quả Hàm lượng Vitamin C (mg/kg) có mẫu ớt tính theo công thức sau: C  C =  .Vdd f m Trong : - C hàm lượng Vitamin C có mẫu, tính theo mg/kg - C0: Hàm lượng Vitamin C Có dịch chiết ( Co) thông qua đường chuẩn( mg/l) - f: hệ số pha loãng (nếu có) - m: khối lượng mẫu thử (g) Hàm lượng Vitamin C có mẫu , tính theo mg  C V  C =  o dd .Vdd f  1000  - C : Hàm Lượng Vitamin C có mẫu , tính theo mg - Co: Hàm lượng Vitamin C Có dịch chiết ( Co) thông qua đường chuẩn, tính theo mg/l - f: hệ số pha loãng (nếu có) - m: khối lượng mẫu thử (g) - M: khối lượng ban đầu viên thuốc (mg) 50 V.3 Xác định hàm lượng độc tố aflatoxin (B1, B2, G1, G2) thủy sản sản phẩm thủy sản HPLC V.3.1 Thiết bị, dụng cụ  Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang  Cột sắc ký pha đảo LC18 kích thước L x ID 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt từ đến 10 [NAD1] µm  Màng lọc mao quản kích thước 0,4 µm  Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/ phút  Cân phân tích có độ xác 0,0001 g  Máy ly tâm tốc độ 000 vòng/phút  Bể siêu âm  Hệ thống cô quay chân không  Cột thủy tinh có khóa teflon, kích thước L x ID 500 x 20 mm 500 x mm 51  Ống ly tâm thủy tinh dung tích 250 ml  Bình cầu thủy tinh dung tích 100 ml 250 ml  Bình định mức dung tích ml 10 ml V.3.2 Hóa chất  Nước cất loại dùng cho HPLC  Metanol loại dùng cho HPLC  Clorofom loại dùng cho HPLC  Axetonitril loại dùng cho HPLC  n-hexan tinh khiết loại dùng cho phân tích  Ete etylic tinh khiết  Sulfat natri khan  Silicagel cỡ hạt từ 60 đến 200 mesh  Silicagel hoạt hóa: cân 50,0 g silicagel tinh khiết (4.2.8) để vào tủ sấy nhiệt độ 110oC Sau để nguội nhiệt độ phòng bình hút ẩm ngâm clorofom 15 phút trước nhồi cột V.3.3 Dung dịch chuẩn dung dịch thử - Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100,0 µg/l), B2 (nồng độ 20,0 µg/l), G1 (nồng độ 100 µg/l) G2 (nồng độ 20 µg/l) - Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp aflatoxin có nồng độ (như Ðiều 4.3.1) metanol từ ống chuẩn Tùy theo nồng độ aflatoxin có ống chuẩn, dùng bình định mức lượng metanol thích hợp - Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ B1 (10,0 µg/l), B2 (2,0 µg/l), G1 (10,0 µg/l) G2 (2,0 µg/l): hút xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào bình định mức 10 ml định mức tới vạch metanol - Dung dịch chuẩn: hút xác 0,0 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0 ml 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian vào bình định mức 10 ml định mức tới vạch metanol Các dung dịch chuẩn thu có nồng độ aflatoxin sau:  Chuẩn : B1 (0,0 µg/l), B2 (0,0 µg/l), G1 (0,0 µg/l), G2 (0,0 µg/l)  Chuẩn : B1 (1,0 µg/l), B2 (0,2 µg/l), G1 (1,0 µg/l), G2 (0,2 µg/l)  Chuẩn : B1 (2,0 µg/l), B2 (0,4 µg/l), G1 (2,0 µg/l), G2 (0,4 µg/l)  Chuẩn : B1 (4,0 µg/l), B2 (0,8 µg/l), G1 (4,0 µg/l), G2 (0,8 µg/l) 52  Chuẩn : B1 (8,0 µg/l), B2 (1,6 µg/l), G1 (8,0 µg/l), G2 (1,6 µg/l)  Chuẩn : B1 (10,0 µg/l), B2 (2,0 µg/l), G1 (10,0 µg/l), G2 (2,0 µg/l) - Dung dịch pha động: pha hỗn hợp dung môi axetonitril, metanol nước cất loại dùng cho HPLC theo tỉ lệ thể tích : : V.3.4 a Phương pháp tiến hành Chuẩn bị mẫu thử − Dùng cân phân tích (4.1.5) cân xác 50,0 g mẫu (m) băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.1.10) − Thêm 100,0 ml clorofom (4.2.3) vào ống trộn khoảng phút máy nghiền đồng thể (4.1.4) Sau đó, ly tâm ống máy ly tâm (4.1.6) khoảng phút tốc độ 000 vòng/phút Tiến hành lọc dịch chiết rửa phần bã clorofom cho tất dịch thu vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.1.11) b Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng định nghĩa mẫu thủy sản xác định aflatoxin Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị với mẫu thử c Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi - Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn vào 10,0 g mẫu trắng Ðồng mẫu máy nghiền đồng thể Tiến hành chuẩn bị mẫu giống chuẩn bị với mẫu thử Phải chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi đồng thời với chuẩn bị mẫu thử mẫu trắng d Làm dịch chiết − Chuẩn bị cột − Ðặt lớp thủy tinh vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon Ðóng khóa cho clorofom tới khoảng 2/3 cột thêm 5,0 g sulfat natri khan, 20,0g silicagel hoạt hóa, 15 g sulfat natri khan Chú thích: để tránh khô cột giữ mực clorofom cao lớp sulfat natri khan khoảng 1,5 cm − Làm dịch chiết  Cô dịch chiết thu hệ thống cô quay chân không khoảng 5,0 ml nhiệt độ 40 oC Dùng pipet chuyển dung dịch từ bình cầu vào cột làm chuẩn bị tráng rửa bình cầu clorofom Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy dung 53 dịch khỏi cột khoảng từ 1,0 đến 1,5 ml/phút Trong giai đoạn này, aflatoxin hấp phụ lên hạt silicagel  Thêm vào cột 50,0 ml n-hexan, 50,0 ml ete etylic Ðiều chỉnh tốc độ dung môi chảy qua cột 1,0 ml/phút Sau loại bỏ dịch chảy khỏi cột  Giải hấp aflatoxin khỏi cột làm 50,0 ml hỗn hợp clorofom metanol theo tỉ lệ thể tích 97: với tốc dộ 1,0 ml/phút Hứng dung dịch chảy khỏi cột vào bình cầu dung tích 100 ml Cô dịch thu hệ thống cô quay chân không nhiệt độ 40 o C khô hoàn toàn Hoà tan cặn 5,0 ml dung dịch pha động bình định mức ml Tiến hành phân tích hàm lượng aflatoxin HPLC  Tiến hành làm mẫu trắng mẫu để xác định độ thu hồi giống với mẫu thử e Tiến hành phân tích HPLC − Ðiều kiện phân tích:  Cột sắc ký : RP-LC 18, kích thước L x ID 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt - 10 [NAD2] µm  Nhiệt độ cột : 35oC  Pha động : Hỗn hợp gồm: axetonitril, metanol nước cất  Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút  Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang là: (kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm  Thể tích tiêm : 20 µl * Các bước: − Tiêm dung dịch chuẩn vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao Mỗi dung dịch tiêm lần, tính diện tích pic trung bình Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu nồng độ loại aflatoxin theo quan hệ tuyến tính bậc (phương trình y = ax + b) − Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC Mỗi dung dịch mẫu tiêm lần Tính giá trị trung bình f Yêu cầu độ tin cậy phép phân tích − Ðộ lặp lại lần tiêm 54 − Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo diện tích pic sắc ký lần tiêm dung dịch chuẩn phải nhỏ 0,5 % − Ðộ thu hồi (R) − Ðộ thu hồi xác định cách sử dụng 10 mẫu trắng cho vào lượng dung dịch aflatoxin chuẩn biết hàm lượng xác (5.3) Ðộ thu hồi tính phải nằm khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn 90 % − Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn 0,99 V.3.5 Tính kết Hàm lượng aflatoxin có mẫu tính sở đường chuẩn thu Với đường chuẩn dạng y = ax +b, hàm lượng aflatoxin có mẫu tính theo công thức sau: C (µg/kg) =[ (Y- b)/a]*F Trong đó: - C nồng độ aflatoxin có mẫu, tính theo µg/kg - Y hiệu số diện tích pic dịch chiết diện tích pic có mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích - a, b thông số đường chuẩn y = ax + b - F hệ số pha loãng mẫu có giá trị tỉ số thể tích dịch chiết thu sau làm V khối lượng mẫu m sử dụng 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phương pháp cô lập hợp chât hữu – Nguyễn Kim Phi Phụng – ĐHQGTPHCM Hóa phân tích tập – Phân tích dụng cụ - Nhà xuất y học http://www.youtube.com/watch?v=BYg2xcESAKs&feature=related http://www.bme.vn/bmevn/bme/trac-nghiem/huong-dan/96 http://kiemnghiemthucpham.blogspot.com/2011/01/28-tcn-177-2002-ham-luongthuoc-khang.html Tailieu.vn www.violet.com.vn Phân tích hóa lí – Hồ Viết Quý 56 57 ... Lỏng-Lỏng (Sắc ký chiết) (a) (b) (c) Hình 1.Quy luật phân bố chất và pic sắc ky Hình 2: Sơ đồ tách sắc ky chất Loại Tương tác hấp phụ (NP- & RP-HPLC), gồm có: + Sự hấp phụ: + Sự rửa... không tuyến tính, nồng độ chất lớn (hình 1b và 1c) Dạng này: * Pic sắc ký không cân đối, pic sắc ky doãng chân * Hiệu tách nhỏ (tức H lớn) Trường hợp có kiểu: - Phân bố lồi, chân pic SK doãng... sắc ký, trình hấp phụ giải hấp liên tục xẩy ra, từ lúc nạp chất mẫu vào lúc chất khỏi cột sắc ky , cột tách luôn có tương tác: + Tương tác pha tĩnh (SP) với chất phân tích (Xi), có lực F1 +