Chương V ÁP DỤNG RIBOZYM VÀ RNAi TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

Chương V ÁP DỤNG RIBOZYM VÀ RNAi TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ MỞ ĐẦU Ribozym phân tử acid ribonucleic (RNA) có khả tác động enzym vắng mặt hoàn toàn protein Chúng có hoạt tính xúc tác bẻ gẫy /hoặc hình thành liên kết cộng hóa trị với tính đặc hiệu gia tăng tốc độ phản ứng cách phi thường Khả RNA với tư cách chất xúc tác lần phát tự ghép nối intron nhóm I Tetrahymena với bán phần RNA RNase P Tiếp sau phát enzym RNA xúc tác qua trung gian RNA liên quan tới tự ghép nối intron nhóm II nấm men, nấm, ty thể thực vật (cũng lục lạp); RNA virusoid viroid thực vật chuỗi đơn; virus viêm gan delta; RNA vệ tinh từ ty thể Neurospora Khá rõ ràng cấu thành RNA tiểu đơn vị lớn ribosome có chức peptidyltransferase Với chức tiềm tàng thực thi ghép nối nhân nhỏ (spicesomal smaller nuclear snRNA) ribozym lại liên hợp với tiền RNA thông tin (pre-mRNA) để xúc tác cho ghép nối pre -RNA Cũng giống với motif xúc tác RNA bổ sung, vai trò xúc tác qua trung gian RNA phát nhiều sâu tìm hiểu hệ gen thể khác Ribozym hợp chất tự nhiên hay tổng hợp nhân tạo để nhắm vào trình tự đặc hiệu cis- trans- Phạm vi hoạt động hóa sinh in vitro nhằm lựa chọn protocol chưa phát triển Các ribozym thao tác cách dễ dàng để tác động lên chất Các RNA thiết kế theo đơn đặt hàng có tiềm lớn với tư cách tác nhân trị liệu trở thành công cụ mạnh nhà sinh học phân tử Các ribozym xúc tác đầu búa (hammerhead) cặp tóc (hairpin) đại diện cho lựa chọn phổ thông áp dụng trị liệu mô tả Hình 5.1 Hình 5.1 Các ribozym xúc tác hay dùng dạng đầu búa dạng cặp tóc Trên hình vẽ cấu trúc bậc hai ribozym hình đầu búa Trong đó: N = nucleotid bất kỳ, R = purin, Y = pyrimidin Sơ đồ cấu trúc bậc ribozym hình đầu búa vẽ cạnh mô hình cấu trúc bậc Các phận (stem) tương ứng I, II III cấu trúc thể Trong ribozym hình đầu búa H =A, C U vị trí phân cắt Trong ribozym hình cặp tóc H1, H2 vùng xoắn cấu trúc RNA (Theo Lisa Scherer John J Rossi (2005) Cancer Gene Therapy Human Press Totowwa, New Jersey) Sự gây nhiễu RNA (RNA interference) Sự gây nhiễu RNA (RNAi) chế làm yên lặng gen sáng tỏ cách cội nguồn thực vật, yên lặng gen sau phiên mã Caenorhabditis elegans ruồi giấm Drosophila Trong mô hình đương thời, đường RNAi hoạt hóa súng RNA sợi đôi (double-stranded RNA dsRNA), sau xử lý thành đoạn dsRNA ngắn từ 21 đến 22 nt ám RNA gây nhiễu nhỏ (small interfering RNA –siRNA) enzym tế bào có tên Dicer (Hình 5.2A) Các siRNA hợp thành phức hợp yên lặng cảm ứng RNA (RNA-induced silencing complex RISC), siRNA hoạt động với tư cách kẻ dẫn đường nhận dạng mRNA để tiêu hủy Trong TB động vật có vú dsRNA dài 30 nt làm bùng phát đường interferon để hoạt hóa PKR 2-5 - oligoadenylat synthase đường RNAi Tuy nhiên, siRNA ngắn cài ngoại sinh vào TB động vật có vú phiên mã nội sinh qua bước Dicer lại hoạt hóa trực tiếp thoái hóa mRNA tương đồng mà không cần khởi động đáp ứng interferon (Hình 5.2B) Hình 5.2 Cơ chế mRNA đích thoái hóa hướng siRNA tế bào động vật có vú (A) dsRNA dài 30bp phân cắt thành viên họ RNase III tên Dicer thành siRNA 21-23-nt có base chồi Các siRNA không bị tổn thương phức helicase đặc tính sợi antisense cặp đôi phức hợp có tên phức hợp yên lặng cảm ứng RNA (RNA-induced silencing complex RISC) RISC đảm trách phân cắt đặc hiệu vị trí RNA đích tái chế (B) siRNA đơn tổng hợp hỗn hợp siRNA enzym gốc từ RNA đích ghép nối cách ngoại sinh Có thể lựa chọn cách tạo SiRNA nội sinh việc sử dụng hệ thống hộp kép siRNA phiên mã vòng cặp tóc Chưa rõ vòng shRNA xử lý (Theo Lisa Scherer John J Rossi (2005) Cancer Gene Therapy Human Press Totowwa, New Jersey) ỨNG DỤNG CỦA RIBOZYM Các ribozym ứng dụng tác nhân kháng virus, dùng để điều trị ung thư rối loạn di truyền công cụ để làm sáng tỏ đường phê chuẩn đích Khởi đầu sử dụng ribozym nhằm vào kháng virus, chủ yếu điều trị virus gây thiếu hụt miễn dịch người (HIV) Các virus mà tác động thông qua sản phẩm trung gian RNA hệ gen chu kỳ tái chúng HIV, virus gây viêm gan B, C đích hấp dẫn mẫu đơn ribozym nhắm tới RNA hệ gen virus mRNA Ribozym sử dụng rộng rãi gen tế bào đích bao hàm gen biểu cách lầm lạc ung thư Đích ribozym tổng hợp bcr-abl kiến tạo từ nhiễm sắc thể Philadelphia liên quan tới bệnh bạch cầu dòng tuỷ mạn tính Đặc trưng nhiễm sắc thể chuyển vị (translation) biểu protein tổng hợp bcrabl tải nạp Trong trường hợp này, ribozym thiết kế để nhắm vào mRNA tổng hợp cách đặc hiệu nhắm vào bcr hay abl bình thường để ngăn chặn chức gen gây ung thư bcr-abl Khi đột biến codon 12 c-H-ras từ GGU thành GUU tạo nên vị trí cho phân cắt qua trung gian ribozym đầu búa Một ribozym biểu nội sinh nhắm vào đích có hiệu ứng ngăn ngừa hình thành tiêu điểm (focus formation) với khoảng 50% tế bào NIH3T3 thâm nhiễm với gen ras hoạt hóa Trái lại, tế bào biểu ribozym tương tự lại thâm nhiễm với ras hoạt hóa có thay đổi codon vị trí 61 thay vị trí 12 không ngăn ngừa hình thành tiêu điểm Các ribozym nhắm vào HER2/neu biểu mức ung thư vú làm giảm đáng kể tạo u tế bào chuột Hơn nữa, để nhắm trực tiếp vào gen gây ung thư, ribozym áp dụng cách gián tiếp với tư cách trị liệu kháng ung thư Chẳng hạn riobozyme nhắm vào gen kháng đa thuốc (multiple drug resistance gene 1) fos mRNA dòng tế bào ung thư tạo TB nhạy cảm với tác nhân hóa trị liệu Mặt khác, ribozym nhắm vào bcl-2 làm bùng phát apoptosis TB ung thư vùng miệng Các yếu tố đòi hỏi cho di đích hấp dẫn cho ribozym Các ribozym nhắm mục tiêu chống lại CAPL/mts, metalloprotein gian bào (matrix), pleiotrophin VLA-6 integrin làm giảm tiềm di TB khối u cần lưu tâm Sự tạo mạch đích quan trọng cho gen trị liệu ung thư trình ngăn chặn chuột ribozym đích vào protein gắn yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi pleiotrophin Các trị liệu với sở ribozym test động vật nhằm ức chế rối loạn tăng sinh khác tái hẹp động mạch vành Antitelomerase RNA ribozym test để áp dụng gen trị liệu ung thư Dĩ nhiên việc sử dụng ribozym tác nhân trị liệu cần có thay đổi phù hợp với loại ung thư Sự chuyển giao Bất kỳ dạng ribozym định lựa chọn phải đưa vào TB đích Có chế chung việc đưa phân tử RNA xúc tác vào TB - chuyển giao ngoại sinh ribozym hình thành trước (preformed ribozym) biểu nội sinh từ đơn vị phiên mã Ribozym hình thành trước chuyển vào TB nhờ phương thức: liposome, điện xung (electroporation) vi tiêm Rất nhiều phương pháp lý thú tổng hợp hóa học RNA dạng cải biến RNA thực vài năm qua Các phân tử có tính ổn định lâu dài huyết môi trường nội bào tổng hợp Một số ribozym với khung cải biến trì tính đặc hiệu vị trí đặc tính xúc tác RNA chưa cải biến, số lại làm tăng đặc tính xúc tác chúng trở thành ứng cử viên cho chuyển giao ex vivo Các ribozym cải biến hóa học thể khả chuyển giao không cần capsul hóa mà vào tế bào Biểu nội bào ổn định ribozym hoạt hóa phiên mã thực nhờ chuyển giao qua trung gian vec tơ virus Hiện nay, vec tơ retrovirus thường hay sử dụng tế bào nuôi cấy, TB sơ cấp (gốc) TB động vật chuyển gen Các vec tơ retrovirus có lợi hợp ổn định vào hệ gen TB chủ phân chia tất nhiên vắng mặt gen virus biểu làm giảm ngẫu nhiên đáp ứng miễn dịch động vật Hơn nữa, retrovirus tạo nên dạng giả cách dễ dàng với nhiều protein vỏ để nới rộng hạn chế tính hướng tế bào chủ mà tăng thêm mức độ đích TB cho chuyển gen ribozym Các vec tơ adenovirus tạo độ chuẩn cao tải nạp hiệu lại không hợp vào hệ gen vật chủ; biểu gen chuyển tức thời TB phân chia tích cực Các hệ thống chuyển giao virus khác virus adeno liên hợp, virus alpha lentivirus Virus adeno liên hợp hấp dẫn virus nhỏ, không gây bệnh hợp cách ổn định vào hệ gen vật chủ Với hệ virus alpha, sử dụng virus Semliki Forest tái tổ hợp cho hiệu ứng tải nạp cao TB động vật có vú biểu ribozym tế bào chất Phương tiện vận chuyển khác cho chuyển giao ex vovo gen ribozym cationic lipid Vì có nhiều công thức lipid nên tốt chọn lipid cho hiệu ứng cao chuyển gen mà độc tính lại ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN BIỂU HIỆN RIBOZYM Việc trị liệu nghiên cứu xác nhận đích phải thử nghiệm động vật Các ribozym sử dụng chuột chuyển gen nhằm kiến tạo mô hình bệnh đái tháo đường việc điều hòa xuống cách chọn lọc hexokinase mRNA tiểu đảo tụy Trong trường hợp này, biểu ribozym kiểm soát promoter insulin biểu tế bào tụy Sự chuyển giao ribozym retrovirus để kháng lại neuregulin phôi gà ngang với kiểu hình (phenotype) gây tổn hại phôi với tư cách gen knockout Khi định vị chuyển giao retrovirus với ribozym tương tự sau phân tích cách kỹ lưỡng đường hóa sinh neuregulin Dùng ribozym cảm ứng nhiệt kháng fushi tarzu ruồi giấm làm gián đoạn lúc tiến triển chức phôi ruồi giấm SỬA CHỮA RNA QUA TRUNG GIAN RIBOZYM Một áp dụng trị liệu ribozym khai thác hoạt tính ghép nối trans ribozym Tetrahymena Ribozym sử dụng để sửa chữa mRNA khiếm khuyết trình tự chức gây ghép nối trans RNA Những ribozym thiết kế để liên kết phân cắt RNA 5’ đích đột biến không mong muốn Vì ribozym trường hợp intron nên công nghệ hóa để thực việc chỉnh sửa trình tự RNA với tư cách 3exon Tiếp sau phân cắt RNA đích đột biến ribozym xúc tác gắn trình tự hoang dã vào phân cắt Đây minh chứng hiệu chỉnh Lax Z đột biến vi khuẩn sau hiệu chỉnh thông tin tế bào liềm tế bào dòng hồng cầu SỰ TIẾN HÓA CỦA RIBOZYM Việc phát ribozym làm bùng phát tranh cãi giả thuyết “thế giới RNA” (RNA world), theo tất trình sinh hóa thực enzym có tảng RNA Kể từ đó, tiến hóa RNA bắt buộc phải từ in vitro để tiến gần tới enzym RNA có khả thực đa dạng rộng phản ứng hoá sinh hình thành liên kết carbon -carbon liên kết peptide Tiến hóa RNA in vitro sử dụng để kiến tạo ribozym phân cắt RNA với domain nhỏ hơn, ribozym phân cắt DNA motif xúc tác Ngay enzym DNA phân cắt RNA tạo thông qua tiến hóa (những thay đổi) in vitro Những enzym tiến hóa (evolved) ví dụ điển hình sức mạnh tiến hóa in vitro Cũng có lý để kết luận việc đạt tương tác chất - enzym hiệu ứng chức ribozym môi trường gian bào công việc dễ dàng chiến lược cho biểu định vị ribozym môi trường gian bào nhu cầu đòi hỏi phép sử dụng cách phổ biến ribozym tác nhân trị liệu NHỮNG CÂN NHẮC KHÁC Mặc dầu tính đặc hiệu cặp đôi base tạo dựng đích chọn lọc, làm tối thiểu hóa độc tính tiềm ẩn nói chung Nhưng vấn đề độc tính phải làm test cách nghiêm khắc ribozym làm cặp đôi chất đích tạo hiệu ứng ức chế antisense không mong muốn Vì trình tự ribozym có tương tác cặp đôi base tiềm tàng khác nhau, việc tích lũy số liệu từ thí nghiệm ribozym khác cần thiết cho việc đánh giá tiềm ẩn cách nghiêm khắc Một số tiềm ẩn độc tính tương tác không đặc hiệu ribozym với protein tế bào hay việc phát sinh tập trung cao gian bào sản phẩm phân cắt hiệu ứng ức chế chuyển hóa tế bào cải biến hóa học tiền tổng hợp ribozym Một số lợi tiềm tàng ribozym so với RNA antisense hoạt tính xúc tác chúng mà lý thuyết dẫn đến làm bất hoạt nhiều chất đích Tuy nhiên, cần phải chứng minh liệu hoạt tính xúc tác có xảy gian bào không? Có lẽ luân chuyển chất qua trung gian ribozym gian bào tạo thuận lợi cho phân cắt qua trung gian ribozym đầu búa Các thí nghiệm thiết kế để phát protein tạo thuận lợi cho luân chuyển ribozym gian bào thực vài phòng thí nghiệm Việc làm giầu liên hợp ribozym - protein với nâng cao hoạt tính xúc tác thăm dò chiến lược khám phá in vitro Sau chót việc thiết kế mẫu tổng hợp hóa học ribozym nhằm tạo khả luân chuyển xúc tác cao base đặc hiệu cải biến khung cần thực DỰ KIẾN TRONG TƯƠNG LAI Khái niệm ribozym tác nhân trị liệu xuất vòng năm gần Tuy nhiên, vấn đề lớn cần quan tâm việc triển khai sử dụng lâm sàng ribozym tương lai gần Tại thời điểm vội vã kết luận ribozym có vị trí danh mục tác nhân trị liệu y học đại Còn nhiều vấn đề cần phải tìm hiểu dịch chuyển RNA bên TB yếu tố TB gây trở ngại hay tạo thuận lợi cho việc sử dụng ribozym Những vấn đề không đơn giản chút nào, không mà làm hạn chế nghiên cứu ứng dụng ribozym Khi kỹ thuật sinh học TB tinh tế câu trả lời cho vấn đề tới gần Việc biến nạp trình tự ribozym từ phân tử phân cắt (và kết nối) dạng cis tự nhiên thành tác nhân phân cắt (và kết nối) dạng trans đặc hiệu đích khích động lớn tiềm ứng dụng chúng Các ribozym nhắm đích gen virus đánh giá lâm sàng, ribozym nhắm đích gen TB chuyển vào động vật chuyển gen việc sử dụng ribozym mở rộng sang lĩnh vực nghiên cứu tiến hóa RNA, sửa chữa mRNA phát gen Để ribozym trở thành tác nhân trị liệu thực cản trở phải vượt qua Những cản trở phải kể đến việc chuyển giao cách hiệu (theo tỷ số %) tới quần thể tế bào, biểu hiệu ribozym từ vec tơ hay tập trung ribozym gian bào, colocalization (trong hiển vi huỳnh quang, colocalization muốn nhắc đến phương pháp phân tích số liệu khác để xác định đặc trưng độ trùng lặp mẫu đánh dấu huỳnh quang khác nhau, mẫu có bước sóng phát xạ khác để xác định xem đích TB khác có định vị vùng gần với vùng khác) ribozym với đích, tính đặc hiệu ribozym mRNA mong muốn việc nâng cao vòng luân chuyển chất qua trung gian ribozym Nhờ hiểu biết cấu trúc bậc RNA ngày nâng cao mà RNA lại đích ngắm chuẩn việc giải vấn đề thuộc tính đặc hiệu Đồng thời, am hiểu định vị vật lý RNA TB đường dịch chuyển từ nhân tới tế bào chất chắn giúp cho colocalization ribozym đích Những cải biến ribozym (2ribose) với tác nhân khác nhóm methyl, alkyl, fluoro amino làm tăng đáng kể tính ổn định nuclease Tương tự vậy, ribozym DNA-RNA chimeric làm tăng thêm tính ổn định Hiệu lực việc chuyển giao tới TB vec tơ virus hay liposom nâng cao không ngừng Những phân tử phải trì tiềm xúc tác chúng, đồng thời phải tiến đến vị trí dễ bị ảnh hưởng chất phải tác động cách hiệu quả, vững phân tử đích, điều hữu ích công cụ di truyền thay với tác nhân trị liệu Những tiến lớn đạt tất lĩnh vực cho phép sử dụng rộng rãi tác nhân đặc hiệu cao để điều hòa xuống biểu RNA đích RNA gây nhiễu Chúng ta tập trung vào số lợi việc sử dụng công nghệ dựa sở RNAi hệ động vật có vú, chủ yếu nhắm vào việc áp dụng nghiên cứu ung thư Sau so sánh cách tiếp cận với việc sử dụng siRNA ribozym điều hòa xuống đích mRNA đặc hiệu siRNA thực thể chức tạo phân cắt dsRNA dài enzym Dicer Thông thường duplex với chiều dài 21-22 nt, có base nhô Cả siRNA short hairpin RNA (shRNA) tổng hợp hóa học đưa vào cách ngoại sinh hay biểu cách nội sinh từ promoter (Hình 5.2B) In vitro, Kit phiên mã để tạo siRNA sản phẩm thương mại người ta tổng hợp phương pháp hóa học Về vấn đề biểu hiện, có mẫu thiết kế thành công siRNA Mẫu thứ bắt chước sản phẩm Dicer tự nhiên, cấu tạo gồm RNA 21-nt, đặc biệt có phần nhô đầu Phần nhô kinh điển bao gồm uridin, phần nhô lại từ trình tự đích nhắm trước Các dòng siRNA dài có chiều dài tới 29-nt sử dụng mà đáp ứng interferon tế bào động vật có vú Mẫu thiết kế thứ hai muốn nhắc đến shRNA , cấu trúc gồm đơn trình tự sense antisense nối với vòng ghim Với vòng ghim chừng 4-nt có phần siRNA hiệu ứng, với vòng dài tới nt chắn Vì promoter pol III hiệu ứng cách đặc hiệu phiên mã siRNA shRNA nên suy luận thoái hóa mRNA đặc hiệu đích Promoter U6 + có đặc tính làm cho thích hợp cách đặc biệt cho việc biểu siRNA U6 +1 promoter bên (external) tạo biểu cao nhiều dạng TB Sự phiên mã guanosin khởi đầu đặc hiệu kết thúc hành trình với nhiều trình tự uridin sao, việc cắt bỏ 3’ poly u lồi nhận dạng cỗ máy RISC Cuối cùng, promoter tương đối nhỏ đưa vào nhiều khung vec tơ dễ dàng Ngoài ra, promoter pol III thăm dò, promoter pol II chưa nghiên cứu nhiều Các vec tơ plasmid chuẩn sử dụng cho việc biểu nhanh cách nội sinh siRNA Cả episome vec tơ retrovirus có biểu ổn định Một số công trình có sử dụng vec tơ lentivirus để biểu dài hạn siRNA Các vec tơ lentivirus đóng gói có lợi chúng biến nạp TB phân chia TB không phân chia RNAi ứng dụng ung thư siRNA thăm dò với tư cách công cụ điều hòa xuống sản phẩm nhiễm sắc thể Philadelphia - kết chuyển vị gen BCR NST số 22 ABL NST số quan hệ với nhau, tạo nên gen ung thư hợp (oncogenic fusion gene) Kết cho thấy: gen BCR/ABL có mặt hầu hết bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu dạng tủy mạn tính (chronic myeloid leukemia CML), 30% người lớn mắc bệnh bạch cầu tăng lympho huyết cấp tính (acute lymphoblastic leukemia), người đáp ứng thấp với trị liệu thông thường Có cách giải thích xác định dựa điểm dừng khác BCR: M-BCR m -BCR tạo nên protein ung thư M -BCR/ABL m -BCR/ABL với khối lượng phân tử 210 kDa 19 kDa Protein lai ghép có hoạt tính kinase cao chất tương đồng ABL TB, nghĩ phận dòng thác hiệu ứng dẫn đến phát triển ung thư ức chế apoptosis Willda cộng sử dụng dòng TB người bị bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính (chronic myelogenous leukrmia cell line) biểu M -BCR/ABL mRNA để test khả siRNA tổng hợp việc điều hòa xuống đặc hiệu tương ứng với tín hiệu protein, làm tăng nhạy cảm TB apoptosis Khi thâm chuyển tức thời siRNA nhắm vào việc kháng lại vùng cầu nối chung M -BCR/ABL làm giảm xuống đặc hiệu mức p210 không ảnh hưởng tới protein ABL vimentin nội sinh Một siRNA đối chứng mà bắt cặp không chuỗi tương ứng với khoảng 17-18 base chuỗi antisense hiệu ứng Điều quan trọng giảm cảm ứng siRNA ung thư lại tạo hiệu ứng sinh lý học mong muốn TB trở nên nhạy cảm với apoptosis Với oligonucleotid sense hay antisense riêng rẽ M -BCR/ABL siRNA đột biến hay siRNA kháng lại đích tương đồng hỗn hợp m -BCR/ABL (không thấy TB này) lại không làm tăng apoptosis M -BCR/ABL siRNA cảm ứng apoptosis với mức tương tự tác nhân hóa trị liệu STI 571 72 giờ, động học có thấp Người ta không quan sát thấy hiệu ứng cộng sử dụng STI 571 siRNA; nhiên, thấy có nồng độ STRI571 test gây cảm ứng apoptosis gần mức tối đa Sơ đáp ứng liều thuận nghịch M -BCR/ABL siRNA STI 571 thấy có hợp tác với Tuy nhiên, kết cho chứng siRNA làm giảm cách đặc hiệu với nhiều mức độ ung thư làm đảo ngược phần đặc tính tăng trưởng ung thư hệ mô hình dòng tế bào Scherr cộng xác nhận có giảm đặc biệt M -BCR/ABL tế bào K562 nhờ điện xung với siRNA loại rõ mức c -bcr c -abl nội sinh biến đổi (đối với GAPDH tế bào) Hơn nữa, thâm chuyển siRNA vào tế bào TonB 210.1 chuột nhà có chứa M -BCR/ABL cảm ứng làm giảm mức mRNA protein sau cảm ứng; khả sống TB đồng thời bị suy giảm gần với STI 571 thí nghiệm trước Các tác giả test để xem M -BCR/ABL siRNA liệu có làm giảm tăng sinh cảm ứng cytokin hay không tăng sinh đem đến từ ber /abl vào tế bào TonB Nếu thêm interleukin (IL-3) làm đảo ngược ức chế tăng sinh cảm ứng STI 751 siRNA, mức độ giảm BCR/ABL mRNA giống với tế bào xử lý với siRNA có IL-3 Như vậy, M-BCR/ABL siRNA làm giảm ức chế tăng trưởng phụ thuộc arb /abl không phụ thuộc cytokin Kết ý cách đặc biệt ánh sáng thực nghiệm sau tế bào sơ cấp Khi điện xung M -BCR/ABL siRNA vào tế bào PBMC CD34+ khiết lấy từ bệnh nhân bị bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính với siRNA làm giảm ung thư tới 50-79% Tuy nhiên, không thấy có ức chế giảm tăng trưởng hình thành quần thể TB sơ cấp thâm nhiễm với siRNA, sau tăng trưởng môi trường lỏng bán lỏng có bổ sung cytokin thử nghiệm tăng sinh hay hình thành quần thể Trái lại, xử lý đối chứng với STI 751 lại có hiệu ứng Không thấy có giảm tăng trưởng phụ thuộc M -BCR/ABL siRNA dòng TB sơ cấp, điều chứng tỏ độ pha loãng siRNA vượt ngưỡng thời gian thực nghiệm, ảnh hưởng cytokin cho thêm vào nuôi cấy TB, điều phảng phất kết thu tế bào TonB Tuy nhiên, tế bào TonB IL-3 lại cho hiệu ứng với siRNA STI 751 STI 751 bị ức chế thử nghiệm hình thành quần thể Tình trạng sáng tỏ lặp lại thử nghiệm với biểu ổn định M -BCR-ABL siRNA từ khung lentivirus Tất thử nghiệm vẽ tranh thể siRNA phương pháp hiệu lực làm giảm ung thư đặc hiệu Tuy nhiên, kết đạt TB nuôi cấy Tương tự vậy, siRNA chưa test với đích gen hỗn hợp ALM1/MTG8 chuyển vị nhiễm sắc thể 21 nhiễm sắc thể 8, thường xảy mức 10-15% bệnh nhân AML de novo Hỗn hợp ALM1/MTG8 làm chuyển đổi chức bình thường AML1 với tư cách chất hoạt hóa phiên mã điều hòa tạo máu thành chất kiềm chế (repressor) trội trans chủ yếu, dẫn TB tới trạng thái biến nạp ung thư Để hiểu rõ vai trò AML/MTG8 hình thành bệnh bạch cầu, người ta sử dụng siRNA nghiên cứu hiệu ứng kiềm chế protein ung thư dòng TB gây bệnh bạch cầu người Kasumi - SKNO-1 Các tác giả thiết kế số siRNA đích đặc hiệu mRNA hỗn hợp AML/MTG8, tương tự thí nghiệm với BCR/ABL 16 sau biến nạp với tế bào Kasumi -1, thử nghiệm rõ: nồng độ 200-nm AML/MTG8 siRNA làm giảm cách đặc hiệu mRNA ung thư liên quan tới AML1 nội sinh, so sánh với AML1/MTG8 siRNA đột biến không thích hợp Những kết tương tự quan sát thấy tế bào SKNO-1 Kasumi -1 thực nghiệm với Real - time reverse transcriptase polymerase chain reaction chuẩn hóa GAPDH tế bào Sự kiềm chế ung thư kéo dài ngày, song song với việc giảm đáng kể protein tương ứng ngày sau thâm chuyển; AML tế bào không bị tác động Tiếp theo AML/MTG8 siRNA sử dụng để xác định hiệu ứng thứ cấp cảm ứng điều hòa xuống protein Các thí nghiệm trước đề cập tới protein sinh ung thư với việc can thiệp điều hòa xuống cảm ứng cytokin bình thường CD11 receptor yếu tố kích thích quần thể đại thực bào (macrophage colony-stimulating factor M-CSF) việc suy luận biệt hóa bạch cầu đơn nhân tế bào Kasumi -1 SKNO-1; AML1/MTG8 gắn cách đặc hiệu vào yếu tố tăng trưởng biến nạp SMAD3 (transforming growth factor (TGF-β) activated transcription factor SMAD3) tiềm tàng khả tạo khối biệt hóa dòng tủy qua trung gian TGF –β/vitamin D3 Vả lại, protein hỗn hợp gắn vào C /EBP- lại cần thiết cho tăng trưởng bạch cầu hạt Các tác giả sử dụng AML1/MTG8 siRNA để kết nối điều hòa xuống protein hướng tới tái đặc tính biệt hóa AML1/MTG8 siRNA đơn lẻ làm tăng nhẹ số tế bào Kasumi -1 dương tính với CD11b (CD11b- positive Kasumi-1 Cells) Tuy nhiên, AML1/MTG8 siRNA kết hợp với xử lý TGF-β1 vitamin D3 tế bào Kasumi -1 lại biểu làm giảm tăng trưởng dòng; tăng số lượng tế bào dương tính marker biệt hóa dòng tủy CD11b từ mức tối đa 20% (TFG-β1- / vitamin D-B3- đơn lẻ) lên mức 40-60%; tăng đáng kể biểu receptor M -CSF bề mặt; tăng 60 lần mức C /EBP- tế bào (vượt 15 lần so với AML1/MTG8 siRNA đơn lẻ) Những kết khẳng định vai trò AML1/MTG8 siRNA kiềm chế cảm ứng bắt nguồn từ cytokin biệt hóa dòng tủy, trì trạng thái tế bào blast bạch cầu rõ ràng ứng dụng siRNA việc phân tích gen β β Ví dụ RNAi nhắm vào sản phẩm chuyển vị, sản sinh protein ung thư hỗn hợp EWS/Fli-1, phát thấy 85% ung thư Ewing TB khối u biểu bì thần kinh (neuroectodermal) gốc Có trùng lặp đích bất đối siRNA khe nối hỗn hợp biểu từ promoter U6+1 TC135 dòng TB ung thư Ewing EWS/Fli-1 siRNA làm giảm cách đặc biệt mRNA hỗn hợp liên quan tới -actin tế bào Tuy nhiên, vị trí II siRNA chứa 17 base tương đồng với Fli -1 làm giảm phần Fli -1 mRNA nội sinh Mặc dầu vậy, không xảy đảo nghịch; vị trí I siRNA chứa 17 base tương đồng với EWS tế bào điều hòa xuống cách đặc hiệu với ung thư Những kết làm bật tầm quan trọng việc theo dõi kiềm chế chéo tiềm tàng nội sinh sử dụng RNAi Các tế bào TC135 đồng chuyển với EWS/Fli-1 vec tơ biểu eGFP làm giảm vận tốc tăng trưởng nuôi cấy tuần Hơn nữa, biểu c -Myc hoạt hóa protein EWS/Fli-1 giảm xuống xử lý với siRNA Tóm lại, siRNA hiệu lực việc làm giảm mức protein ung thư hỗn hợp M -BCR/ABL, AML/MTG8 EWS/Fli-1 Những kết chứng minh khả sử dụng siRNA tác nhân trị liệu bệnh ung thư kết hợp với việc trị liệu thuốc Thành công việc tiếp cận phụ thuộc phần vào siRNA làm trung gian việc làm giảm bớt ung thư đích thay đổi sinh lý điều hòa xuống theo ý muốn tế bào ung thư sơ cấp So sánh siRNA ribozym siRNA rõ công cụ mạnh đánh gục (knock down) mRNA cách đặc hiệu Vì vậy, câu hỏi cần đặt ta chọn công nghệ siRNA công nghệ khác dựa sở acid nucleic? Để đáp ứng phần vấn đề này, phần kết chương bình luận cách ngắn gọn: so sánh việc sử dụng ribozym siRNA lợi tiềm tàng cách tiếp cận Hiện hiểu rõ dung nạp cải biến, nới rộng đời sống bán phần hiệu ứng dụng thời ribozym cao siRNA Chắc cần phải có thí nghiệm xa xác định mức độ dạng cải biến hóa học mà siRNA dung nạp Các dẫn liệu xuất rõ chức chủ chốt độc quyền siRNA tế bào chất; siRNA không đích intron có vị trí đích siRNA isoform mRNA đặc hiệu khớp nối exon -exon Tuy nhiên nghi ngờ liệu vị trí có kháng lại thoái hóa siRNA hay không? Cũng lẽ ấy, ribozym sử dụng nhờ có lợi cao với việc phân giải mRNA trước tới tế bào chất Chẳng hạn giai đoạn sớm chép HIV tế bào xu hướng kiểm soát dễ dàng chất ức chế acid nucleic với tư cách mRNA mã hóa cho protein điều hòa dư thừa so với gen cấu trúc muộn Cũng việc ức chế xuất RNA sớm, mã hóa cho protein điều hòa sớm Tat Rev ngăn chặn khởi đầu tái virus hoạt hóa Chẳng hạn ribozym anti -HIV hướng vào thành phần nhân ức chế thành công tái HIV Việc phát vị trí đích đặc hiệu mRNA mơ hồ thiết kế siRNA ribozym Tuy nhiên, lựa chọn vị trí đích bị giới hạn ribozym không sử dụng vị trí không bao hàm vị trí phân cắt cặp ba thích ứng Có nhận xét vị trí đích đặc hiệu lại đổi hướng với siRNA chưa có lựa chọn khác cho việc cải tiến phân cắt vị trí Có nhiều lựa chọn colocalization để nâng cao tính nhạy cảm ribozym cách định hướng hợp phần đặc biệt TB colocalization định hướng trình tự tới đích Tuy nhiên, ribozym lại có chắp thêm trình tự đích không liền kề mà việc colocalize đích ribozym đồng thời lại tạo thuận lợi cho việc thay đổi cấu trúc làm cho vị trí đích trở thành hữu ích Yêu cầu kích thước siRNA để phòng ngừa việc sử dụng trình tự chắp thêm, có ngoại lệ nhiều trình sinh hóa siRNA microRNA liên quan hiểu rõ Việc xác định đặc trưng RNA lai ghép liên quan tới microRNA siRNA tiến hành Việc sử dụng siRNA tiếp tục mở rộng, đặc biệt chế hóa sinh tường tận Tuy nhiên, không hy vọng RNAi sử dụng thay cho ribozym, aptamer cách tiếp cận toàn diện khác Các siRNA với tư cách công cụ bổ sung kết hợp với trị liệu khác sở acid nucleic tạo hiệu ứng trị liệu cao