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Determination of the active ingredient produced in the artificial cultivated cordyceps sobolifera

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DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.02.066 安徽农业科学, Journal of Anhui Agri. Sci. 2008 , 36 ( 2 ) : 429 , 467 责任编辑 姜 丽 责任校对 王 淼 人工培育蝉花的活性成分含量测定 刘森琴 1, 温 鲁 1 *, 夏 敏 2, 蒋 宁 3 ( 1. 淮阴 师范 学院资 源微 生物 研究 所, 江苏 淮安 223300 ; 2. 淮阴 师范 学院分 析测 试中 心, 江 苏淮安 223300 ; 3. 江苏省农业科学院食用菌研究开发中心, 江苏南京 210014) 摘要 [目的 ]明确人工蝉花的活性成分含量。 [方法 ]用微波法提取人工蝉花和野生蝉花的活性成分, 用高效液相色谱法测定虫草素和 腺苷含量, 用高碘酸钠法测定虫草酸含量, 用苯酚 - 硫酸法测定虫草多糖含量。 [结果 ]人工蝉花的虫草酸含量和野生蝉花相当, 虫草多 糖含量则高达 110.09 mg/g; 腺苷含量较野生蝉花低 , 虫草素未能检出, 但 4 种活性成分总量是野生蝉花的 1.55 倍。[结论 ]从活性成分 含量看, 人工蝉花可代替野生蝉花, 但还需进行进一步试验。 关键词 蝉花; 人工培育; 微波提取; 活性成分 中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517- 6611( 2008) 02- 00429- 01 Deter mination of the Active Ingr edient Pr oduced in the Ar tificial Cultivated Cordyceps sobolifera LIU Sen!qin et al (Institute for Resources Microorganism Research, Huaiyin Teachers College, Huai'an, Jiangsu 223300) Abstr act [Objective] The aim of the paper was to ascertain the content of the active ingredient in artificial Cordyceps sobolifera. [Method] The active ingredient of artificial Cordyceps sobolifera and wild Cordyceps sobolifera were extracted with the microwave extraction method. The contents of cordycepin and adenosine were determined with the HPLC method. The content of cordyceps acid was determined with the sodium periodate method. The content of polysaccharide was determined with the phenol!sulfuric acid method. [Result] The content of cordycepin in artificial Cordyceps sobolifera was comparable to wild Cordyceps sobolifera. The content of polysaccharide was about 110.09 mg/g. The content of adenosine in wild Cordyceps sobolifera was higer than that in artificial cultivation. The cordycepin had not been determined, but the total quantity of the 4 kinds of active ingredients was 1.55 times as great as that of wild Cordyceps sobolifera. [Conclusion] From the content of the active ingredient, the artificial Cordyceps sobolifera might replace the wild Cordyceps sobolifera, but it needed to be carried out by the animal experiment and the clinical test. Key wor ds Cordyceps sobolifera; Artificial cultivation; Microwave extraction; Active ingredient 蝉 花 [Cordyceps sobolifera( Hill.) Berk.& Br], 又 名 蝉 蛹 1.1.2 试剂。虫草素和腺苷标准品由上海化学试剂公司进 草、蝉茸、胡蝉、蜩等 , 与 冬 虫 夏 草 和 蛹 虫草 同 属 于 菌 物 界 、 口分装; 磷酸二 氢 钾 、磷 酸氢 二 钾 、四 氢 呋 喃 、 D! 甘 露 醇 、鼠 真菌门、子囊菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属, 能解痉、散 李糖、高碘酸钠、乙酸铵、冰乙酸、乙酰丙酮、葡萄糖、无水乙 风热、退翳障和透疹, 主 治 小 儿惊 风 夜 啼 、咬 牙 、咳 嗽 、咽 喉 醇、苯酚、浓硫酸等, 均为国产分析纯试剂, 试验用水为二次 痈肿等症 [1], 具有滋补强壮、抗疲劳、抗应激、镇静催眠、解热 蒸馏水。 镇痛、改善肾功能等功效 , 是一种传统的虫生药用真菌。我 1.1.3 [2] 仪器。 DHG!9240A 电 热 恒 温 鼓 风 干 燥 箱 , BS224S 电 国古代医药典籍《雷公炮炙论》、 《图经本草》、 《证类本草》和 子 天 平 , KD23B! AE 美 的 微 波 炉 , TDL!5 !A 台 式 离 心 机 , 《本草纲目》均有记载 [2- 3]。其 主 要 活 性 成 分 的 含量 不 亚 于 冬 Waters 高效液相色谱仪, Waters 紫外检测器, 721S 分光光度 虫夏草和蛹虫草, 有着很好的开发利用前景 [3- 4]。 蝉花是蝉拟青霉寄生于蝉科昆虫的若虫在长出子座后 形成的虫菌复合体 。由于蝉的生长周期需要好几年, 同时 [1, 3] 计, 水浴锅, 多功能食品加工机等。 1.2 1.2.1 方法 虫草 素 和 腺 苷 含 量 测 定 。采用 高 效 液 相 色 谱 法 [5]。色 蝉拟青霉的寄生需 要 适 宜 的 气 候 条 件和 生 态 环 境 , 加 上 人 谱柱为 NOVA!PAK C18 反相柱, 3.9 mm×300.0 mm, 4 μm; 流 们连年采集, 致使蝉花资源不断减少, 野生蝉花越来越难寻 动相为 KH2PO4!K2HPO4 + 1 %四氢呋喃缓冲液, pH = 6.86, 流 觅。为解决该问题, 江苏省农业科学院食用菌研究开发中心 量 1 ml/min ; 检测波长 260 nm。虫草素标准曲线的回归方程 在分离获得蝉花纯 种 的 基 础 上 , 进 行 了蝉 花 的 人 工 培 育 研 为: Y= 3.10×106 X- 1.34×104, R2 = 0.999 9; 腺 苷 标准 曲 线 的 究, 已成功培育出人工蝉花, 但人工蝉花主要活性成分的含 回归方程为: Y= 3.55×106 X- 5.72×103, R2 = 0.999 9。式中, Y 量如何, 与野生蝉花相比有何变化, 目前还未见报道。为此, 为色谱峰面积, X 为虫草素或腺苷的进样量 [μg/( 10 μl) ]。 样 品 提 取 采 用 微 波 法 [6]。样 品 中 虫 草 素 或 腺 苷 的 含 量 笔者进行了该研究 , 旨 在 为 人 工 蝉 花 的 进一 步 开 发 利 用 提 供依据。 1 材料与方法 1.1 1.1.1 材料 样品。人工蝉花和野生蝉花由江苏省农业科学院食 ( mg/g) = 10 X, 式 中 , X 的 单 位 由 μg/( 10 μl) 变 换 为 mg/( 10 ml) , 因 样 品 称 取 量 为 0.1 g, 提 取 液 为 10 ml , 故 乘 以 10 后 即变换为 mg/g。 1.2.2 虫草 酸 含 量 测 定 。采 用 高 碘酸 钠 比 色 法 [7]。虫 草 酸 的 用菌研究开发中心提供, 野生蝉花采自南京东郊瓦屋山; 蝉 化学成分为 D! 甘露醇, 准确称取甘露醇标准品 0.500 0 g, 配 花固体培养物由淮 阴 师 范 学 院 资 源 微 生物 研 究 所 培 养 , 菌 成 5 mg/ml 的甘露醇标准溶液, 再稀释成不同浓度的系列标 种由江苏省农业科学院食用菌研究开发中心赠送。 准溶液; 用微量取样器分别取不同浓度的标准溶液 300 μl , 江 苏 省 高 校 自 然 科 学 基 金( 05KJB180010) ; 淮 阴 师 范 学 院 教授基金( 06HSJS027) 。 作者简介 刘 森 琴( 1985- ) , 女 , 江 苏 泰 州 人 , 本 科 , 专 业 : 药 用 真 菌 。 * 通讯作者。 收稿日期 2007! 09!10 基金项目 加 700 μl 蒸馏水, 然后加 1 ml 高碘酸钠试液, 混匀, 室温放 置 10 min, 加 2 ml 0.1 %鼠李糖, 再加 4 ml 新配制的 Nash 试 剂( 用冰乙酸和乙酰丙酮等配制) , 53 ℃水浴 15 min, 用分光 ( 下转第 467 页) 36 卷 2 期 严明建等 栽培密度对不同生育时期水稻品种产量影响的研究 ( 3) P1 的实 粒 数 与 产 量 的 相 关 系数 为 0.958 3 , 达 极 显 467 达 10 281.6kg/hm2, P2 种 植 密 度 22.50 万 窝 /hm2 时 , 总 产 量 著水平, 其次为单位面积有效穗数, 说明该品种对产量影响 居第 1 位, 达 9 631.5 kg/hm2。 最 大的 是 每 穗 实 粒 数 , 其 次 才 是 有 效 穗 数 ; P2 有 效 穗 数 与 参考文献 产 量 的 相 关 系 数 为 0.928 6, 达 极 显 著 水 平 , 其 次 为 每 穗 实 [1] 张强, 李 自超 . 不同 株穗型 水稻 超高 产品 种产量 构成 因素 分析 [J]. 西 南农业学报, 2005 , 18( 5) : 518- 519. [2] 杨惠杰 , 杨仁 崔 . 水 稻超高 产的 决定 因素 [J]. 福 建 农 业 学 报 , 2002 , 17 ( 4) : 199- 203. [3] 陈惠哲 , 朱德 峰 . 稀 植条件 下 杂 交 水 稻 分 蘖 成 穗 规 律 和 穗 粒 结 构 研 究 [J]. 杂交水稻, 2004 , 19( 6) : 51- 54. 粒数, 表明该品种为穗数增产型品种, 增加有效穗数能增加 产量。 ( 4) P1 在 种 植 密 度 为 17.25 万 窝 /hm2 时 产 量 最 高 , !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ( 上接第 429 页) 光度计在 420 nm 处测吸光度, 得甘露醇含量 C 与吸光度 A 的回归方程: C= 0.396 2 A- 0.004 8, R2 = 0.999 9。 样品提取也采用微波法。称取 0.100 0 g 样品, 放入 100 ml 试剂瓶, 加入 25 ml 蒸馏水, 6 瓶 1 组, 置于微波炉中以中 火处理 1 min, 在 4 000 r/min 下离心 10 min, 取上清液 300 μl, 其余操作与标准溶液测定步骤相同。测得吸光度后 , 按回归 方程计算提取液的虫草酸含量。样品中的虫草酸含量( mg/g) =C×25/m, 式 中 , C 为 提 取液 中 虫 草 酸 含 量( mg/ml) , 25 是 样 品提取液体积( ml) , m 为称取样品的质量( g) 。 1.2.3 虫草多糖含量测定。采用苯酚 - 硫酸法 [8]。多糖在酸性 条件下水解成葡萄糖等单糖 , 以 葡 萄 糖 为 标 样 配 制 系列 标 准 溶 液 , 各 取 1.0 ml , 分 别 加 入 5 % 苯 酚 溶 液 1.5 ml , 浓 H2SO4 7.5 ml , 常温显色 30 min, 于 490 nm 处测定吸光度, 得 葡萄糖含量 C 与吸光度 A 的回归方程: C= 0.153 1 A- 0.002 4, R2 = 0.999 1。 采用微波法提取样品中的多糖。称取 0.500 0 g 样品, 放 入 100.0 ml 试剂瓶中 , 加 入 20.0 ml 蒸 馏 水 , 6 瓶 1 组 , 置微 波炉以中火处理 3.5 min, 离 心 , 取出 5.0 ml 上 清 液 , 加 20.0 ml 无 水 乙 醇 , 待多 糖 沉 降 , 离 心 去 除 上 清 液 , 将 沉 淀 晾 干 , 加 热 水 溶 解 , 定 容 至 10.0 ml , 从 中 取 0.1 ml , 用 水 补 足 1.0 ml , 其 余 操 作 与 标 准 溶 液 测 定 步 骤 相 同 。样 品 中 多 糖 含 量 ( mg/g) = C×100×4/m, 式 中 , C 为 0.1 ml 测 试 液 中 多 糖 含 量 ( mg) , 100 是多糖测试液总体积 10.0 ml 与 0.1 ml 取 出 液 的 体积比, 4 为微波提取液总体积 20.0 ml 与醇沉时取出液 5.0 ml 的体积比, m 为称取样品的质量( g) 。 2 结果与分析 虫草多糖 和 虫 草 酸 都 是 虫草 类 药 材 的 主 要 活 性 成分 , 其含量高低是衡量虫草品质的重要依据。腺苷和虫草素也 是虫草的主要活性成分, 但蝉花不是虫草素产生菌( 虫草素 的主要产生菌是蛹虫草) , 其 含 量高 低 不 影 响 蝉 花 的 功 效, 腺苷含量高低则会在一定程度上影响功效。从表 1 可以看 出, 人 工 蝉 花 中 虫 草酸 的 含 量 和 野 生 蝉 花 相当 , 都 在 90.00 mg/g 左 右 , 而 虫 草 多 糖 含 量 则 高 达 110.09 mg/g, 远 高 于 野 生 蝉 花 , 是 野 生 蝉 花 的 2.86 倍 ; 人 工 蝉 花 的 腺 苷 含 量 比 野 生蝉 花 低 , 而 虫 草 素 则 未 检 出 。从 4 种 主 要 活 性 成 分 总 量 来看, 人工蝉花居于绝对优势, 比野生蝉花高出 71.58 mg/g, 是野生蝉花的 1.55 倍。 3 结论与讨论 该研究表 明 , 人 工 蝉 花 主 要活 性 成 分 的 含 量 不 低 于野 生蝉花, 特别是多糖含量很高, 很高的活性成分总量预示其 功效可能会比野生蝉花更好 , 但 这 样 的优 势 能 否 在 功 效 上 表 1 几种蝉花主要活性成分含量 Table 1 Content of main active ingr edients of sever al Cordyceps sobolifera mg/g 虫草素 含量 样品 Sample 人工蝉花 Artificial Cordyceps sobolifera 腺苷含量 虫草酸 含量 虫草多 糖含量 Cordy- Adenosine Cordyceps Cordyceps ceps- acid polysaccha- content content content ride content 总量 Total - 0.74 90.52 110.09 201.35 0.94 1.26 89.13 38.44 129.77 0.20 0.61 27.80 54.62 83.23 野生蝉花 Wild Cordyceps sobolifera 蝉花固体培养物 Solid medium of Cordyceps sobolifera 注: - 表示未检出。 Note : - indicates not detected. 表现出来, 还需进行动物试验和人的临床试验, 为进一步开 发利用提供依据。该研究 只 检 测 了 蝉 花 中 虫草 素 、腺 苷 、虫 草酸和虫草多糖 4 种主要活性成分, 其他成分未作检测, 有 待于进一步研究。 人工蝉花具有不依赖自然条件、培养周期较短、产品质 量有保证、可较大批量生产等优点, 为解决野生蝉花资源短 缺问题提供了新途径。但 人 工 蝉 花 只 有子 座( 子 实 体) 而 无 虫体, 外观上与虫菌复合的野生蝉花有较大区别, 因此不宜 作为药材上市, 可作为有关药品或保健品的加工原料。 蝉花固体培养物是将蝉花菌接种到固体培养基上培养 而获得的, 是蝉花菌丝体、蝉花代谢产物和剩余培养基的混 合物, 与人工蝉花的纯子实体不同( 含有剩余培养基) , 也不 同于野生蝉花的虫菌复合体。从活性成分含量来看, 蝉花固 体培养物不如人工蝉花和野生蝉花高, 但其制备工艺简单、 周 期 较 短 、成 本 较 低 , 如 能 通 过 技 术 手 段 提 高 活 性 成 分 含 量, 也是很有前景的野生蝉花代用品。 参考文献 [1] 敬一兵, 陆鲁生 . 虫草 [M]. 昆明: 云南科学技术出版社, 1986 : 1- 156. [2] 秦 癸 , 陈 红 英 . 蝉 花 的 研 究 概 况 [J]. 基 层 中 药 杂 志 , 2002 , 16( 6) : 54- 55. [3] 王 琪 , 刘 作 易 . 药 用 真 菌 蝉 花 的 研 究 进 展 [J]. 中 草 药 , 2004 , 34( 4) : 469- 471. [4] 温 鲁 , 唐 玉 玲 , 张 平 . 蝉 花 与 有 关 虫 草 活 性 成 份 检 测 比 较 [J]. 江 苏 中 医药, 2006 , 27( 1) : 45- 46. [5] 夏敏, 尹 起范 , 温鲁 , 等 . 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 蛹 虫 草 中 腺 苷 和 虫 草 素 [J]. 理化检验 - 化学分册, 2007 , 43( 5) : 386- 388. [6] 夏 敏 , 温 鲁 . 微 波 法 提 取 虫 草 素 研 究 [J]. 食 品 科 学 , 2006 , 27( 10) : 248- 251. [7] 温鲁, 尹 起范 , 唐玉 玲, 等 . 蚕 虫草 与有 关虫 草活性 成份 检测 比 较 [J]. 食品科学, 2004 , 25( 8) : 155- 157. [8] 来 永 斌 , 王 琦 , 孙 月 . 蛹 虫 草 多 糖 含 量 的 测 定 与 分 析 [J]. 中 成 药 , 2001 , 23( 7) : 517- 518.

Ngày đăng: 08/01/2017, 20:58

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