Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)

Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HƯỜNG PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HƯỜNG PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn công trình nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, giúp đỡ cán Khoa Khoa học sống – Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các số liệu, kết luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm số liệu luận văn Thái Nguyên, ngày 04 tháng 11 năm 2015 Tác giả luận văn NGUYỄN THỊ HƯỜNG Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, ngƣời hƣớng dẫn, bảo tận tình giúp đỡ suốt trình thực đề tài hoàn chỉnh luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Khoa học sống – Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Sơn cán bộ, kỹ thuật viên phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ tốt để hoàn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp bạn bè động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn suốt trình học tập nghiên cứu Thái Nguyên, ngày 04 tháng 11 năm 2015 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hường Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN vi MỞ ĐẦU 1 Đ t vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY NGÔ 1.1.1 Nguồn gốc phân loại ngô 1.1.2 Đ c điểm sinh học ngô 1.1.3 Đ c điểm hóa sinh hạt ngô 1.1.4 Giá trị kinh tế 1.1.5 Tình hình sản xuất ngô giới 1.1.6 Tình hình sản xuất ngô Việt Nam 10 1.2 MỌT NGÔ VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA MỌT NGÔ ĐẾN QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN NÔNG SẢN 11 1.2.1 Đ c điểm mọt hại ngô (Sitophilus zeamais Motschulsky) 11 1.2.2 Côn trùng hại ngô trình bảo quản nông sản 14 1.3 CYSTEINE PROTEINASE VÀ CYSTATIN 16 1.3.1 Cysteine proteinase 16 1.3.2 Cystatin - chất ức chế Cysteine proteinase 18 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv 2.1 VẬT LIỆU 21 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Hóa chất 21 2.2.2 Thiết bị 21 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 22 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.3.1 Phƣơng pháp sinh lí 22 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử 22 2.3.3 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 30 2.3.4 Phƣơng pháp xử lí trình tự gen 30 2.3.5 Phƣơng pháp xử lý kết tính toán số liệu 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ BẰNG NHIỄM MỌT NHÂN TẠO 31 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10 33 3.2.1 Kết tách chiết RNA tổng số 33 3.2.2 Kết tổng hợp cDNA nhân gen 33 3.2.3 Kết tinh sản phẩm PCR 34 3.2.4 Kết tách dòng gen 35 3.2.5 Kết tách plasmid tái tổ hợp 36 3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN 37 3.3.1 Kết so sánh trình tự gen Cystatin 10 hai mẫu ngô BG HG 38 3.3.2 Kết so sánh hai trình tự nghiên cứu (BG, HG) với hai trình tự đƣợc công bố (CB2, MX4) BN000514 GenBank 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid bp base pair (c p bazơ) cDNA complementary DNA cs cộng DEPC diethyl pyrocarbonate DNA Deoxyribose nucleic acid dNTP deoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E coli Escherichia coli IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb kilo base kDa kilo Dalton µg µl mRNA Microgam Microlite messenger ribonucleic acid NCBI OD National Center for Biotechnology Information Optical density PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RNA Ribonucleic acid TAE Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi phiên mã ngƣợc) Tris-acetate-EDTA UV X-gal Ultra violet 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside RT- PCR Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.1 Tỉ lệ phận hạt ngô thành phần hóa học chúng ….….6 Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngô giới 10 năm gần Bảng 1.3 Tình hình sản xuất ngô số quốc gia giới năm 20149 Bảng 1.4 Tình hình sản xuất ngô Việt Nam từ 2006 - 2013 10 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 24 Bảng 2.2 C p mồi nhân gen Cystatin 10 25 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PT-PCR nhân gen Cystatin 10 25 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen Cystatin 10 vào vector PBT 27 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng colony – PCR 28 Bảng 2.6 Chu kỳ nhiệt phản ứng colony – PCR 28 Bảng 3.1 Lƣợng ngô hao hụt theo thời gian giống ngô nghiên cứu 31 Bảng 3.2 Giá trị tỉ lệ phổ hấp thụ A260/A280 hàm lƣợng RNA giống ngô nghiên cứu 33 Bảng 3.3 Sự sai khác giữ trình tự gen Cystatin 10 hai mẫu ngô BG, HG38 Bảng 3.4 Hệ số tƣơng đồng trình tự gen hai mẫu ngô BG, HG 39 Bảng 3.5 Sự sai khác trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin10 hai giống ngô BG, HG 40 Bảng 3.6 Hệ số tƣơng đồng trình tự amino acid mẫu nghiên cứu 41 Bảng 3.7 Sự khác trình tự gen Cystatin 10 BG, HG với CB2, MX4 BN000514 GenBank 44 Bảng 3.8 Hệ số tƣơng đồng trình tự gen mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 BN000514 GenBank 45 Bảng 3.9 Sự sai khác trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin10 hai mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 BN000514 GenBank 47 Bảng 3.10 Hệ số tƣơng đồng trình tự amino acid mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 BN000514 GenBank 48 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Hình 1.1 Mọt ngô Sitophilus zeamais 11 Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn lƣợng thức ăn hao hụt theo thời gian mẫu ngô nghiên cứu 32 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm RT - PCR nhân gen Cystatin 10 giống ngô nghiên cứu 34 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm tinh gen Cystatin 10 mẫu ngô nghiên cứu 35 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen Cystatin 10 mẫu ngô nghiên cứu 36 Hình 3.5 Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp 37 Hình 3.6 So sánh trình tự gen Cystatin 10 hai mẫu ngô BG, HG 38 Hình 3.7 Trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin 10 hai mẫu nghiên cứu 40 Hình 3.8 So sánh trình tự gen Cystatin 10 BG, HG với CB2, MX4 BN000514 GenBank 42 Hình 3.9 Trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin 10 hai mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 BN000514 GenBank 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đ t vấn ề Cây ngô (Zea mays L.) năm loại lƣơng thực giới Hạt ngô chứa đầy đủ chất dinh dƣỡng cho ngƣời gia súc Ở Việt Nam, ngô lƣơng thực quan trọng thứ hai sau lúa gạo Trong năm gần đây, sản xuất ngô Việt Nam tăng nhanh nhờ thúc đẩy ngành chăn nuôi công nghiệp chế biến Ngô thức ăn chăn nuôi quan trọng nay, 70% chất tinh thức ăn tổng hợp gia súc từ ngô Gần đây, ngô thực phẩm; ngƣời ta dùng bắp ngô bao tử làm rau cao cấp có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao; ngô nếp, ngô đƣờng (ngô ngọt) đƣợc dùng làm quà ăn tƣơi (luộc, nƣớng) ho c đóng hộp làm thực phẩm xuất Ngô nguyên liệu ngành công nghiệp lƣơng thực, thực phẩm công nghiệp nhẹ để sản xuất rƣợu, cồn, tinh bột, dầu, glucôzơ, bánh kẹo Trong y dƣợc, ngô đƣợc dùng để trị áp huyết, râu ngô đƣợc dùng để làm thuốc [46] Hiện nay, diện tích ngô ngày đƣợc mở rộng có phát triển tiến công tác chọn tạo giống trồng nhằm tạo giống ngô có suất cao, có khả kháng sâu bệnh hại, chống chịu hạn tốt Tùy theo mục đích sử dụng mà sản phẩm ngô phải đƣợc bảo quản điều kiện khác thời gian bảo quản khác Trong trình bảo quản sản phẩm ngô theo thời gian có nhiều loại côn trùng phá hoại làm giảm phẩm chất, chất dinh dƣỡng nông sản,… Thành phần sâu mọt hại ngô tƣơng đối đa dạng xuất kho bảo quản ngô nhƣ mọt gạo, mọt cƣa, mọt đục thân, mọt thóc,… Vì vậy, việc nghiên cứu chọn tạo giống ngô có suất cao khả kháng mọt tốt yêu cầu thực tiễn đ t cho ngành trồng trọt nói chung ngành chọn giống ngô nói riêng Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 40 3.3.1.2 So sánh trình tự amino acid protein suy diễn từ gen Cystatin 10 hai mẫu ngô BG HG Kết so sánh trình tự amino acid protein suy diễn từ gen Cystatin 10 hai mẫu ngô BG, HG đƣợc trình bày qua hình 3.7, bảng 3.5 bảng 3.6 Hình 3.7 Trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin 10 hai mẫu nghiên cứu Kết thể hình 3.7 cho thấy chuỗi polypeptide hai mẫu ngô BG, HG có chiều dài 148 amino acid, trình tự amino acid hai chuỗi có khác 04 vị trí (64, 65, 72, 111) Bảng 3.5 Sự sai khác trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin10 hai giống ngô BG, HG Mẫu Vị trí BG HG 64 Q P 65 E D 72 A S 111 E K Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 41 Kết thể bảng 3.5 cho thấy trình tự amino acid vị trí 64 mẫu ngô BG Q, HG P; trình tự amino acid vị trí 62 mẫu ngô BG E, HG D; trình tự amino acid vị trí 72 mẫu ngô BG A, HG S; trình tự amino acid vị trí 111 mẫu ngô BG E, HG K Bảng 3.6 Hệ số tƣơng đồng trình tự amino acid mẫu nghiên cứu (%) Mẫu BG HG BG 100 97,2 HG 100 Kết thể bảng 3.6 cho thấy hệ số tƣơng đồng trình tự amino acid suy diễn protein cystatin 10 mẫu ngô BG HG 97,2% Sự sai khác trình tự nucleotide amino acid suy diễn sở để so sánh khả kháng mọt hai giống ngô kháng mọt tốt kháng mọt nhằm tìm kiếm tính quy luật thay đổi vị trí nucleotide amino acid liên quan đến tính kháng mọt giống ngô Đây tiền đề sở cho việc nghiên cứu chọn tạo giống ngô có khả kháng mọt tốt, suất cao, phục vụ sản xuất đời sống 3.3.2 Kết so sánh hai trình t nghiên cứu (BG, HG) với hai trình t công bố (CB2, MX4) BN000514 GenBank 3.3.2.1 So sánh trình tự gen Cystatin 10 hai mẫu nghiên cứu (BG, HG) với hai trình tự công bố (CB2, MX4) BN000514 ngân hàng gen Chúng tiến hành so sánh trình tự gen Cystatin 10 hai mẫu nghiên cứu (BG, HG) với hai trình tự đƣợc công bố CB2, MX4 (CB2 giống ngô địa phƣơng tỉnh Cao Bằng, MX4 giống ngô lai) [10] BN000514 Ngân hàng gen NCBI, kết đƣợc trình bày hình 3.8, bảng 3.7 bảng 3.8 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 42 Hình 3.8 So sánh trình tự gen Cystatin 10 BG, HG với CB2, MX4 BN000514 GenBank Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 43 Kết thể hình 3.7 cho thấy trình tự gen đƣợc so sánh có khác 15 vị trí (30, 50, 108, 110, 168, 176, 204, 207, 226, 252, 255, 261, 327, 352, 411) Đ c biệt, bốn mẫu ngô Việt Nam BG, HG, CB2, MX4 bị 12 nucleotide (từ vị trí số 61 đến 72) so với trình tự gen Cystatin10 có mã số BN000514 Ngân hàng gen Hơn nữa, riêng hai mẫu nghiên cứu bị nucleotide (từ vị trí số 262 đến 270) so với trình tự gen Cystatin10 có mã số BN000514 Ngân hàng gen Do có nucleotide nên kích thƣớc gen Cystatin 10 bốn mẫu (BG, HG, CB2, MX4) ngắn so với kích thƣớc gen cystatin 10 BN000514 Ngân hàng gen, cụ thể là: Kích thƣớc gen cystatin 10 BN000514 468 bp, BG HG 447 bp, CB2 MX4 453 bp Nhƣ gen cystatin 10 BG HG có kích thƣớc ngắn gen cystatin 10 CB2, MX4 BN000514 Kết thể hình 3.7 cho ta thấy có sai khác giống trình tự nucleotide bốn mẫu BG, HG, CB2, MX4 hai vị trí so với trình tự nucleotide BN000514, cụ thể là: Tại vị trí 108, trình tự nucleotide BN000514 T, trình tự nucleotide BG, HG, CB2, MX4 C; Tại vị trí 176, trình tự nucleotide BN000514 C, trình tự nucleotide BG, HG, CB2, MX4 G Đ c biệt, hai giống ngô có khả kháng mọt tốt (HG CB) có sai khác giống trình tự nucleotide ba vị trí so với trình tự nucleotide BN000514, cụ thể là: Tại hai vị trí 327, 352 trình tự nucleotide BN000514 G, trình tự nucleotide HG, CB2 A; Tại vị trí 411, trình tự nucleotide BN000514 G, trình tự nucleotide HG, CB2 C Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 44 Bảng 3.7 Sự khác trình tự gen Cystatin 10 BG, HG với CB2, MX4 BN000514 GenBank Mẫu BN000514 HG CB2 BG MX4 30 G G C G G 50 C C C C G 108 T C C C C 110 G G A G G 168 G G C G G 176 C G G G G 204 A C A A A 207 G T G G G 226 G T G G G 252 A A C A A 255 T T C T T 261 C C G C C 327 G A A G G 352 G A A G G 411 G C C G C Vị trí Kết thể bảng 3.7 cho thấy trình tự nucleotide BG có sai khác với trình tự nucleotide BN000514 vị trí (108, 176), sai khác với trình tự nucleotide CB2 vị trí (30, 110, 168, 252, 255, 261, 327, 352, 411), sai khác với trình tự nucleotide MX4 vị trí (50, 411) Trình tự nucleotide HG có sai khác với trình tự nucleotide BN000514 vị trí (108, 176, 204, 207, 226, 327, 352, 411), sai khác với trình tự nucleotide CB2 vị trí (30, 110, 168, 204, 207, 226, 252, 255, 261), sai khác với trình tự nucleotide MX4 vị trí (50, 204, 207, 226, 327, 352) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 45 Nhƣ vậy, sai khác trình tự nucleotide BG so với BN000514 (2 vị trí) sai khác trình tự nucleotide HG so với BN000514 (8 vị trí) Sự sai khác trình tự nucleotide BG so với CB2 (9 vị trí) với sai khác trình tự nucleotide HG so với CB2 (9 vị trí), nhiên vị trí sai khác không hoàn toàn trùng Sự sai khác trình tự nucleotide BG so với MX4 (2 vị trí) sai khác trình tự nucleotide HG so với MX4 (6 vị trí) Do đó, hệ số tƣơng đồng trình tự có khác biệt (Bảng 3.8) Kết thể bảng 3.7 cho thấy điều đ c biệt hai vị trí (327, 352) hai giống ngô kháng mọt tốt (HG, CB2) A, hai giống ngô kháng mọt (BG, MX4) G Điều chứng tỏ khả kháng mọt tốt liên quan đến trình tự nucleotide hai vị trí Bảng 3.8 Hệ số tƣơng đồng trình tự gen mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 BN000514 GenBank BN000514 BG BN000514 BG HG CB2 MX4 100 95,0 93,8 94,4 95,9 100 98,6 96,6 96,9 100 96,6 96,0 100 96,7 HG CB2 MX4 100 Kết thể bảng 3.8 cho thấy hệ số tƣơng đồng mẫu BG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 95,0%, 96,6%, 96,9%; hệ số tƣơng đồng mẫu HG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 93,8%, 96,6%, 96,0% 3.3.2.2 So sánh trình tự amino acid protein suy diễn từ gen cystatin 10 hai mẫu ngô BG, HG với CB2, MX4 BN000514 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 46 Kết so sánh trình tự amino acid protein suy diễn từ gen Cystatin 10 hai mẫu ngô BG, HG với CB2, MX4 BN000514 đƣợc trình bày qua hình 3.9, bảng 3.9 bảng 3.10 Hình 3.9 Trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin 10 hai mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 BN000514 GenBank Kết thể hình 3.9 cho thấy trình tự chuỗi polypeptide có sai khác vị trí (17, 37, 59, 68, 69, 76, 84, 118) có đột biến amino acid số vị trí, cụ thể là: Tại vị trí 24, 25, 26, 27 bốn mẫu BG, HG, CB2, MX4 bị đột biến bốn amino acid (P, A, A, A) so với BN000514; Tại vị trí 88, 89, 90 có mẫu BG HG bị đột biến ba amino acid (G, G, G) so với BN000514; Tại vị trí 90 có mẫu CB2 bị đột biến amino acid (G) so với BN000514; Tại vị trí 122 có mẫu MX4 bị đột biến amino acid (G) so với BN000514 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 47 Bảng 3.9 Sự sai khác trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin10 hai mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 BN000514 GenBank Mẫu Vị trí BN000514 HG CB2 BG MX4 17 A A A A G 37 G G E G G 59 P R R R R 68 Q P Q Q Q 69 E D E E E 76 A S D A E 84 E E D E E 118 E K K E E Kết thể bảng 3.9 cho thấy trình tự amino acid protein Cystatin 10 hai mẫu nghiên cứu (BG, HG) có sai khác so với mẫu CB2, MX4 BN000514, cụ thể là: Trình tự amino acid BG sai khác với trình tự amino acid BN000514 vị trí 59, sai khác với trình tự amino acid CB2 vị trí (37, 76, 84, 118), sai khác với trình tự amino acid MX4 vị trí (17, 76) Trình tự amino acid HG sai khác với trình tự amino acid BN000514 vị trí (59, 68, 69, 76, 118), sai khác với trình tự amino acid CB2 vị trí (37, 68, 69, 76, 84), sai khác với trình tự amino acid MX4 vị trí (17, 68, 69, 76, 118) Nhƣ vậy, sai khác trình tự amino acid BG với trình tự amino acid BN000514, CB2, MX4 (7 vị trí sai khác) so với sai khác trình tự amino acid HG với trình tự amino acid BN000514, CB2, MX4 (15 vị trí sai khác) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 48 Kết thể bảng 3.9 cho thấy điều đ c biệt vị trí 118, hai giống ngô kháng mọt tốt (HG, CB2) có trình tự amino acid K, hai giống ngô kháng mọt (BG, MX4) có trình tự amino acid E Do đó, khả kháng mọt tốt liên quan đến trình tự amino acid vị trí Bảng 3.10 Hệ số tƣơng đồng trình tự amino acid mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 BN000514 GenBank Mẫu BN000514 BG HG CB2 MX4 BN000514 100 94,8 92,2 94,1 95,4 100 97,2 96,6 96,6 100 95,3 94,0 100 96,0 BG HG CB2 MX4 100 Kết thể bảng 3.10 cho thấy hệ số tƣơng đồng mẫu BG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 94,8%, 96,6%, 96,6%; hệ số tƣơng đồng mẫu HG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 92,2%, 95,3%, 94,0% Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I Kết luận Đã xác định đƣợc mức độ kháng mọt giống ngô nghiên cứu Trong đó, giống có khả kháng mọt tốt HG giống có khả kháng mọt BG Đã phân lập xác định đƣợc trình tự gen Cystatin 10 mẫu ngô HG BG với kích thƣớc 447 bp Hệ số tƣơng đồng trình tự nucleotide gen Cystatin10 mẫu nghiên cứu 98,6% Hệ số tƣơng đồng trình tự nucletide mẫu BG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 95,0%, 96,6%, 96,9%; hệ số tƣơng đồng mẫu HG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 93,8%, 96,6%, 96,0% Trình tự amino acid suy diễn từ protein Cystatin10 mẫu nghiên cứu có độ tƣơng đồng 97,2% Hệ số tƣơng đồng trình tự amino acid suy diễn từ protein Cystatin10 mẫu BG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 94,8%, 96,6%, 96,6%; hệ số tƣơng đồng mẫu HG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 92,2%, 95,3%, 94,0% II Đề nghị Tiếp tục thiết kế vector phục vụ chuyển gen để tạo đƣợc giống ngô có khả kháng mọt tốt Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Văn Chƣơng (2000), Khảo sát trạng chất lượng ngô huyện vùng núi cao phía Bắc tỉnh Hà Giang số biện pháp thích hợp giảm tổn thất sau thu hoạch, Báo cáo kết nghiên cứu khoa học, Sở Khoa học Công nghệ Hà Giang Đƣờng Hồng Dật (2004), Cây ngô: kỹ thuật thâm canh tăng suất, NXB Lao động - Xã hội Đƣờng Hồng Dật (2006), Sâu bệnh hại ngô, lương thực trồng cạn biện pháp phòng trừ, NXB Lao động - Xã hội Lê Doãn Diên (1995), Sử dụng kỹ thuật công nghệ sinh học để bảo quản, chế biến nông sản sau thu hoạch, NXB Nông nghiệp Trƣơng Văn Đích, (2005), Kĩ thuật trồng ngô suất cao, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Xuân Hiển (1972), Một số kết nghiên cứu ngô, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Mai Lề, Bùi Đức Hợi, Lƣơng Hồng Nga, Phạm Văn Hùng, (2009), Công nghệ bảo quản lương thực, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr: 28 – 36 Bùi Công Hiển (1995), Côn trùng hại kho, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Hà Quang Hùng (2005), Giáo trình Kiểm dịch thực vật dịch hại nông sản sau thu hoạch, NXB Nông nghiệp 10 Dƣơng Thị Hồng Khánh (2015), “Xác định trình tự gen Cystatin10 giống ngô có khả kháng mọt khác nhau”, Khóa luận tốt nghiệp Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 51 11 Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2000), Giáo trình lương ngô, NXB Nông nghiệp 12 Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học sinh học, NXB ĐHQG Hà Nội 13 Trần Văn Minh, (2008), Cây ngô nghiên cứu sản xuất, NXB nông nghiệp, Hà Nội 14 Ngô Hữu Tình (1997), Cây ngô, NXB nông nghiệp 15 Ngô Hữu Tình (2003), Cây ngô, NXB Nghệ An 16 Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA, tập II, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ 17 Vì Thị Xuân Thủy, Hồ Mạnh Tƣờng, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2014), “Tách dòng gen Cystatin2 phân lập từ số mẫu ngô địa phƣơng Việt Nam”, Tạp chí sinh học, 36(1): 110-117 18 Vũ Thị Thu Thủy (2011), “Tạo dòng chịu hạn phân lập gen Cystatin liên quan đến tính chịu hạn lạc”, Luận án tiến sĩ sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên 19 Phòng Kiểm dịch thực vật - Cục Bảo vệ thực vật (2003), Thành phần côn trùng hại kho Việt Nam năm 1996 - 2000, số ứng dụng bảo vệ thực vật vào sản xuất nông nghiệp, NXB Nông nghiệp 20 Vũ Quốc Trung (1981), “Sâu hại nông sản kho phòng trừ”, NXB Nông Nghiệp Hà Nội 21 Nguyễn Thị Giáng Vân (1996), Thành phần côn trùng kho Việt Nam, Báo cáo kết nghiên cứu khoa học, Cục Bảo vệ thực vật 22 Nguyễn Kim Vũ (2000), Báo cáo tổng kết khoa học công nghệ đề tài KH 08-12, Bộ Khoa học Công nghệ Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 52 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 23 Abe M., Arai S (1991), “Some properties of a cystein proteinase inhibitor from corn endosperm’’, Agricultural and biological chemistry, 55(9), pp 2417- 2418 24 Adeniala S O., José X F., Sales M P.(2003), "Cysteine proteinases and cystatins", Braz arch biol technol, 46 (1), pp 99-104 25 Barrett, A J (1994) "Classification of peptidases", Methods Enzymol 244, pp 1–15 26 Bode W., Engh R., Musil D., Thiele U., Huber R.,Karshnikov A., Brzin J., Kos J & Turk V (1990), " Mechanism of interaction oF cysteine ptoteinases and their protein inhibitors as compared to the serine proteinase inhibitor interaction", Biol Chem Hoppe-Seyler, 371, pp 111-118 27 Bolter C.J (1993), “Methyl jasmonate induces papain inhibitors in tomato leaves’’, Plant physiol, 103, pp 1347- 1355 28 Chou W.M., Shigaki j., Dammann C., Liu J Q., Bhattachamy M.K (2004), “Inhibiton of pathogenesis- related genes in soybean plant biology’’, 6, pp 664- 672 29 David R (2004), Insects stored products CSIRO Australia 30 Fernsndes K.V.S., Paolo a., sabelli P.a., Barratt D.H.P., Richardson., Xavier- Filho J., Shewry P.R (1993), “The resistance of coepea seeds to bruchid beetle is not related to levels of cystein protease inhibitors’’, Plant mlercular biology, 23(1), pp 215- 219 31 James A O., Adebayo A O (2012), "Rearing the Maize Weevil, Sitophilus zeamais, on an Artificial Maize - Cassava Diet", J Insect Sci, 12 32 Koiwa H, Shade RE, Zhu- Salzman K, Subramanian L, Murdock Ll, Nielsen SS, Bressan RA, Hasegawa PW (1998), “Phage display selection can differentiate insecticidal activity of soybean cystatin’’, Plant J, 14(3), pp 371- 379 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 53 33 Kuschel G (1961), "On problem of synonymy in the Sitophyllus oryzae complex (30th contribution, Col Curculionidea)", Annals and Magazine of Nature History, 13(4), pp 241-244 34 Melo F.R., Rigden D.J., Franco O.L., Mello L.V., Ary M.B., Grossi de Sá M.F., Bloch C Jr (2002), "Inhibition of trypsin by cowpea thionin: characterization, molecular modeling, and docking", Proteins, 48(2), pp:311–319 35 Mikami A Y., Carpentieri P V., Ventura M U (2012), "Resistance of maize landraces to the maize weevil Sitophilus zeamais Motsch.(Coleoptera: Curculionidae)." Neotrop Entomol, 41 (5), 404-8 36 Mwololo J.K., Mugo S., Okori P., Tefera T., Otim M., Munyiri S.W., (2012), “Sources of Resistance to the Maize Weevil Sitophilus zeamains in Tropical Maize”, Journal of Agricultural Science, 4(11): 206 – 215 37 Ojima A., Shiota H., higashi K., Shimma Y., Uwada M., Satoh S (1997), “An extracularin soluble inhibitor of cysteine proteinase in cell cultrures and seed Carrot’’, Plant molecular biology, 34, pp 99- 109 38 RamanjuluS., Bartels D (2002), “Drought- and desiccation- induced modulation of gene expression in plant’’, Plant cell and environment, 25(2), pp 141- 151 39 Rawlings, N D & Barrett, A J (1999) "MEROPS:The peptidase database", Nucleic Acids Res, 27, pp 325–331 40 Ryan S.N., Mc Manus M.J., Laiing W.A (2003), “Indentification and characterization of proteinase inhibitor and their gen from seeds of apple (malus domestica)’’, Japanese Biochemical society, 134(1), pp 31- 42 41 Sambrook J., Russel D.W (2001), Molecular cloning, A laboratory manual, Vol 2, Third edition, CSHL Press, pp:8.1-8.24 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 54 42 Shu-Guo FAN, WU G J (2005), "Characteristics of plant proteinase inhibitors and their applications in combating phytophagous insects", Bot Bull Acad Sin, 46, 273-92 43 Snelson J.T (1987), Grain protectants, ACIAR Monographs Series 3, Australian Centre for International Agricultural Research 44 Waldron C., Uwegrich L.M., Merlo P.A.O, Walsh J A (1993), Characterization of a genemic sequence coding for potato multicystatin, An eight- domain cysteine proteinase inhibitor”, Plant molecular biology, 23(4), pp.801- 812 45 Zhang X., Liu S., Takano T (2008), “Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidposis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance’’, Plant Moll Biol, 68(1-2) TÀI LIỆU TRANG WEB 46 www.cpv.org.vn 47 http://www.ctu.edu.vn 48 http://faostat.fao.org/ 49 www.mard.gov.vn 50 http://www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/AF45439 51 http://old.padil.gov.au/pbt/index.php?q=node/70&pbtID= 217 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ... Phân lập gen Cystatin 10 liên quan ến khả kháng mọt số giống ngô Mục tiêu nghiên cứu Phân lập xác định đƣợc trình tự gen Cystatin 10 hai giống ngô (kháng mọt tốt kháng mọt kém) Nội dung nghiên... KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HƯỜNG PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC... Thu thập đánh giá khả kháng mọt số giống ngô - Nhân gen, tách dòng xác định trình tự gen Cystatin 10 hai giống ngô kháng mọt tốt kỹ thuật RT-PCR - So sánh trình tự gen Cystatin 10 nghiên cứu với