Xác định phương pháp tối ưu trong nghiên cứu tái sinh và nhân giống cây lan hài (paphiopedilum sp )

1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trên giới, lan hài loài lan khó nhân giống vơ tính nhất, nay, có cơng bố nhân giống vơ tính in vitro thành công đối tượng lan hài Đây lồi lan có giá trị kinh tế cao, số giống lan hài quý có giá 10000 USD/cây giống Paphiopedilum volonteanum Lan hài có đặc tính sinh trưởng phát triển chậm tự nhiên, nhân giống phương pháp tách cụm thường từ - năm thu - từ mẹ tỷ lệ hạt nảy mầm tự nhiên thấp, đó, gặp tự nhiên Hiện nay, để thu với số lượng lớn người ta tiến hành gieo hạt lan hài in vitro Vì vậy, nỗ lực việc nhân giống vơ tính vấn đề đặc biệt quan tâm thách thức đáng kể cho việc nghiên cứu lồi lan khó tính Ở Việt Nam có nhiều loại lan hài quý đặc hữu có giá trị thương mại cao (P delenatii, P callosum, P gratrixianum…) Tuy nhiên, tất loài có nguy bị tuyệt chủng nạn khai thác mức môi trường sống thu hẹp Các công bố tái sinh nhân giống lan hài thu kết hạn chế tác giả chưa tìm phương pháp nhân giống tối ưu, môi trường phù hợp, điều kiện tác động khác ảnh hưởng đến trình tái sinh nhân giống loài lan Do vậy, đề tài “Xác định phương pháp tối ưu nghiên cứu tái sinh nhân giống lan hài (Paphiopedilum sp.)” thực nhằm giải vấn đề Việc tìm hiểu kỹ thuật để tái sinh nhân giống có ý nghĩa lớn cho cơng tác nhân giống, đóng vai trị quan trọng góp phần làm giảm khai thác trái phép tự nhiên, đồng thời có ý nghĩa việc bảo tồn làm sở cho trình lai tạo giống sau Mục tiêu yêu cầu đề tài Xác định phương pháp tối ưu nghiên cứu tái sinh nhân giống lan hài (Paphiopedilum sp.) Phương pháp thực đơn giản, dễ dàng áp dụng vào thực tế, cho hệ số nhân giống cao, sinh trưởng phát triển khỏe mạnh nuôi cấy in vitro ex vitro Tìm phương pháp thích hợp nhằm gia tăng tỷ lệ tái sinh mẫu cấy in vitro ban đầu đánh giá tác động chất điều hòa sinh trưởng thực vật kết hợp với phương pháp nhân giống khác như: phương pháp gây vết thương, phương pháp cắt đốt, phương pháp hủy đỉnh… nhằm mục đích gia tăng hệ số nhân giống lan hài cao so với phương pháp nuôi cấy truyền thống Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài a Ý nghĩa khoa học đề tài Có ý nghĩa nghiên cứu sinh lý thực vật, nhân giống vơ tính thực vật, khoa học trồng Tìm phương pháp tái sinh từ chồi non ex vitro đối tượng lan hài mà cơng trình nghiên cứu từ trước tới gặp khó khăn q trình tạo mẫu ban đầu, khắc phục khó khăn vấn đề nhân giống tìm phương pháp nhân giống tối ưu b Ý nghĩa thực tiễn đề tài Đưa hướng tuyển chọn nguồn mẫu ban đầu phù hợp như: thu mẫu ban đầu, thao tác rửa mẫu cấy, khử trùng mẫu cấy dễ dàng nhằm nâng cao khả tái sinh mẫu cấy trình tạo mẫu in vitro Xây dựng quy trình nhân giống đơn giản với hệ số nhân giống cao ổn định, tạo nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất giống thương mại Tìm yếu tố tác động đến trình tái sinh nhân giống lan hài như: nguồn mẫu ban đầu, môi trường nuôi cấy, giá thể, chất điều hòa sinh trưởng, phương pháp áp dụng cho giai đoạn q trính ni cấy Tạo số lượng lớn giống phục vụ cho ngành trồng hoa quy mô công nghiệp, đồng thời góp phần vào việc bảo tồn làm sở cho trình lai tạo giống sau Đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài a Đối tượng nghiên cứu Đối tượng thực nghiên cứu gồm ba giống lan Vân hài (P callosum), lan hài Hồng (P delenatii) lan hài Tam Đảo (P gratrixianum) nhằm so sánh phương pháp thực giống Từ đó, tìm phương pháp thực hiệu cho giống lan hài b Phạm vi nghiên cứu đề tài Đề tài thực với kết hợp nhiều phương pháp khác như: phương pháp gieo hạt, phương pháp tạo mẫu ban đầu từ chồi non, phương pháp cắt đốt, phương pháp tạo vết thương, phương pháp hủy đỉnh, phương pháp nhân giống thông qua callus PLB Những đóng góp luận án Đây nghiên cứu sử dụng chồi non lan hài ex vitro nuôi cấy điều kiện chiếu sáng LED chiếu sáng ngắt quãng tạo phân đốt rõ rệt nguồn vật liệu khắc phục khó khăn q trình tạo mẫu in vitro ban đầu Tạo callus từ lát cắt ngang lóng thân đối tượng lan Vân hài phương pháp cắt đốt trồng trực tiếp vườn ươm đối tượng lan hài Hồng Trong trình nghiên cứu, đề tài đưa thêm phương pháp nhân giống nghiên cứu in vitro đối tượng lan hài (phương pháp hủy đỉnh) Xây dựng quy trình nhân giống cho phương pháp khác CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo 11 tài liệu tiếng Việt, 140 tài liệu tiếng Anh với nội dung liên quan đến: (1) Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển in vitro thực vật ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên sinh trưởng phát triển thực vật; (2) Ánh sáng phát triển thực vật; (3) Ảnh hưởng hợp chất hữu lên trình sinh trưởng in vitro; (4) Giới thiệu lan hài số nghiên cứu in vitro đối tượng lan hài Một số nghiên cứu in vitro đối tượng lan hài Lan hài lồi lan khó nhân giống giới loài lan có giá trị kinh tế cao Cho đến nay, có nhiều phương pháp áp dụng nghiên cứu nhân giống vơ tính lồi lan hài nêu trên, kết đạt khiêm tốn phụ thuộc nhiều vào kiểu di truyền giống Việc xác định phương pháp tối ưu nhằm cải thiện hệ số nhân giống in vitro cho giống lan hài thách thức đáng kể vấn đề đặc biệt quan tâm nhà nghiên cứu giới Trong luận án này, kết nghiên cứu nước đối tượng lan hài chia thành phương pháp nhân giống khác nhau, gồm phương pháp: Phương pháp nhân giống truyền thống Nhân giống phương pháp gieo hạt Nhân giống từ chồi đỉnh Nhân giống thông qua mô sẹo PLB Nhân giống thơng qua hình thành chồi trực tiếp Nhân giống thơng qua hình thành chồi nách Nhân giống phương pháp gây vết thương Nhân giống in vitro phương pháp cắt đốt, cắt theo chiều dọc ngang thân in vitro Cảm ứng chồi nhân nhanh chồi từ phát hoa Kết thu từ phương pháp nhân nêu cho thấy ưu điểm nhược điểm phương pháp nhân giống lan hài: Ưu điểm Nhân giống ống nghiệm vật liệu thương mại hóa mà khơng vấp phải lệnh cấm thương mại công ước CITES, vi nhân giống thông qua nuôi cấy mô yêu cầu bắt buộc cho việc thương mại hóa lồi lan hài Khả bảo quản giống nuôi cấy mơ giúp bảo tồn nhiều lồi lan hài hoang dã mà gần tuyệt chủng môi trường sống tự nhiên chúng Các phương pháp nhân giống cho hệ số nhân giống tương đối ổn định, góp phần bảo tồn giống in vitro ex vitro giống lan hài địa Nhược điểm Đa số cơng trình nghiên cứu báo cáo nêu sử dụng có nguồn gốc từ gieo hạt in vitro Các dịng ni cấy mơ vơ tính có nguồn gốc từ hạt giống thường bị hạn chế nghiêm trọng kiểu gen chúng đa dạng chúng biểu kiểu hình khơng thể đốn trước thiếu tính đồng Hơn nữa, thường phải năm chăm sóc nhà kính trưởng thành biểu kiểu hình màu sắc hoa Thậm chí sau đó, vài trưởng thành coi có giá trị khơng thể vi nhân giống thành cơng quy trình tạo mẫu ban đầu từ chồi non trưởng thành chưa hoàn chỉnh Hai vấn đề chủ yếu sau góp phần vào q trình vi nhân giống khơng thành cơng lồi lan hài: (1) nguồn mẫu cấy từ trưởng thành loài phân họ lan hài thường gặp nhiều khó khăn cảm ứng tái sinh in vitro; (2) chúng thường vấp phải khó khăn định cơng tác vơ trùng mẫu cấy từ trưởng thành thông qua khử trùng bề mặt mẫu cấy để tạo nguồn vật liệu ni cấy in vitro, thời gian trưởng thành dài độ ẩm cao điều kiện thuận lợi cho nhiễm nấm khuẩn CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Nguồn mẫu từ hạt Cây trưởng thành giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo trồng vườn ươm Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Hoa sau nở - ngày giống lan Vân hài (P callosum), lan hài Hồng (P delenatii) lan hài Tam Đảo (P graxtrixianum) tiến hành thụ phấn thu trái sau tháng tuổi, tách lấy hạt 2.1.2 Nguồn mẫu chồi non Chồi non - tháng tuổi, có - với chiều dài trung bình từ cm tách từ mẹ trưởng thành giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo dùng để nghiên cứu thời gian khử trùng thích hợp lên trình tạo mẫu ban đầu 2.1.3 Nguồn mẫu chồi non ex vitro kéo dài nguồn sáng khác Chồi non giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tháng tuổi có chiều cao khoảng cm Những chồi đưa vào nuôi buồng chiếu sáng khác (100% LED xanh, 100% LED đỏ, 90% LED đỏ + 10% LED xanh, 50% LED đỏ + 50% LED xanh điều kiện tối) nhằm kéo dài chồi non tháng Vật liệu nghiên cứu chồi non giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tháng tuổi có chiều cao cm đưa vào điều kiện tối 14 ngày sau chuyển điều kiện chiếu sáng ngày Chu kỳ lặp lại lần liên tục nhằm kéo dài chồi phục vụ cho trình cảm ứng tạo callus ban đầu 2.1.4 Nguồn mẫu in vitro Chồi non in vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tạo từ nghiên cứu tái sinh, tiếp tục sử dụng cho nghiên cứu nhân giống in vitro 2.1.5 Thiết bị - dụng cụ Thiết bị dụng cụ nuôi cấy mô 2.1.6 Thiết bị chiếu sáng 2.1.6.1 Đèn huỳnh quang 2.1.6.2 Hệ thống chiếu sáng LED 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp gieo hạt 2.2.2 Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ chồi non 2.2.3 Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ đốt thân 2.2.4 Nhân giống phương pháp cắt đốt 2.2.5 Phương pháp nhân giống thông qua callus 2.2.6 Phương pháp nhân giống thông qua PLB có nguồn gốc từ hạt 2.2.7 Phương pháp hủy đỉnh 2.2.8 Phương pháp gây vết thương 2.3 Nội dung nghiên cứu: 2.3.1 Phương pháp gieo hạt 2.3.1.1 Thí nghiệm Khả nảy mầm hạt giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo mơi trường khống khác 2.3.1.2 Thí nghiệm Ảnh hưởng mơi trường khống khác đến sinh trưởng chồi giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo nuôi cấy in vitro 2.3.2 Phương pháp vào mẫu trực tiếp từ chồi đỉnh Thí nghiệm Thời gian khử trùng chồi non giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo ex vitro 2.3.3 Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ đốt thân 2.3.3.1 Thí nghiệm Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác đến kéo dài lóng thân giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo ex vitro 2.3.3.2 Thí nghiệm Ảnh hưởng mẫu cấy có nguồn gốc từ điều kiện chiếu sáng khác đến khả tái sinh chồi in vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 2.3.3.3 Thí nghiệm Ảnh hưởng giá thể đến khả tái sinh chồi từ mẫu cấy đốt thân ex vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 2.3.4 Nhân giống phương pháp cắt đốt 2.3.4.1 Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả kéo dài chồi in vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 2.3.4.2 Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng GA3 đến khả kéo dài chồi in vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 2.3.4.3 Thí nghiệm Kéo dài chồi in vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo điều kiện che tối hồn tồn khả sống sót đốt thân vườn ươm 2.3.5 Phương pháp nhân giống thơng qua callus 2.3.5.1 Thí nghiệm 10 Cảm ứng tạo callus từ lát cắt ngang lóng thân ex vitro kéo dài điều kiện tối ngắt quãng giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 2.3.5.2 Thí nghiệm 11 Ảnh hưởng 2,4-D TDZ đến trình nhân nhanh callus giống lan Vân hài 2.3.5.3 Thí nghiệm 12 Ảnh hưởng kết hợp NAA với BA TDZ đến trình tái sinh chồi từ callus giống lan Vân hài 2.3.6 Phương pháp nhân giống thông qua PLB 2.3.6.1 Thí nghiệm 13 Ảnh hưởng 2,4-D đến trình cảm ứng tạo PLB giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 2.3.6.2 Thí nghiệm 14 Ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với TDZ, BA KIN đến trình nhân nhanh PLB giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 2.3.6.3 Thí nghiệm 15 Ảnh hưởng nguồn gốc PLB khác đến khả hình thành chồi giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 2.3.7 Phương pháp hủy đỉnh Thí nghiệm 16 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả tạo chồi bên giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 2.3.8 Phương pháp gây vết thương Thí nghiệm 17 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp gây vết thương đến khả kích thích tạo chồi bên giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 2.3.9 Ảnh hưởng hợp chất bổ sung lên trình sinh trưởng chồi lan Vân hài in vitro 2.3.9.1 Thí nghiệm 18 Ảnh hưởng nước dừa non đến trình sinh trưởng chồi lan Vân hài in vitro 2.3.9.2 Thí nghiệm 19 Ảnh hưởng bột khoai tây đến trình sinh trưởng chồi lan Vân hài in vitro 2.3.9.3 Thí nghiệm 20 Ảnh hưởng peptone đến trình sinh trưởng chồi lan Vân hài in vitro 2.3.9.4 Thí nghiệm 21 Ảnh hưởng bột chuối đến trình sinh trưởng chồi lan Vân hài in vitro 2.3.10 Trồng giống lan Vân hài, lan hài Hồng, lan hài Tam Đảo điều kiện vườn ươm Thí nghiệm 22 Ảnh hưởng giá thể đến trình sinh trưởng giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo vườn ươm 2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm xử lý số liệu Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD) theo phương pháp Compton Mize, (1999) Trung bình tiêu theo dõi nghiệm thức thí nghiệm xử lý phương pháp phân tích phương sai (ANOVA), sau so sánh với phép thử Ducan mức tin cậy P ≤ 0,05 phần mềm SAS 9.1 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phương pháp gieo hạt 3.1.1 Khả nảy mầm hạt giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo mơi trường khống khác Hình 3.2 Tỷ lệ nảy mầm giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo mơi trường khống khác sau 90 ngày ni cấy 3.1.2 Ảnh hưởng mơi trường khống khác đến sinh trưởng phát triển chồi giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo nuôi cấy in vitro Bảng 3.1 Ảnh hưởng mơi trường khống hài sau 90 ngày nuôi cấy Chiều Môi dài Số Số trường lá/chồi lá/chồi rễ/chồi khoáng (cm) 1,00d 2,25d 1,50c MS(ĐC) khác đến sinh trưởng chồi lan Vân Chiều dài rễ/chồi (cm) 0,25d Khối lượng Hình thái chồi tươi/chồi (g) 0,21d Mẫu hóa nâu đen, chết Mẫu úa vàng, non c c c c c 1,75 3,25 2,00 1,00 0,31 bắt đầu chết ½MS Mẫu xanh cứng, rễ 3,00b 4,00b 3,25c 3,25b 0,49b VW ngắn, khằn Mẫu xanh đậm, rễ b a b b b 3,00 5,00 3,25 3,50 0,56 B5 ngắn, khằn Mẫu khỏe, xanh tươi, SH 4,00a 5,00a 4,50a 6,25a 1,44a rễ phát triển 6,94 8,10 9,25 9,17 9,62 CV(%) * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Hình 3.3 Ảnh hưởng mơi trường khống khác đến sinh trưởng chồi lan Vân hài nuôi cấy in vitro sau 90 ngày nuôi cấy 8 Bảng 3.2 Ảnh hưởng mơi trường khống khác đến sinh trưởng chồi lan hài Hồng sau 90 ngày nuôi cấy Chiều Chiều Khối Môi dài Số Số dài lượng trường Hình thái chồi lá/chồi /chồi rễ/chồi rễ/chồi tươi/chồi khoáng (cm) (cm) (g) MS (ĐC) 1,75d 2,95d 1,47d 0,70d 0,50e ½MS 3,87c 3,66c 2,60c 2,22c 1,07d VW 4,50b 3,95bc 3,42b 3,60b 1,35c B5 5,00a 4,15b 3,37b 3,42b 1,55b SH 5,27a 4,57a 3,95a 5,07a 1,95a Mẫu hóa nâu, chết Mẫu xanh nhạt, non bắt đầu úa vàng hoại tử Mẫu xanh cứng, rễ ngắn, khằn Mẫu xanh đậm, rễ ngắn, khằn Mẫu khỏe, xanh tươi, rễ phát triển mạnh 7,60 7,00 7,45 9,57 8,92 CV(%) F-test * * * * * Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Bảng 3.3 Ảnh hưởng môi trường khoáng khác đến sinh trưởng chồi lan hài Tam Đảo sau 90 ngày nuôi cấy Chiều Chiều Mơi Khối lượng dài Số Số dài Hình thái trường tươi lá/chồi lá/chồi rễ/chồi rễ/chồi chồi khoáng (g) (cm) (cm) Lá trắng, 3,75d 3,10d 2,15d 1,57e 1,12c MS (ĐC) già hóa nâu hoạiyếu, Chồi tử non màu xanh 4,17c 3,05d 2,60c 2,25d 1,20c ½MS nhạt trắng, hoại tử Mẫu xanh 4,35c 3,67c 3,30d 3,40c 1,07c VW cứng, rễ ngắn, Mẫu xanh khằn 5,45b 4,52b 3,47b 4,10b 1,37b B5 đậm, rễ ngắn, Mẫu khỏe, khằn SH 5,87a 5,00a 4,22a 5,97a 1,85a xanh tươi, rễ 4,90 4,03 4.95 4,86 9,39 CV(%) phát triển mạnh F-test * * * * * Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Hình 3.3 Ảnh hưởng mơi trường khống khác đến sinh trưởng chồi giống lan hài nuôi cấy in vitro sau 90 ngày nuôi cấy b Lan hài Hồng; c lan hài Tam Đảo 9 3.2 Phương pháp vào mẫu trực tiếp từ chồi đỉnh Thời gian khử trùng chồi non giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo ex vitro Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian khử trùng mẫu cấy đến khả tái sinh chồi non lan Vân hài sau 90 ngày ni cấy Hình 3.6 Ảnh hưởng thời gian khử trùng mẫu cấy đến khả tái sinh chồi non lan hài Hồng sau 90 ngày nuôi cấy Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian khử trùng mẫu cấy đến khả tái sinh chồi non lan hài Tam Đảo sau 90 ngày nuôi cấy Kết Luận: Tỷ lệ tái sinh chồi giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo thu cao (22,4%; 24,85%; 17,15%) mơi trường SH có bổ sung 1,0 mg/L TDZ, 0,3 mg/L NAA, g/L agar, 30 g/L sucrose, pH = 5,8 3.3 Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ đốt thân 3.3.1 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác đến kéo dài lóng thân giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo ex vitro Bảng 3.4 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác đến kéo dài giống lan Vân hài sau 120 ngày Chiều Chiều Chiều Chl a Điều kiện chiếu cao Số dài rộng (mg/g sáng chồi lá/chồi (cm) (cm) tươi) (cm)1 lóng thân ex vitro Chl b (mg/g tươi) Chl a+b (mg/g tươi) ĐC (Vườn ươm) 50% LED đỏ + 50% LED xanh 90% LED đỏ + 10% LED xanh 100% LED đỏ 100% LED xanh Trong tối CV% F-test 2,04d 5,00 14,75bc 4,62a 1,432a 0,987a 2,419a 2,99c 5,00 12,75d 2,85b 0,870bc 0,644b 1,514bc 3,21c 5,00 13,87cd 2,70b 0,849c 0,563c 1,412c 5,00 5,00 5,00 NS ab b d d 0,941d 1,644b 0,423e 9,61 * b 4,14 9,11a 9,97a 4,69 * 15,25 16,12a 8,32e 6,25 * 2,62 2,12c 1,72d 6,12 * 0,515 0,999b 0,239e 10,91 * 0,426 0,645b 0,184e 8,66 * 10 Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc Bảng 3.5 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác đến kéo dài lóng thân ex vitro giống lan hài Hồng sau 120 ngày Chiều Chiều Chiều Chl a Chl b Chl a+b Điều kiện chiếu Số rộng cao chồi dài (mg/g (mg/g (mg/g sáng lá/chồi (cm) (cm) tươi) tươi) tươi) (cm) f b a a a a ĐC (vườn ươm) 2,25 4,75 9,35 3,72 1,425 0,971 2,397a 50% LED đỏ + 4,37e 4,75b 6,05b 1,62b 1,046b 0,743b 1,790b 50% LED xanh 90% LED đỏ + 7,30c 5,00ab 5,92b 1,60b 0,960b 0,590d 1,550c 10% LED xanh 100% LED đỏ 4,97d 4,75b 5,97b 1,70b 0,734c 0,630cd 1,365d 100% LED xanh 11,00a 5,75a 5,47c 1,35c 0,712c 0,669bc 1,382d Trong tối 8,87b 5,00ab 6,12b 1,60b 0,216d 0,179e 0,396d 3,44 10,54 3,31 5,51 10,05 8,09 6,77 CV% * * * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Bảng 3.6 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác đến kéo dài lóng thân ex vitro giống lan hài Tam Đảo sau 120 ngày Chiều Chiều Chl Chiều Chl a Chl b Điều kiện chiếu cao Số rộng a+b dài (mg/g (mg/g sáng chồi lá/chồi (mg/g (cm) tươi) tươi) (cm) (cm) tươi) ĐC (Vườn ươm) 3,05cd 5,00a 22,50a 3,05a 1,161a 0,705a 1,867a 50% LED đỏ + ab b b b c c 3,42 4,50 19,50 2,17 0,712 0,491 1,204c 50% LED xanh 90% LED đỏ + 3,82a 4,75a 16,50c 1,90c 0,767bc 0,598b 1,365b 10% LED xanh 100% LED đỏ 3,35b 5,00a 19,50b 1,92bc 0,529d 0,484c 1,014d ab a c bc b b 100% LED xanh 3,40 4,50 16,50 1,95 0,826 0,617 1,444b Trong tối 1,50c 3,50b 4,00d 1,15d 0,111d 0,095d 0,206e 7,63 10,04 9,41 8,27 8,84 7,28 6,82 CV% * * * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Hình 3.8, 3.9: Chồi lan hài ex vitro nuôi điều kiện sáng khác sau 120 ngày A Lan Vân hài; b lan hài Hồng; c lan hài Tam Đảo; ĐC Đối chứng vườn ươm; R Ánh sáng đèn LED đỏ; B Ánh sáng đèn LED xanh; D Điều kiện tối 11 Kết Luận: Sự kéo dài chồi thu tốt điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh (9,11 cm) đặt điều kiện tối (9,97 cm) thu giống lan Vân hài Trên giống lan hài Hồng, chồi kéo dài tốt điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh với chiều cao đạt 11,00 cm Trên giống lan hài Tam Đảo, chồi có kéo dài kéo dài lóng thân chưa rõ ràng 3.3.2 Ảnh hưởng mẫu cấy có nguồn gốc từ điều kiện chiếu sáng khác lên khả tái sinh chồi in vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Hình 3.10 Ảnh hưởng nguồn mẫu điều kiện sáng khác giai đoạn ex vitro đến trình tái sinh in vitro lan Vân hài sau 45 ngày nuôi cấy Hình 3.11 Ảnh hưởng nguồn mẫu điều kiện sáng khác giai đoạn ex vitro đến trình tái sinh in vitro lan hài Hồng sau 45 ngày ni cấy Hình 3.12 Ảnh hưởng nguồn mẫu điều kiện sáng khác giai đoạn ex vitro đến trình tái sinh in vitro lan hài Tam Đảo sau 45 ngày nuôi cấy 3.3.3 Ảnh hưởng giá thể lên khả tái sinh mẫu cấy đốt thân ex vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Hình 3.14 Ảnh hưởng giá thể đến khả tái sinh mẫu cấy đốt thân ex vitro lan Vân hài sau 45 ngày ni cấy Hình 3.15 Ảnh hưởng giá thể đến khả tái sinh mẫu cấy đốt thân ex vitro lan hài Hồng sau 45 ngày ni cấy 12 Hình 3.16 Ảnh hưởng giá thể đến khả tái sinh mẫu cấy đốt thân ex vitro lan hài Tam Đảo sau 45 ngày ni cấy Hình 3.17 Chồi lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tái sinh in vitro giá thể khác sau 45 ngày nuôi cấy a b Chồi bên lan hài Tam Đảo tái sinh giá thể bơng gịn; c Chồi tái sinh giá thể khác nhau: BG gòn, CGL cầu giấy lọc, Gelrite, Agar; d e Chồi bên lan Vân hài tái sinh giá thể gòn; f g Chồi bên lan hài Hồng tái sinh giá thể bơng gịn Kết Luận: Tỷ lệ mẫu cấy tái sinh (48,45%; 44,90%; 25,3%) giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo có nguồn gốc từ điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh thu môi trường SH lỏng với giá thể bơng gịn, có bổ sung mg/L TDZ, 0,3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, pH = 5,8 3.4 Nhân giống phương pháp cắt đốt 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác đến khả kéo dài chồi giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo in vitro Bảng 3.7 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả kéo dài chồi lan Vân hài in vitro Chiều Chiề Khối Khối Giá Điều kiện chiếu Số Chiều cao u dài lượng lượng trị sáng rộng chồi tươi khô SPAD ĐC (Neon) 1,92h 4,00b 5,06cd 1,39abc 4,25cd 0,41bc 46,62a g b bc de def c 50% R + 50% B 2,97 4,00 5,37 1,14 4,02 0,39 41,77b 30% R + 70% B 4,32f 4,00b 6,10a 1,25cde 4,57b 0,44b 39,47c c b ab a a a 70% R + 30% B 6,85 4,00 5,70 1,45 5,20 0,51 38,55c 100% B 5,85d 4,00b 5,15cd 1,36abc 3,75fg 0,36d 36,07d 100% R 5,15e 4,00b 5,15cd 1,42ab 4,37bc 0,42bc 34,52e 100% Gr 6,82c 4,00b 5,82a 1,30abcd 3,90efg 0,32d 32,07f bc b ab bcde g d 100% Y 7,15 4,00 5,75 1,27 3,72 0,33 30,12g 100% Wh 7,37b 4,00b 5,48d 1,23cde 3,27h 0,26f 28,37h a a e e g d Trong tối 8,55 4,75 3,42 1,11 3,45 0,32 4,67i 5,19 3,88 5,43 8,03 4,38 5,22 2,77 CV% * * * * * * F-test * 13 Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc Bảng 3.8 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả kéo dài chồi lan hài Hồng in vitro Chiều Chiều Chiều Khối Khối Điều kiện chiếu Số cao dài rộng lượng lượng Giá trị sáng chồi tươi khô SPAD ĐC (Đèn huỳnh f b a a a a 1,72 4,00 4,80 2,19 4,22 0,40 45,47a quang) 50% R + 50% B 2,72f 4,00b 4,65a 1,72abc 3,37b 0,32b 41,82b 30% R + 70% B 2,62f 4,00b 4,02bc 1,86ab 3,29bc 0,30bc 39,42c f b c bc bcd bc 70% R + 30% B 2,55 4,00 3,85 1,56 3,15 0,30 40,00c 100% B 7,85a 4,75a 4,15b 1,43bc 4,22a 0,40a 39,72c e b bc abc bcd bc 100% R 3,72 4,00 4,00 1,61 3,15 0,30 38,85c 100% Gr 7,10c 4,00b 3,15e 1,35bc 2,97cd 0,28cd 30,07f c ab d c e e 100% Y 6,92 4,50 3,52 1,22 2,30 0,22 34,37d 100% Wh 5,52d 4,00b 3,17e 1,29bc 1,70f 0,15f 32,42e b ab f bc d d Trong tối 7,45 4,50 2,92 1,27 2,85 0,26 6,97g 3,92 7,25 4,14 8,91 6,98 7,49 2,98 CV% * * * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc Bảng 3.9 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả kéo dài chồi lan hài Tam Đảo in vitro Chiều Số Chiều Chiều Khối Khối Điều kiện chiếu sáng cao dài rộng lượng lượng Giá trị 1 chồi (cm) tươi khô SPAD ĐC (Đèn huỳnh quang) 0,72fg 3,00 4,32b 1,26a 1,50a 0,142a 42,00a 50% R + 50% B 1,12d 3,00 4,37b 0,92b 1,32b 0,130ab 37,40b 30% R + 70% B 0,85ef 3,00 4,10c 0,70c 1,12c 0,112bc 36,57bc 70% R + 30% B 0,67fg 2,50 3,60de 0,67c 0,92de 0,087d 35,57c g de de de de 100% B 0,60 2,50 3,60 0,55 0,85 0,082 34,35d de d b d cd 100% R 1,02 3,00 3,70 0,90 0,95 0,095 29,22e b bc cd d de 100% Gr 1,75 2,50 4,22 0,62 0,95 0,082 26,70f a a ef e ef 100% Y 2,02 2,75 4,57 0,50 0,77 0,065 24,70g c de ef f fg 100% Wh 1,35 2,50 3,60 0,50 0,60 0,052 19,17h a e f g g Trong tối 2,10 2,50 3,42 0,40 0,40 0,035 3,55i 4,35 7,08 2,98 3,64 10,63 1,11 2,70 CV% * NS * * * * * F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc 3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng GA3 đến khả kéo dài chồi giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo in vitro Bảng 3.10 Ảnh hưởng GA3 lên khả kéo dài chồi lan Vân hài in vitro 14 Chiều Khối Khối Giá trị Số Chiều Chiều cao lượng lượng SPAD dài rộng chồi tươi khô d f a d d mg/L (ĐC) 0,50 3,02 3,55 1,20 1,27 0,130 30,45d c e ab d d mg/L 2,65 2,95 6,15 1,05 1,35 0,132 32,85c mg/L 3,95b 2,87 8,65c 1,12ab 1,75c 0,160c 36,67b mg/L 4,65a 2,85 9,65a 1,12ab 2,50a 0,235a 40,82a mg/L 3,85b 3,05 9,20b 1,07ab 2,00b 0,195b 40,30a mg/L 3,97b 3,00 7,45d 0,97b 1,70c 0,160c 38,05b 3,59 5,54 1,81 9,16 6,91 8,23 3,82 CV% * NS * * * * * F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Bảng 3.11 Ảnh hưởng GA3 đến khả kéo dài chồi lan hài Hồng in vitro Chiều cao Chiều Chiều Khối Khối Giá trị Số Nồng độ GA3 chồi dài rộng lượng lượng SPAD (cm) mới tươi khô mg/L (ĐC) 1,65e 4,00b 3,55c 2,00a 3,60ab 0,342ab 36,53b mg/L 3,00d 4,25ab 3,67c 1,40b 3,10c 0,297b 36,92ab mg/L 7,00c 4,17b 4,00b 1,25c 3,37b 0,235ab 37,00ab mg/L 7,50c 4,25ab 4,25a 1,22c 3,42b 0,297ab 37,27ab b ab a c ab ab mg/L 10,00 4,32 4,42 1,22 3,55 0,312 37,35ab mg/L 13,25a 4,75a 4,45a 1,05c 3,72a 0,352a 37,55a 7,69 9,85 4,88 5,88 4,37 8,94 1,58 CV% * * * * * * F-test * Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Bảng 3.12 Ảnh hưởng GA3 đến khả kéo dài chồi lan hài Tam Đảo in vitro Số Khối Khối Chiều Chiều Giá trị Nồng độ GA3 Chiều lượng lượng cao chồi dài rộng SPAD tươi khô e d a a mg/L (ĐC) 0,45 2,37 1,95 1,17 0,61 0,057 34,30 mg/L 0,55d 2,50 2,90c 0,85b 0,58 0,050ab 33,85 mg/L 0,75d 2,47 3,15b 0,87b 0,58 0,056ab 33,72 mg/L 1,02c 2,32 3,07bc 0,87b 0,60 0,045b 33,40 mg/L 1,37b 2,37 3,47a 0,97b 0,61 0,056ab 33,25 mg/L 1,55a 2,57 3,57a 1,00b 0,62 0,052ab 33,12 9,76 6,68 3,99 9,99 8,72 12,57 2,11 CV% * NS * * NS * NS F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Nồng độ GA3 Kết Luận: Phương pháp cắt đốt in vitro thực đối tượng lan Vân hài, lan hài Hồng Để dễ dàng thực giảm chi phí cho trình nhân giống, thực kéo dài chồi lan Vân hài lan hài Hồng điều kiện che tối sau 120 ngày nuôi cấy với số đốt trung bình (4,75 đốt/chồi) 3.4.3 Sự kéo dài chồi in vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo điều kiện che tối hoàn tồn khả sống sót vị trí đốt thân vườn ươm 15 Bảng 3.13 Ảnh hưởng điều kiện tối lên kéo dài chồi in vitro lan Vân hài Thời gian che tối Chiều cao Số Chiều Chiều Số rễ hình (ngày) chồi dài rộng thành ĐC (Đèn huỳnh quang) 2,05e 4,02b 4,93a 1,40a 0,00 d d b b 30 2,55 1,18 4,02 1,16 0,00 60 4,50c 2,47c 3,25c 1,10b 0,00 90 7,00b 3,71b 2,60d 0,87c 0,00 a a d c 120 8,58 5,06 2,40 0,75 0,00 3,38 7,21 5,97 8,00 CV% * * * * NS F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Bảng 3.14 Ảnh hưởng điều kiện tối lên kéo dài chồi in vitro lan hài Hồng Thời gian che tối Chiều Số Chiều Chiều Số rễ hình (ngày) cao chồi dài rộng thành1 d c a a ĐC (Đèn huỳnh quang) 4,25 3,00 4,95 3,37 0,01c d e b b 30 4,37 1,00 3,80 1,65 0,01c 60 5,65c 2,42d 3,00c 1,45bc 0,01c 90 7,12b 3,75b 2,22d 1,15c 1,82b 120 10,50a 5,00a 2,00d 1,12c 3,36a 5,54 7,18 8,15 11,84 5,73 CV% * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc Bảng 3.15 Ảnh hưởng điều kiện tối lên kéo dài chồi lan hài Tam Đảo Thời gian che tối Chiều cao Số Chiều Chiều Số rễ hình (ngày) chồi dài rộng thành ĐC (Đèn huỳnh quang) 0,80d 3,05a 4,32a 1,36a 0,00 30 2,55c 1,00d 3,82b 0,95b 0,00 b c b c 60 2,75 1,77 3,77 0,70 0,00 90 2,90ab 2,62b 3,72b 0,55d 0,00 120 3,05a 3,07a 3,65b 0,43e 0,00 4,66 8,21 3,78 7,48 CV% * * * * NS F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc Bảng 3.16 Ảnh hưởng vị trí đốt thân lên khả sống sót phát triển vườn ươm sau 12 tháng giống lan hài Hồng Vị trí Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ Số chồi hình Chiều rộng Số đốt thân sống mẫu chết thành 100,00a 0,00d 1,00a 3,87a 3,07a 23,75d 76,25a 0,00d 0,00d 0,00d 33,75c 66,25b 0,75b 2,50c 1,42c c b b b 32,50 67,50 0,72 3,12 1,45c 56,25b 43,75c 0,53c 4,12a 2,12b 8,79 8,53 6,69 13,60 8,64 CV% * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test 16 Kết luận: Chồi đỉnh cho tỷ lệ sống sót 100%, từ chồi non ban đầu sau kéo dài lóng thân tạo (1 + 0,75 + 0,72 + 0,53 chồi/mẫu) hoàn chỉnh từ đốt thân giống lan hài Hồng 3.5 Phương pháp nhân giống thông qua callus 3.5.1 Khả cảm ứng tạo callus từ mẫu chồi non ex vitro kéo dài điều kiện tối ngắt quãng giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Bảng 3.17 Ảnh hưởng cảm ứng tạo callus từ mẫu chồi non ex vitro kéo dài điều kiện tối ngắt quãng giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Chất điều hòa sinh trưởng Lan Vân hài Lan hài Lan hài Tam Hồng Đảo 2,4-D TDZ (mg/L) Tỷ lệ tạo callus Tỷ lệ tạo Tỷ lệ tạo (mg/L) (%)1 callus (%) callus (%) 0,00f 0,00 0,00 0,0 (ĐC) 0,00f 0,00 0,00 0,3 f 0,00 0,00 0,00 0,6 6,03de 0,00 0,00 1,0 0,00f 0,00 0,00 0,0 0,5 0,00f 0,00 0,00 0,3 0,5 e 5,00 0,00 0,00 0,6 0,5 14,68c 0,00 0,00 1,0 0,5 0,00f 0,00 0,00 0,0 1,0 d 7,19 0,00 0,00 0,3 1,0 19,76b 0,00 0,00 0,6 1,0 31,03a 0,00 0,00 1,0 1,0 6,01 CV% * NS NS F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc 3.5.2 Ảnh hưởng TDZ 2,4-D đến trình nhân nhanh callus giống lan Vân hài Hình 3.22 Ảnh hưởng TDZ 2,4-D đến trình trình nhân nhanh callus sau 75 ngày nuôi cấy giống lan Vân hài 3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên trình tái sinh chồi từ callus lan Vân hài 17 Bảng 3.18 Ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên trình tái sinh chồi từ callus giống lan Vân hài Chất điều hòa sinh trưởng Tỷ lệ callus tái sinh Số chồi trung chồi (%) bình/mẫu1 NAA BA TDZ 0,00f 0,00d 0,5 (ĐC) 0,0 0,0 11,25e 3,23c 0,5 0,5 0,0 43,75c 3,23c 0,5 1,0 0,0 51,25b 4,74b 0,5 2,0 0,0 0,5 0,0 0,3 60,00a 7,98a 43,75c 4,74b 0,5 0,0 0,6 30,00d 3,20c 0,5 0,0 1,0 10,55 7,13 CV% * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc Kết Luận: Tỷ lệ cảm ứng tạo mơ sẹo từ lát cắt ngang lóng thân giống lan Vân hài cao (31,25%) thu môi trường SH lỏng có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D, 1,0 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose với giá thể bơng gịn sau 75 ngày ni cấy Trên mơi trường có bổ sung 0,3 mg/L TDZ, 0,5 mg/L NAA cho tỷ lệ tái sinh cụm chồi từ callus thu cao 60% số chồi hình thành trung bình cụm cao 7,98 chồi/mẫu 3.6 Phương pháp nhân giống thông qua PLB 3.6.1 Ảnh hưởng 2,4-D đến trình cảm ứng PLB giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Hình 3.24 Ảnh hưởng 2,4-D đến trình cảm ứng PLB giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 3.6.2 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D với TDZ, BA, KIN đến trình nhân nhanh PLB giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 18 Bảng 3.19 Ảnh hưởng kết hợp mg/L 2,4-D với TDZ, BA, KIN lên trình nhân nhanh PLB giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Lan hài Lan hài Lan Vân hài Chất điều hòa sinh trưởng Hồng Tam Đảo (mg/L) Số PLB/mẫu PLB/mẫu PLB/mẫu1 2,4-D TDZ BA KIN 4,35f 3,65f 3,47f 1,0 (ĐC) 0,0 4,12fg 5,57de 4,21ef 1,0 0,5 3,75g 5,06e 3,23fg 1,0 1,0 3,12h 3,62f 2,47gh 1,0 2,0 2,25i 3,06f 1,94hi 1,0 3,0 1,70j 2,17g 1,46i 1,0 4,0 3,75g 3,06f 3,73f 1,0 0,5 5,31e 5,01e 5,24de 1,0 1,0 8,55b 8,06b 7,98b 1,0 2,0 d c 6,62 6,75 5,98cd 1,0 3,0 5,62e 5,68d 4,97de 1,0 4,0 6,20d 6,40c 6,24cd 1,0 0,5 c c 7,47 6,95 7,22bc 1,0 1,0 11,00a 9,62a 10,98a 1,0 2,0 8,25b 8,20b 7,98b 1,0 3,0 d de cd 6,37 5,37 6,22 1,0 4,0 6,22 7,29 7,10 CV% * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,25 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc 3.6.3 Ảnh hưởng nguồn gốc PLB khác đến khả hình thành chồi giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Hình 3.25 Ảnh hưởng nguồn mẫu cảm ứng từ phức hợp chất điều hòa sinh trưởng đến khả hình thành chồi từ cụm PLB giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Kết Luận: Quá trình cảm ứng PLB tốt thu mơi trường SH có bổ sung mg/L 2,4-D sau 60 ngày nuôi cấy, q trình nhân nhanh PLB thu mơi trường SH có bổ sung mg/L 2,4-D kết hợp với mg/L KIN, trình tái sinh chồi thu tốt PLB ni cấy có nguồn gốc từ mơi trường SH có bổ sung mg/L 2,4-D kết hợp với mg/L KIN 19 3.7 Nhân giống phương pháp hủy đỉnh Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả tạo chồi bên giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Hình 3.27 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả tạo chồi bên giống lan Vân hài sau 90 ngày ni cấy Hình 3.28 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả tạo chồi bên giống lan hài Hồng sau 90 ngày nuôi cấy Hình 3.29 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả tạo chồi bên giống lan hài Tam Đảo sau 90 ngày ni cấy Hình 3.30 Nhân giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo phương pháp hủy đỉnh sau 90 ngày nuôi cấy 20 a Lan Vân hài cấy mơi trường SH có bổ sung 0,4 mg/L TDZ; b Lan hài Hồng cấy mơi trường SH có bổ sung 0,4 mg/L TDZ; c Lan hài Tam Đảo cấy môi trường SH có bổ sung 0,6 mg/L TDZ Kết Luận: Phương pháp hủy đỉnh kích thích tạo chồi bên cho hệ số nhân giống cao thu giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tương ứng với tỷ lệ (5,61; 5,48; 6,00 chồi/mẫu) môi trường SH lỏng với giá thể gịn có bổ sung 0,4 - 0,6 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose 3.8 Phương pháp gây vết thương Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp gây vết thương lên khả kích thích tạo chồi bên giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Bảng 3.20 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp gây vết thương kích thích tạo chồi bên lan Vân hài mơi trường lỏng với giá thể bơng gịn Chất điều hịa sinh trưởng Số chồi/mẫu Hình thái chồi TDZ (mg/L) BA (mg/L) d 1,22 Chồi nhỏ, xanh nhạt (ĐC) 2,47c Chồi to, xanh nhạt 0,2 4,48a Chồi to, xanh nhạt 0,4 4,48a Chồi to, xanh nhạt 0,6 ab 4,24 Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 0,8 3,97ab Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 1,0 2,47c Chồi to, xanh nhạt 0,5 bc 3,23 Chồi to, xanh nhạt 1,0 3,71ab Chồi to, xanh nhạt 1,5 3,71ab Chồi to, xanh nhạt 2,0 3,48ab Chồi to, xanh nhạt 2,5 8,59 CV% * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Bảng 3.21 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp gây vết thương kích thích tạo chồi bên lan hài Hồng môi trường lỏng với giá thể bơng gịn Chất điều hịa sinh trưởng Số chồi/mẫu Hình thái chồi TDZ (mg/L) BA (mg/L) e 1,75 Chồi nhỏ, xanh nhạt (ĐC) 3,00d Chồi to, xanh nhạt 0,2 ab 5,00 Chồi to, xanh nhạt 0,4 5,37a Chồi to, xanh nhạt 0,6 4,81ab Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 0,8 b 4,62 Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 1,0 3,25d Chồi to, xanh nhạt 0,5 3,87c Chồi to, xanh nhạt 1,0 4,37bc Chồi to, xanh nhạt 1,5 4,43bc Chồi to, xanh nhạt 2,0 4,50b Chồi to, xanh nhạt 2,5 9,48 CV% * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test 21 Bảng 3.22 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp gây vết thương kích thích tạo chồi bên lan hài Tam Đảo môi trường lỏng với giá thể bơng gịn Chất điều hịa sinh trưởng Số chồi/mẫu Hình thái chồi TDZ (mg/L) BA (mg/L) f 1,86 Chồi nhỏ, xanh đậm (ĐC) 2,50e Chồi to, xanh đậm 0,2 a 5,31 Chồi to, xanh đậm 0,4 5,25ab Chồi to, xanh nhạt 0,6 4,62bc Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 0,8 c 4,37 Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 1,0 3,63d Chồi to, xanh đậm 0,5 4,12cd Chồi to, xanh đậm 1,0 abc 4,68 Chồi to, xanh đậm 1,5 4,43c Chồi to, xanh đậm 2,0 4,37c Chồi to, xanh đậm 2,5 10,07 CV% * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Kết Luận: Sử dụng phương pháp gây vết thương kích thích tạo chồi bên cho hệ số nhân giống cao thu giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tương ứng với tỷ lệ (4,48; 5,37; 5,31 chồi/mẫu) môi trường SH lỏng với giá thể bơng gịn có bổ sung 0,4 - 0,6 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose 3.10 Trồng giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo điều kiện vườn ươm 3.10.1 Ảnh hưởng giá thể lên trình sinh trưởng giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo vườn ươm Bảng 3.27 Ảnh hưởng giá thể lên khả sống sót, sinh trưởng phát triển lan Vân hài vườn ươm sau 24 tháng Tỷ lệ Chiều Khối Số Chiều Chiều Giá trị sống rộng Số rễ lượng Giá thể dài dài rễ SPAD sót tươi (cm) (cm) (%) (cm) (g) Xơ dừa 100 4,75 2,40d 7,00d 4,12b 7,25e 10,75d 40,85b (ĐC) cd c b d d Tro trấu 100 4,75 2,50 8,62 4,25 8,75 12,00 41,45b c bc ab c c Dớn xay 100 4,87 2,60 9,25 4,50 10,50 14,00 41,35b Dớn mút 100 5,00 2,80b 10,12b 5,00a 12,25b 16,00b 41,70b Dớn Đài 100 5,00 3,05a 12,00a 5,00a 15,00a 19,50a 44,67a Loan 3,97 3,48 7,58 8,81 7,30 6,62 1,59 CV% NS NS * * * * * * F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; **:: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test 22 Bảng 3.28 Ảnh hưởng giá thể lên khả sống sót, sinh trưởng phát triển lan hài Hồng vườn ươm sau 24 tháng Tỷ lệ Chiều Khối Giá trị Số Chiều Chiều Giá thể sống rộng Số rễ lượng SPAD dài dài rễ sót tươi Xơ dừa 100 5,00b 2,25e 6,00b 4,00c 6,00c 8,75c 38,82c (ĐC) Tro trấu 100 5,00b 2,40d 7,25b 4,25c 7,00c 10,25c 40,37b Dớn xay 100 5,12b 2,50c 7,62b 4,37bc 8,50b 12,75b 39,50bc Dớn mút 100 6,00a 2,60b 8,00ab 5,00ab 8,87b 13,12ab 40,32b Dớn Đài 100 6,00a 2,82a 9,00a 5,25a 10,25a 14,75a 41,47a Loan 9,29 3,20 9,29 10,07 9,76 9,19 1,60 CV% NS * * * * * * * F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Bảng 3.29 Ảnh hưởng giá thể lên khả sống sót, sinh trưởng phát triển lan hài Tam Đảo vườn ươm sau 24 tháng Tỷ lệ Số Chiều Khối Giá trị Chiều Chiều Giá thể sống rộng Số rễ lượng SPAD dài dài rễ sót tươi Xơ dừa 100 4,56 2,00c 7,50d 4,75b 6,75c 9,00d 38,67d (ĐC) Tro trấu 100 4,68 2,12c 8,62c 4,75b 7,00bc 11,00c 40,50bc Dớn xay 100 4,87 2,27b 8,75c 5,00b 8,0abc 12.37b 39,25cd a b b ab ab Dớn mút 100 4,93 2,42 10,75 5,50 8,25 13,25 40,92ab Dớn Đài 100 5,00 2,55a 12,50a 6,75a 9,00a 14,00a 42,00a Loan 6,73 3,80 6,67 11,05 10,20 6,65 1,81 CV% NS NS * * * * * * F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test 3.11.4 Quy trình tái sinh nhân giống tối ưu giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 1,0 - 2,0 cm Quy trình 4: a1 Cây trưởng thành ngồi vườn ươm; a2 Chồi non ex vitro có chiều cao 1,0 - 2,0 cm vườn ươm; b c Kéo dài chồi điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh sau tháng; d Chồi cắt thành đốt khử trùng mẫu cấy; e1 e2 Tái sinh chồi từ đốt thân môi trường đặc môi trường lỏng với giá thể bơng gịn; f Chồi sinh trưởng in vitro; g Hủy đỉnh cách dùng panh cấy giữ chặt phần gốc, dùng panh thứ kẹp vào non 23 kéo chúng khỏi đỉnh chồi; h Kích thích tạo cụm chồi in vitro môi trường lỏng với giá thể gịn; i Tạo in vitro hồn chỉnh từ cụm chồi; j Trồng lên vỉ xốp với dớn Đài Loan điều kiện vườn ươm Hệ số nhân giống: Số chồi trung bình thu giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo sau tháng: 5,61 + 5,48 + 6,00 = 17,09 : = 5,69 chồi Tách chồi cấy lên môi trường tạo chồi khỏe mạnh thêm tháng tiếp Hủy đỉnh tạo chồi khỏe mạnh tháng tiếp theo: 5,69 x 5,69 = 32,37 chồi Hủy đỉnh tạo chồi khỏe mạnh tháng tiếp theo: 32,37 x 5,69 = 184,22 chồi Như vậy, hệ số nhân giống theo phương pháp hủy đỉnh sau 12 tháng từ chồi ban đầu tạo 184,22 chồi KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ chồi non ex vitro Tỷ lệ tái sinh chồi giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo thu cao (22,4%; 24,85%; 17,15%) môi trường SH có bổ sung 1,0 mg/L TDZ, 0,3 mg/L NAA, g/L agar, 30 g/L sucrose, pH = 5,8 Phương pháp tái sinh tối ưu (tạo mẫu ban đầu từ đốt thân ex vitro) Tỷ lệ mẫu cấy tái sinh (48,45%; 44,90%; 25,3%) giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo có nguồn gốc từ điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh thu mơi trường SH lỏng với giá thể bơng gịn, có bổ sung mg/L TDZ, 0,3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, pH = 5,8 Nhân giống phương pháp cắt đốt Phương pháp cắt đốt in vitro thực đối tượng lan Vân hài, lan hài Hồng Để dễ dàng thực giảm chi phí cho q trình nhân giống, thực kéo dài chồi lan Vân hài lan hài Hồng điều kiện che tối sau 120 ngày nuôi cấy với số đốt trung bình (4,75 đốt/chồi) Cảm ứng tạo callus từ lát cắt ngang lóng thân nhân giống thơng qua callus Tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo từ lát cắt ngang lóng thân giống lan Vân hài cao (31,25%) thu môi trường SH lỏng có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D, 1,0 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose với giá thể bơng gịn sau 75 ngày ni cấy Trên mơi trường có bổ sung 0,3 mg/L TDZ, 0,5 mg/L NAA cho tỷ lệ tái sinh cụm chồi từ callus thu cao 60% số chồi hình thành trung bình cụm cao 7,98 chồi/mẫu Nhân giống thông qua phương pháp gây vết thương Sử dụng phương pháp gây vết thương kích thích tạo chồi bên cho hệ số nhân giống cao thu giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tương ứng với tỷ lệ (4,48; 5,37; 5,31 chồi/mẫu) môi trường SH lỏng với giá thể bơng gịn có bổ sung 0,4 - 0,6 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose 24 Phương pháp nhân giống tối ưu (phương pháp hủy đỉnh) Phương pháp hủy đỉnh kích thích tạo chồi bên cho hệ số nhân giống cao thu giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tương ứng với tỷ lệ (5,61; 5,48; 6,00 chồi/mẫu) môi trường SH lỏng với giá thể bơng gịn có bổ sung 0,4 - 0,6 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose Trồng vườn ươm Cây in vitro giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tạo phương pháp gieo hạt, phương pháp cắt đốt, phương pháp hủy đỉnh, phương pháp gây vết thương, phương pháp cảm ứng tạo callus PLB sinh trưởng tốt thu giá thể dớn Đài Loan với tỷ lệ sống sót 100% sau 24 tháng Đã hồn thiện quy trình tái sinh nhân giống tối ứu giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Phương pháp tái sinh tối ưu phương pháp tạo mẫu ban đầu từ đốt thân thu với tỷ lệ mẫu cấy tái sinh (48,45%; 44,90%; 25,3%) giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo có nguồn gốc từ điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh môi trường SH lỏng với giá thể bơng gịn, có bổ sung mg/L TDZ, 0,3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, pH = 5,8 Phương pháp nhân giống tối ưu thu từ phương pháp hủy đỉnh kích thích tạo chồi bên giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tương ứng với tỷ lệ (5,61; 5,48; 6,00 chồi/mẫu) môi trường SH lỏng với giá thể bơng gịn có bổ sung 0,4 - 0,6 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose Đề nghị Phương pháp gieo hạt, nhân giống thơng qua PLB có nguồn gốc từ hạt áp áp dụng cho công tác bảo tồn lai tạo giống Đề nghị triển khai quy trình tái sinh nhân giống tối ưu giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo nêu Tiếp tục nghiên cứu trình hình thành callus từ lát cắt ngang lóng thân từ phận khác in vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo ex vitro Tiếp tục nghiên cứu trình hình thành callus PLB từ phận khác in vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Tiếp tục nghiên cứu chế tác động lên q trình kéo dài lóng thân đối tượng lan hài  ... thiện quy trình tái sinh nhân giống tối ứu giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Phương pháp tái sinh tối ưu phương pháp tạo mẫu ban đầu từ đốt thân thu với tỷ lệ mẫu cấy tái sinh (48,45%;... g/L sucrose 24 Phương pháp nhân giống tối ưu (phương pháp hủy đỉnh) Phương pháp hủy đỉnh kích thích tạo chồi bên cho hệ số nhân giống cao thu giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tương... tượng lan Vân hài phương pháp cắt đốt trồng trực tiếp vườn ươm đối tượng lan hài Hồng Trong trình nghiên cứu, đề tài đưa thêm phương pháp nhân giống nghiên cứu in vitro đối tượng lan hài (phương pháp