Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hai loài tầm gửi

Header Page of 148 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ XUÂN GIANG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HAI LOÀI TẦM GỬI TAXILLUS CHINENSIS (DC.) DANS VÀ MACROSOLEN TRICOLOR (L.) DANS TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Chuyên ngành : DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN Mã số : 62.72.04.06 Hà Nội, năm 2014 Footer Page of 148 Header Page of 148 Công trình hoàn thành tại: - Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội - Viện Hóa học, Viện Hóa sinh biển, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: GS., TS Phạm Thanh Kỳ Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Trường Đại học Dược Hà Nội vào hồi ngày tháng Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội Footer Page of 148 năm Header Page of 148 A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Họ Tầm gửi họ lớn gồm khoảng 40 chi, 1400 loài phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, số vùng ôn đới Thành phần hóa học họ Tầm gửi có nhiều lớp chất có hoạt tính sinh học flavonoid, hợp chất phenolic pentacyclic triterpen, coumarin, saponin, acid hữu cơ, chất béo, đường khử, steroid, polysaccharid… Cho đến công bố thành phần hóa học tác dụng sinh học loài tầm gửi giới Để góp phần tìm hiểu thành phần hóa học số tác dụng sinh học số loài tầm gửi dùng theo kinh nghiệm dân gian số địa phương, thực đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học tác dụng sinh học hai loài tầm gửi Taxillus chinensis (DC.) Dans Macrosolen tricolor (L.) Dans.” Mục tiêu luận án - Mô tả đặc điểm thực vật, thẩm định tên khoa học, xác định đặc điểm vi học loài tầm gửi ký sinh Gạo (Taxillus chinensis (DC.) Dans.) loài tầm gửi ký sinh Na (Macrosolen tricolor (L.) Dans.) - Nghiên cứu thành phần hóa học loài tầm gửi - Xác định độc tính cấp số tác dụng sinh học (tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, tác dụng chống viêm, tác dụng ức chế số dòng tế bào ung thư) loài tầm gửi Những đóng góp luận án 3.1 Về thực vật Đã xác định tên khoa học loài tầm gửi nghiên cứu mô tả chi tiết đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi học loài 3.2 Về hóa học Đã chiết xuất, phân lập từ loài nghiên cứu 13 hợp chất tất xác định cấu trúc hóa học Trong đó, có hợp chất Footer Page of 148 Header Page of 148 lần đầu phân lập từ tự nhiên, hợp chất lần phân lập từ chi Taxillus, hợp chất lần phân lập từ chi Macrosolen, hợp chất lần phân lập từ loài Taxillus chinensis kí sinh Gạo hợp chất từ loài Macrosolen tricolor ký sinh Na 3.3 Về tác dụng sinh học - Không xác định LD50 dịch chiết tầm gửi loài Taxillus chinensis kí sinh Gạo Macrosolen tricolor ký sinh Na với liều cao cho chuột uống (300g/kg thể trọng chuột) - Đã chứng minh cao lỏng tầm gửi Taxillus chinensis kí sinh Gạo Macrosolen tricolor ký sinh Na có tác dụng bảo vệ gan qua việc hạn chế tăng trọng lượng gan, hạn chế tăng hoạt độ enzym AST, ALT hạn chế tổn thương đại thể vi thể gan Cao lỏng tầm gửi Taxillus chinensis có tác dụng chống oxy hóa qua việc làm giảm hàm lượng MDA - Cao lỏng tầm gửi Taxillus chinensis ký sinh Gạo Macrosolen tricolor ký sinh Na có tác dụng chống viêm cấp thông qua việc làm giảm thể tích chân chuột, giảm số lượng dịch rỉ viêm, giảm hàm lượng protein dịch rỉ viêm, giảm số lượng bạch cầu dịch rỉ viêm - Đã chứng minh hợp chất phân lập từ tầm gửi Taxillus chinensis ký sinh Gạo quercitrin, catechin, quercituron có hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH, hợp chất (24s) - 24 - Ethylcholesta 5, 22 (E), 25 - trien - 3β - ol hoạt tính chống oxy hóa hợp chất hoạt tính gây độc tế bào với dòng tế bào ung thư thử nghiệm (Hep-G2,Lu,RD) Những kết thông báo tác dụng sinh học loài tầm gửi nghiên cứu Ý nghĩa luận án Footer Page of 148 Header Page of 148 - Xác định tên khoa học loài tầm gửi nghiên cứu giúp cho kết nghiên cứu hóa học tác dụng sinh học khẳng định rõ nguồn gốc - Xác định đặc điểm vi học góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu - Kết nghiên cứu thành phần hóa học phát chất lần phân lập từ tự nhiên, hợp chất lần phân lập từ chi Taxillus chi Macrosolen nói chung loài Taxillus chinensis, Macrosolen tricolor nói riêng - Kết nghiên cứu độc tính cấp tác dụng sinh học góp phần giải thích kinh nghiệm sử dụng người dân địa phương sở khoa học mở triển vọng nghiên cứu đầy đủ để sử dụng rộng rãi dược liệu cộng đồng Bố cục luận án Luận án có 136 trang, gồm chương, 37 bảng, 28 hình Bố cục gồm phần: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan (32 trang); Nguyên vật liệu, trang thiết bị phương pháp nghiên cứu (19 trang); Kết nghiên cứu (60 trang); Bàn luận (20 trang); Kết luận kiến nghị (3 trang) Danh mục công trình công bố liên quan đến luận án (1 trang) Luận án có 123 tài liệu tham khảo (10 trang) 18 phụ lục B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương TỔNG QUAN Đã tổng hợp phân tích vị trí phân loại họ Tầm gửi (Loranthaceae) Tập hợp trình bày cách hệ thống kết nghiên cứu từ trước tới thực vật, thành phần hóa học tác dụng sinh học, công dụng chi Taxillus chi Macrosolen giới Việt Nam Chương NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu Footer Page of 148 Header Page of 148 - Tầm gửi ký sinh Gạo thu hái vào tháng 5- năm 2007- 20082009 Tam Nông (Phú Thọ) Tầm gửi ký sinh Na thu hái vào tháng năm 2008, 2009 Kim Bôi (Hòa Bình) - Các hóa chất thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định Dược điển Việt Nam IV - Chuột nhắt trắng chủng Swiss, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột cống trắng chủng Wistar, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Học viện Quân y cung cấp - Các dòng tế bào ung thư phòng sinh học thực nghiệm viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam cung cấp 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Thẩm định tên khoa học mẫu nghiên cứu dựa sở phân tích đặc điểm hình thái, thực vật, đối chiếu với khóa phân loại tiêu mẫu chuẩn lưu phòng tiêu - Xác định đặc điểm vi phẫu lá, thân đặc điểm bột dược phương pháp hiển vi - Định tính nhóm chất hữu phản ứng hoá học - Định lượng chất phân đoạn ethylacetat theo phương pháp cân - Phân lập hợp chất sắc ký cột dùng silicagel pha thường (0,040-0,063mm, Merk), silicagel pha đảo YMC-RP-18, Dianion HP20, theo dõi phân đoạn SKLM - Nhận dạng chất phân lập dựa vào độ chảy, liệu phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều, hai chiều, kết hợp đối chiếu với tài liệu công bố - Thử độc tính cấp theo quy định 371 Bộ Y tế phương pháp cải tiến Litchfied – Wilcoxon - Thử tác dụng chống oxy hoá invitro hệ DPPH - Thử tác dụng bảo vệ gan mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm Paracetamol (PAR) Footer Page of 148 Header Page of 148 - Thử tác dụng ức chế viêm cấp mô hình gây phù chân chuột mô hình gây viêm màng bụng - Thử tác dụng ức chế viêm mạn mô hình gây u hạt thực nghiệm amiant - Thử hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp Likhiwitayawuid cộng - Các số liệu thực nghiệm xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis Microsoft Excel Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết nghiên cứu thực vật 3.1.1 Kết nghiên cứu đặc điểm thực vật tầm gửi Gạo * Đặc điểm hình thái thẩm định tên khoa học: Đã mô tả chi tiết đầy đủ phận quan dinh dưỡng (thân, lá), quan sinh sản (hoa, quả, hạt), đối chiếu với khóa phân loại so sánh với tiêu mẫu lưu Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Bách thảo thực vật trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, GS TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn định tên khoa học tầm gửi ký sinh Gạo Taxillus chinensis (DC.) Dans, thuộc họ Loranthaceae * Đặc điểm vi phẫu thân Đã tiến hành cắt, tẩy, nhuộm kép, quan sát kính hiển vi mô tả chi tiết vi phẫu thân, tầm gửi Gạo * Đặc điểm bột dược liệu Bột màu vàng lục nhạt, không mùi, không vị, mảnh bần cấu tạo tế bào hình đa giác Mảnh biểu bì mang lỗ khí Mảnh mô mềm tế bào hình đa giác thành mỏng Tế bào sợi đứng riêng lẻ hay tụ tập thành bó Mảnh mạch thường thấy mạch hình mạng mạch xoắn Tinh thể calci oxalat hình khối Hạt phấn hoa hình ba góc Lông che chở đa bào hình 3.1.2 Kết nghiên cứu đặc điểm thực vật tầm gửi Na * Đặc điểm hình thái thẩm định tên khoa học: Footer Page of 148 Header Page of 148 Đã mô tả chi tiết đầy đủ phận quan dinh dưỡng (thân, lá), quan sinh sản (hoa, quả, hạt), đối chiếu với khóa phân loại so sánh với tiêu mẫu lưu, PGS TS Vũ Xuân Phương, Ths Nguyễn Thế Cường Viện Sinh thái Tài nguyên Thực vật; TS Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội giám định tên khoa học là: Macrosolen tricolor (Lecomte) Danser, Loranthaceae * Đặc điểm vi phẫu thân Đã tiến hành cắt, tẩy, nhuộm kép, quan sát kính hiển vi mô tả chi tiết vi phẫu thân, tầm gửi Na * Đặc điểm bột dược liệu: Bột màu vàng lục nhạt, không mùi, không vị Mảnh bần cấu tạo tế bào hình đa giác xếp thành nhiều lớp chồng lên Mảnh biểu bì mang lỗ khí Mảnh mô mềm tế bào hình đa giác thành mỏng Tế bào sợi đứng riêng lẻ hay tụ tập thành bó Mảnh mô mềm mang tinh thể calci oxalat Mảnh mạch thường thấy mạch hình mạng mạch xoắn Tinh thể calci oxalat hình khối 3.2 Kết nghiên cứu thành phần hoá học 3.2.1 Định tính nhóm chất hữu Trong tầm gửi Gạo có: flavonoid, tanin, coumarin, acid hữu cơ, chất béo, đường khử, steroid, polysaccharid, riêng có saponin steroid Trong tầm gửi Na có flavonoid, tanin, coumarin, chất béo, đường khử, steroid, polysaccharid, caroten, riêng có saponin triterpenoid 3.2.2 Định lượng phân đoạn chiết ethylacetat Hàm lượng chất phân đoạn chiết ethylacetat tầm gửi Gạo 0,9527% tầm gửi Na 0,3589% 3.2.3 Chiết xuất phân lập hợp chất Từ loài Taxillus chinensis (DC.) Dans ký sinh Gạo phân lập 10 chất, ký hiệu TGGT1, TGGT2, TGGT3, TGGT5, TGGT7, TGGT8, TGGT9, TGGT10, TGGT12, TGGT13 Footer Page of 148 Header Page of 148 Từ loài Macrosolen tricolor (L.) Dans ký sinh Na phâp lập chất, ký hiệu MT4A, MT5C1, MT2E1 3.2.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập - Hợp chất TGGT1: thu dạng bột màu vàng đặc trưng hợp chất flavonoid, nhiệt độ nóng chảy 182-1850C Phổ ESI-MS có pic [M + Na]+ : 471m/Z; [M-H]- : 447m/Z, cho biết M = 448, tương ứng với công thức phân tử C21H20O11 Phổ 1H-NMR TGGT1 xuất tín hiệu proton vòng thơm hai proton xác định vị trí metha proton lại xác định thuộc vào vòng thơm Thêm vào đó, tín hiệu proton anomer xuất δ 5,37 (1H, d, J = 1,5 Hz), tín hiệu nhóm methin gắn với nhóm hydroxyl xuất 4,25 (1H, dd, J = 1,5, 3,0 Hz), 3,78 (1H, d, J = 1,5, 8,5 Hz), 3,44(m), 3,32(m) tín hiệu nhóm methyl gắn với gốc đường δH 0,96 (3H, d, J = 6,5 Hz) gợi ý cho xuất phân tử đường rhamnose Phổ 13C-NMR TGGT1 xuất tín hiệu 21 carbon, có carbon thuộc vào phân tử đường Phổ DEPT cho thấy cấu trúc TGGT1 có nhóm CH3, 10 nhóm CH có 10 carbon bậc Căn vào điểm nóng chảy, số liệu phổ MS, 1H- NMR, 13C-NMR, DEPT so với tài liệu công bố, cho phép khẳng định hợp chất TGGT1 quercitrin (3-O-α-LRhamnopyranosid quercetin) (hình 4.1) - Hợp chất TGGT2: thu dạng bột màu vàng đặc trưng hợp chất flavonoid, nhiệt độ nóng chảy 172- 174°C Phổ ESI- MS: m/z 455 [M+Na]+, m/z 431 [M-H]- → M= 432, tương ứng với công thức phân tử C21H20O10 Phổ ESI-MS xuất tín hiệu phần aglycon TGGT2 bị phân tử đường rhamnose m/z 309 [M+Na-Rha]+, m/z 285 [M-H-Rha]- Căn vào nhiệt độ nóng chảy, số liệu phổ ESI- MS, 1H- NMR, 13 C-NMR, DEPT so với tài liệu công bố cho thấy hợp chất TGGT2 3-O-α-L-rhamnopyranosid kaempferol (kaempferin) hay gọi afzelin, hợp chất phân lập từ nhiều loài Footer Page of 148 Header Page 10 of 148 thực vật khác nhau, nhiên công bố afzelin có tầm gửi Gạo (hình 4.1) Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR hợp chất TGGT2 * a, b * DEPT Vị trí C C Ca, c Ha, d Mult., (J in Hz) Aglycone: 159,5 159,20 C 135,1 136,18 C 178,6 179,55 C 163,1 163,13 C 100,4 100,07 CH 6,21 br s 166,4 166,72 C 95,2 94,93 CH 6,38 br s 158,9 158,57 C 10 105,0 105,53 C 1′ 123,0 122,75 C 2′, 6′ 132,3 131,86 CH 7,77 d (8,5) 3′, 5′ 116,0 116,58 CH 6,95 d (8,5) 4′ 161,5 161,54 C 3-O--L-rhamnopyranosyl: 1′′ 103,5 103,53 CH 5,39 d (1,5) 2′′ 72,2 72,23 CH 4,24 dd (1,5, 3,5) 3′′ 72,0 71,01 CH 3,73 dd ( 3,5, 9,0) 4′′ 73,3 73,29 CH 3,70 m 5′′ 71,9 71,93 CH 3,36 dd (3,5, 5,5) 6′′ 17,6 17,62 CH3 0,94 d (5,5) a b c Đo CD3OD-d4, 75,5 MHz, 125 MHz, d500 MHz; *C afzelin - Hợp chất TGGT3: thu dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 175-177oC Phổ ESI-MS cho M=290 tương ứng với công thức phân tử C15H14O6 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 4,59 (1H, d , J = 2,5 Hz, H-2), 4,01 (1H, m, H-3), 2,53 (1H, dd, J = 8,0, 16,0 Hz, Ha-4), 2,88 (1H, dd, J = 5,5, 16,0 Hz, Hb-4), 5,95 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), 5,89 (1H, d, J = 2,5Hz, H-8), 6,86 (1H, d, J = 2,0Hz, H-2'), 6,78 (d, J = 8,0 Hz, H-5'), 6,86 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6') Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 82,76 (C-2), 68,75 (C-3), 28,40 (C-4), 156,85 (C-5), 96,32 (C-6), 157,74 (C-7), 95,53 (C-8), Footer Page 10 of 148 Header Page 13 of 148 Phổ 1H-NMR (500MHz CDCl3), δH (ppm): 5,37 (brd, J = 5.1 Hz, H-6), 3,54 (tt, J = 5.1, 11.7Hz, H-3), 0,68 (3H, s, H-18), 1.01 (3h, s, H19), 0,92 (3H, d, J = 6,5Hz), 0,83 (3H, d, J = 7,3 Hz, H-26), 0.81 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-27), 0.84 (3H, t, J = 7.5Hz, H-29) Phổ 13C-NMR (125 MHz CDCl3), δC (ppm): 37.67 (t, C-1), 32,05 (t, C-2), 72.19 (d, C3), 42.70 (t, C-4), 141.17 (s, C-5)122,50 (d, C-6), 32,32 (t, C-7), 32,32 (d, C-8), 50.55 (d, C-9), 36,91 (s, C-10), 21.49 (t, C-11), 40.19 (t, C12), 42.73 (s, C-13), 57.18 (d, C-14), 24.71 (t, C-15), 28.65 (t, C-16), 56.48 (d, C-17), 12.26 (q, C-18), 19.79 (q, C-19), 36.55 (d, C-20), 19.18 (q, C-21), 34.36 (t, C-22), 26.51 (t, C-23), 46.25 (d, C-24), 29.57 (d, C-25), 20.24 (q, C-26), 19.44 (q, C-27), 23.48 (t, C-28), 12.39 (q, C-29) So sánh số liệu phổ 13C-NMR TGGTT8 với β-sitosterol trùng khớp Dựa vào phân tích số liệu phổ nêu với kết phổ khối lượng ESI-MS m/z [M + Na]+ 437 tương ứng với công thức phân tử C29H50O (M=414) hợp chất TGGT8 nhận dạng βsitosterol (hình 4.1) - Hợp chất TGGT9: thu dạng hợp chất dầu không màu Phổ khối ESI-MS cho M=296 tương ứng với công thức phân tử: C20H40O Phổ 1H-NMR có xuất nhóm methyl, nhóm methilen carbon không no mạch dài nhóm oximethilen Phổ 13CNMR cho thấy TGGT9 ditecpen xuất tín hiệu 20 carbon, có nhóm CH3 , 10 nhóm CH2 , nhóm CH carbon bậc Các số liệu phổ NMR TGGT9 gợi ý tới chất trans-phytol So sánh số liệu phổ NMR TGGT9 với tài liệu phổ công bố thấy trùng khớp hoàn toàn giá trị phổ NMR vị trí tương ứng cho phép khẳng định cấu trúc hóa học TGGT9 trans-phytol (hình 4.1) - Hợp chất TGGT10: thu dạng chất lỏng màu vàng Trên phổ 1H-NMR xuất tín hiệu vòng benzoquinon, tín hiệu ba nhóm methyl, tín hiệu nhóm oximethyl Trên phổ 13CNMR cho thấy xuất tín hiệu 29 carbon, xuất tín hiệu nhóm ceton, tín hiệu hai cặp nối đôi nội vòng, tín hiệu Footer Page 13 of 148 Header Page 14 of 148 nhóm methyl, tín hiệu 11 nhóm methilen, tín hiệu carbon bậc Căn vào số liệu phổ phân tích so sánh với số liệu phổ công bố hợp chất TGGT10 nhận dạng α-tocopherolquinon (hình 4.1) - Hợp chất TGGT12: Qua nghiên cứu phổ 13CCPD DEPT nhận rõ đặc điểm cấu trúc có chứa đường glucose vòng 13C đường có lẫn nhóm –CH2-O nhóm CH-O- Ngoài thấy rõ TGGT12 chứa gốc acid Như cấu trúc gốc TGGT12 glucosid Để khẳng định cấu trúc dạng hợp chất cần xác định rõ độ dài mạch R1, R2, số nối đôi có mạch phân bố nối đôi Kết hợp với phổ MS hoàn toàn xác định công thức phân tử TGGT12 C43H70O10 Kiểm tra lại dự báo số carbon cách chi tiết phổ 13C HSQC thấy kết xác Để định vị vị trí nối đôi nhánh, đặc trưng “đối xứng” nêu phổ phân tích chi tiết đặc biệt quan tâm tới dạng phổ proton tương quan HMBC Số liệu chứng minh cấu trúc đặc điểm dịch chuyển hóa học 43 carbon xác định chi tiết toàn pic tương quan C→H phổ HMBC phù hợp với cấu trúc xác định Căn vào số liệu phổ phân tích, hợp chất TGGT12 xác định Glycerol-1-(6,9,12hexadecatrienoat) -2-(8,11,14octadecatrienoat) -3-O-β-Dgalactopyranosid (hình 4.1) - Hợp chất TGGT13: Bộ phổ NMR hợp chất TGGT13 bao gồm phổ 1H, 13CCPD, DEPT, HSQC HMBC Bộ phổ hợp chất TGGT13 cho thấy vùng không bị chèn lấp nhận từ phổ 13C.CPD DEPT tín hiệu: hai carbon bậc Có thể dễ dàng nhận thấy carbon acid, sáu carbon olefin Qua phổ HSQC nhận rõ rệt vùng proton tương ứng gồm proton Vùng 105 đến 60 ppm vùng có đặc trưng rõ nét độ phân giải tốt bao gồm pic CH pic -CH2- (9 pic), vùng dễ nhận dạng có mặt Footer Page 14 of 148 Header Page 15 of 148 đường o-β-D-galactose gồm nhóm -CH-O- nhóm -CH2-OH Điều đáng ý vùng có mặt nhóm -CH-O- nhóm CH2-O- khác Để thẩm định cấu trúc gán xác vị trí phổ HMBC phân tích chi tiết sở liệu thu từ phổ 1H, 13C HSQC Các tín hiệu tương quan xuất HMBC hoàn toàn phù hợp Căn liệu phổ phân tích, hợp chất TGGT13 nhận dạng Glycerol-1-(9-hexadecane noat)-2-(9, 12-octadecadienoat)-3-O-β-D-galactopyranosid (hình 4.1) - Hợp chất MT4A: Phổ 1H- NMR 13C- NMR hợp chất MT4A đặc trưng cho hợp chất triterpenoid Phổ 1H-NMR MT4A xuất tín hiệu proton methin, vị trí 1,18 xuất tín hiệu chồng lấp đặc trưng mạch dài Trên phổ 13C- NMR DEPT MT4A thấy xuất tín hiệu nhóm carbonyl, nhóm oximethin, nhóm methyl Điều gợi mở ester hợp chất triterpenoid acid béo mạch dài Các tín hiệu proton gán với tín hiệu carbon tương ứng sở phân tích tương tác nhận phổ HSQC Khi kết hợp với việc phân tích phổ HMBC khẳng định tính xác hợp chất MT4A hợp chất dạng ester béo triterpenoid Tuy nhiên, so sánh số liệu phổ 13C- NMR hợp chất MT4A với hợp chất loranthol thấy số liệu phổ hoàn toàn tương đồng Sự sai khác giá trị cộng hưởng vị trí carbon số loranthol C 78,9 so với 80,26 MT4A gợi ý xuất ester hóa vị trí Điều khẳng định giá trị trùng khớp với giá trị cộng hưởng ester béo triterpenoid C 80,3 Để xác định khối lượng phân tử acid béo, hợp chất MT4A tiến hành đo phổ khối lượng phân giải cao Sự xuất pic ion m/z 282.28130 [M + H – C30H49O2]+ (theo tính toán 282.29227) cho phép xác nhận công thức phân tử nhánh acid béo (C19H37O + H) Từ kết luận hợp chất MT4A 20(29)-lupene-3βnonandecanoyl-7α-ol với công thức phân tử C49H86O3 có khối lượng Footer Page 15 of 148 Header Page 16 of 148 tính toán 722.65770 Đây hợp chất lần phân lập từ tự nhiên - Hợp chất MT5C1: Hợp chất MT5C1 thu dạng bột màu trắng Phổ 1H-NMR MT5C1 xuất tín hiệu proton methin, vị trí 1,25 xuất tín hiệu chồng lấp đặc trưng mạch dài Trên phổ 13CNMR DEPT MT5C1 thấy xuất tín hiệu nhóm carbonyl, nhóm oximetin tín hiệu nối đôi mạch Ngoài ra, có xuất tín hiệu nhóm methyl Điều gợi mở este hợp chất tritecpenoid acid béo mạch dài So sánh số liệu phổ hợp chất MT5C1 với este béo tritecpen cho thấy tương đương liệu phổ Từ khẳng định hợp chất MT5C1 tầm gửi Na este béo tritecpen Để xác định khối lượng phân tử acid béo, hợp chất MT5C1 tiến hành đo phổ khối lượng phân giải cao Sự xuất pic ion m/z 763,68157[M+2H+Na]+ (theo tính toán 766,65803) cho phép xác nhận công thức phân tử C49H86O4 xuất pic ion m/z 282,27731[M+H-C30H49O3] (theo tính toán 282,29227) cho phép xác nhận công thức phân tử nhánh acid béo [C19H37O+H] Từ kết luận hợp chất MT5C1 20(29)-lupene-3βnonandecanoyl-7β,15α-diol Đây hợp chất lần phân lập từ tự nhiên(hình 4.1) - Hợp chất MT2E1: Hợp chất MT2E1: thu dạng bột màu trắng Phổ proton carbon hợp chất đặc trưng cho cho hợp chất dạng triterpenoid có nối đôi nhóm hydroxy Phổ xuất tín hiệu nhóm methyl bậc bốn, tín hiệu nhóm oximethin nhóm CH2 nối đôi vòng Trên phổ 13C- NMR thấy xuất tổng cộng 30 carbon So sánh liệu phổ hợp chất MT2E1 với liệu phổ hợp chất Lupeol (3β-Hydroxylup-20(29)-ene) thấy có trùng khớp số liệu Điều cho phép khẳng định hợp chất Footer Page 16 of 148 Header Page 17 of 148 MT2E1 tầm gửi Na Lupeol (3β-Hydroxylup -20(29)-ene) (hình 4.1) * Cấu trúc hóa học 13 hợp chất: HO 1' O 3' 3' HO 10 OH O O 5'' O 10 5' OH O OH O 1" 6" CH3 3" OH OH Quercitrin (TGGT1) 4" 3" 2" OH OH 5" O CH3 6" 1'' 1' O OH OH OH 5' OH Afzelin (Kaempferin) (TGGT2) Catechin (TGGT3) Quercituron (TGGT5) 26 29 28 22 21 22 24 18 20 23 18 25 24 27 20 17 19 11 13 27 17 28 19 16 14 10 HO HO (24s)-24-Ethylcholesta 5,22 (E), 25-trien-3β-ol (TGGT7) 16 19 18 17 13 11 β-sitosterol (TGGT8) 20 trans-phytol (TGGT9) Footer Page 17 of 148 OH Header Page 18 of 148 O OH 1' 3' 7' 5' 11' 9' 13' 15' O α-tocopherolquinon (TGGT10) Glycerol-1-(6,9,12- hexadecatrienoat)-2- (8,11,14octadecatrienoat)- 3-O-β-D-galactopyranosid (TGGT12) Glycerol-1-(9-hexadecanenoat)-2-(9,12-octadecadienoat)-3-O-β-Dgalactopyranosid (TGGT13) 30 29 20 H 19 21 22 12 11 25 13 23 28 15 27 O 17 16 10 1' 19 ' 13 14 O 26 18 24 OH 20(29)-lupene-3β-nonandecanoyl-7α-ol (MT4A) (mới) Footer Page 18 of 148 Header Page 19 of 148 20(29)-lupene-3β-nonandecanoyl-7β, 15α-diol (MT5C1) (mới) 3β-Hydroxylup-20(29)-ene (Lupeol) (MT2E1) Hình 4.1 Cấu trúc hóa học 13 hợp chất 3.3 Kết nghiên cứu độc tính cấp tác dụng sinh học 3.3.1 Thử độc tính cấp Cho lô chuột nhắt uống dịch chiết tầm gửi Gạo, tầm gửi Na với liều tăng dần đến liều 300g dược liệu/kg thể trọng chuột triệu chứng biểu ngộ độc hành vi hoạt động tự nhiên, hô hấp tiêu hoá thí nghiệm chuột chết nên không xác định LD50 3.3.2 Thử hoạt tính chống oxy hoá Kết nghiên cứu cho thấy hợp chất TGGT1 (Quercitrin), TGGT3 (Catechin), TGGT5 (Quercituron) tầm gửi Gạo có hoạt tính chống oxy hoá hệ DPPH với giá trị SC50 40,87; 15,74; 13,31g/ml, hợp chất TGGT7 ((24s)-24-Ethylcholesta 5,22 (E) 25 trien-3β-ol) hoạt tính chống oxy hoá hệ DPPH Kết nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa mô hình gây tăng MDA chuột nhiễm độc PAR cho thấy hàm lượng MDA lô Footer Page 19 of 148 Header Page 20 of 148 chuột uống cao lỏng tầm gửi Gạo liều 30g/kg 60g/kg ngày trước gây độc giảm rõ rệt so với lô uống PAR (p0,05) Hoạt tính chống oxy hóa tầm gửi Na liều 30g/kg 60 g/kg (16,35% 15,87%) thấp so với hoạt tính chống oxy hóa Silymarin liều 70mg/kg (21,15%) 3.3.3 Tác dụng bảo vệ gan Trên mô hình gây độc gan chuột nhắt trắng paracetamol, lô uống thuốc (cả thuốc thử thuốc chứng dương) trọng lượng gan giảm so với lô mô hình, nhiên, khác biệt có ý nghĩa thống kê lô chuột uống cao lỏng tầm gửi Gạo liều 60g/kg tầm gửi Na liều 30g/kg Hoạt độ AST lô mô hình gây độc paracetamol tăng cao rõ rệt so với lô chứng sinh học (p