Sử dụng kỹ thuật PCRRFLP trong nghiên cứu mối tương quan của đoạn Gene GH đến sinh trưởng của lợn rừng lai

viii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGUYỄN THỊ QUYÊN Tên đề tài: SỬ DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP TRONG NGHIÊN CỨU MỐI TƢƠNG QUAN CỦA ĐOẠN GENE GH ĐẾN SINH TRƢỞNG CỦA LỢN RỪNG LAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2011-2015 Thái Nguyên, năm 2015 viii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGUYỄN THỊ QUYÊN Tên đề tài: SỬ DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP TRONG NGHIÊN CỨU MỐI TƢƠNG QUAN CỦA ĐOẠN GENE GH ĐẾN SINH TRƢỞNG CỦA LỢN RỪNG LAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Lớp : 43 – CNSH Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2011 – 2015 Giảng viên hƣớng dẫn : TS.Dƣơng Văn Cƣờng PGS.TS Ngô Xuân Bình Thái Nguyên, năm 2015 viii LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hoàn thành đƣợc khóa luận tốt nghiệp bên cạnh nỗ lực thân em nhận đƣợc bảo, giúp đỡ, hƣớng dẫn tận tình lời động viên từ thầy cô, bạn bè gia đình Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Dƣơng Văn Cƣờng ThS Ma Thị Trang, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài nhƣ trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn tới thầy cô Khoa Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm dạy dỗ giúp đỡ em suốt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn tới cán bộ, anh chị làm việc Viện Khoa học sống – ĐH Thái Nguyên tạo điều kiện để em học tập hoàn thành đề tài nghiên cứu Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân, bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ em lúc khó khăn trình học tập, nghiên cứu hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng Sinh viên Nguyễn Thị Quyên năm 2015 viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Vị trí cắt enzyme giới hạn DdeI 12 Bảng 3.1: Danh mục loại hóa chất sử dụng đề tài 24 Bảng 3.2: Các trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm 25 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gene GH 31 Bảng 3.4: Sản phẩm PCR đoạn gene GH đƣợc xử lý enzyme giới hạn DdeI 32 Bảng 4.1: Tỉ số OD260 nm/OD280 nm nồng độ DNA 37 Bảng 4.2: Tỷ lệ kiểu gene GH quần thể lợn nghiên cứu 41 Bảng 4.3: Tần số alen D1 D2 đoạn gene GH quần thể lợn 43 Bảng 4.4: Sinh trƣởng tích lũy lợn rừng lai lợn Yorkshire đối chứng (kg) 44 Bảng 4.5: Sinh trƣởng tuyệt đối lợn rừng lai lợn Yorkshire đối chứng (g/con/ngày) 46 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Chu kỳ thứ phản ứng PCR Hình 2.2: Hình ảnh mô kiểu gene GH lợn 13 Hình 2.3: Kích thƣớc alen có quần thể lợn 14 Hình 2.4: Kích thƣớc đoạn DNA dự kiến thu đƣợc phân tích đa hình đoạn gene GH DdeI 15 Hình 2.5: Hình ảnh mô vị trí cắt đa hình enzyme DdeI đoạn gene GH 16 Hình 2.6: Đoạn gene GH nghiên cứu, vị trí cắt enzyne DdeI trình tự dich mã sang protein đoạn gene GH 17 Hình 3.1: Sơ đồ quy trình phân tích đa hình gene GH enzyme DdeI 27 Hình 3.2: Sơ đồ quy trình chiết DNA tổng số 30 Hình 3.3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene GH 31 Hình 4.1: Hình ảnh giống lợn nghiên cứu: Lợn rừng lai Lợn Yorkshire 35 Hình 4.2: Sản phẩm DNA tách chiết từ mẫu mô tai lợn 36 Hình 4.3: Sản phẩm PCR nhân lên từ cặp mồi GH 39 Hình 4.4: Kết phân tích đa hình đoạn gene GH DdeI 40 Hình 4.5: Biểu đồ tần số kiểu gene lợn rừng lai giống Yorkshire đối chứng 42 Hình 4.6: Biểu đồ tần số alen D1 alen D2 đoạn gene GH 44 viii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Bp : Base paire DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleoside triphosphate EtBt : Ethidium bromid TBE : Tris boric acid – EDTA TE : Tris – EDTA RNA : Ribonucleic acid PCR : Polymerase chain Reaction RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism DNA OD : Optical density v/p : Vòng/phút Cs : Cộng CIAA : 24 Chloroform: Isoamylacohol viii MỤC LỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm chung lợn rừng lai 2.2 Đặc điểm chung lợn Yorkshire 2.3 Cơ sở khoa học 2.3.1 Khái niệm sinh trƣởng phát triển 2.3.1.1 Khái niệm sinh trƣởng 2.3.1.2 Khái niệm phát triển 2.3.1.3 Mối quan hệ sinh trƣởng phát triển 2.3.2 Các tiêu liên quan đến khả sinh trƣởng lợn 2.3.3 Khái niệm đa hình gene 2.3.4 Khái quát phần mềm Vector NTI 2.3.5 Phƣơng pháp tách chiết DNA .8 2.3.6 Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) .9 2.3.7 Kỹ thuật PCR-RFLP 10 2.4 Gene hormone sinh trƣởng GH (Growth Hormone) 12 2.5 Các kiểu gene phân tích đa hình đoạn gene GH enzyme DdeI 14 2.6 Vị trí cắt đa hình enzyme DdeI gene GH 15 2.7 Tình hình nghiên cứu nƣớc 18 viii 2.7.1 Tình hình nghiên cứu giới .18 2.7.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc .20 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 23 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 23 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 23 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 23 3.2.2 Thời gian tiến hành .23 3.3 Vật liệu, hóa chất trang thiết bị 23 3.3.1 Vật liệu 23 3.3.2 Hóa chất .24 3.3.3 Trang thiết bị .25 3.4 Nội dung nghiên cứu 26 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu tiêu theo dõi 26 3.5.1 Quy trình thực .27 3.5.2 Các tiêu theo dõi 27 3.5.2.1 Các tiêu nghiên cứu đa hình gene 27 3.5.2.2 Các tiêu theo dõi sinh trƣởng 27 3.5.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 3.5.3.1 Lấy mẫu mô tai 28 3.5.3.2 Phƣơng pháp tách chiết tinh DNA tổng số 28 3.5.3.3 Phƣơng pháp PCR 30 3.5.3.4 Phƣơng pháp PCR-RFLP 32 3.5.3.5 Phƣơng pháp phân tích kết 32 3.5.4 Sinh trƣởng tuyệt đối sinh trƣởng tƣơng đối lợn thí nghiệm 33 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 viii 4.1 Đặc điểm hình thái đối tƣợng nghiên cứu đối chứng 35 4.2 Kết phân tích đa hình đoạn gene GH 36 4.2.1 Tách chiết DNA tổng số .36 4.2.1.1 Kết điện di sản phẩm DNA tổng số 36 4.2.1.2 Kết đo OD260nm/OD280nm nồng độ DNA 37 4.2.2 Kết PCR đoạn gene GH cặp mồi đặc hiệu 38 4.2.3 Kết phân tích đa hình đoạn gene GH DdeI 39 4.3 Kết phân tích mối tƣơng quan đoạn gene GH đến khả sinh trƣởng lợn rừng lai 44 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 5.1 Kết luận 49 5.2 Đề nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 I Tiếng Việt 51 II Tiếng Anh 52 III Các tài liệu tham khảo từ Internet 49 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Những năm qua chăn nuôi lợn nƣớc ta có bƣớc phát triển nhanh chóng đóng góp khoảng 70% tổng sản phẩm tiêu thụ ngành chăn nuôi (Cục chăn nuôi, 2012) [1] Hiệu ngành chăn nuôi lợn phụ thuộc nhiều vào tốc độ tăng trọng, sản lƣợng thịt khả sinh sản Hơn nữa, theo xu hƣớng nay, thị hiếu ngƣời tiêu dùng quan tâm tới chất lƣợng sản phẩm giá trị dinh dƣỡng nhằm đảm bảo vấn đề sức khỏe thay quan tâm đến giá sản phẩm nhƣ trƣớc Trƣớc nhu cầ u thị trƣờng , nhà chọn giống ý đến chọn lọc giống vâ ̣t nuôi để nâng cao chất lƣợng thịt : tỷ lệ nạc, độ mềm, màu sắc độ thịt nhƣ khả tăng trọng Một hƣớng chăn nuôi hóa lợn rừng, lai tạo với lợn nhà đƣợc nhiều hộ gia đình miền núi nuôi phổ biến theo hình thức bán hoang hứa hẹn trở thành hƣớng làm kinh tế hiệu cao Lợn rừng lai mang ƣu lai cao bố mẹ, đƣợc nuôi chăn thả tự do, vận động ngày nên lợn có sức đề kháng khả chịu đựng kham khổ với môi trƣờng tự nhiên cao, dịch bệnh, thịt nhiều nạc, mỡ, thịt lợn thơm ngon đặc trƣng, hàm lƣợng Cholesteron thấp (Trung Tâm Khuyến Nông Lâm Đồng, 2010) [12] Trong thâ ̣p kỷ vừa qua việc chọn lọc giống vâ ̣t nuôi chủ yếu dựa vào kiểu hình Ngày nay, với phát triển kỹ thuâ ̣t h iện đại nhà nghiên cứu chọn lọc giống vâ ̣t nuôi dựa vào thị phân tử , tăng khả xác, rút ngắn thời gian nâng cao hiệu chọn lọc Trong 42 Hình 4.5: Biểu đồ tần số kiểu gene lợn rừng lai giống Yorkshire đối chứng Qua bảng số liệu 4.2 hình 4.7 cho thấy tỷ lệ phần trăm số cá thể mang kiểu gene (D1D1, D1D2 D2D2) hai giống lợn có khác Ở giống lợn rừng lai thấy xuất kiểu gene D1D1, D1D2 D2D2 với tỷ lệ phần trăm tƣơng ứng là: 33,3%; 56,7%; 10% Tuy nhiên, lợn Yorkshire đối chứng mang kiểu gene D1D1 D1D2 với tỷ lệ tƣơng ứng 63,3% 36,7% tƣơng đối khác so với lợn rừng lai Kết phân tích đa hình đoạn gene GH giống lợn cho thấy tỷ lệ xuất kiểu gene gần nhƣ trái ngƣợc nhau: Lợn rừng lai mang kiểu gene với tỷ lệ kiểu gene D1D2 cao (56,7%), lợn Yorkshire mang kiểu gene nhƣng kiểu gene chiếm tỷ lệ cao lại kiểu gene D1D1 (63,3%) Theo nghiên cứu Franco MM (Franco, Antunes et al, 2005) [19] giống lợn Landrace xuất kiểu gene kiểu gene D1D1 chiếm tỷ lệ cao (66,2%), kiểu gene D1D2 chiếm tỷ lệ thấp (33,8%) Từ kết giải thích sai khác quần thể lợn chúng có nguồn gốc khác nhau: Lợn rừng 43 lai có nguồn gốc từ lợn rừng, mà lợn rừng lại có nguồn gốc từ tự nhiên, chọn lọc tự nhiên hình thành, lợn Yorkshire lại đƣợc tạo thành nhân tạo Theo thuyết chọn lọc tự nhiên Darwin: Những điều kiện sống khác nhau, chọn lọc tự nhiên tích lũy biến dị di truyền theo hƣớng khác nhau, từ cho thấy hai giống lợn có nguồn gốc khác có sai khác mặt di truyền Sự khác lớn tỷ lệ kiểu gene lợn rừng lai lợn Yorkshire phần thấy đƣợc khác khả sinh trƣởng hai quần thể lợn Tuy nhiên để đánh giá so sánh khả sinh trƣởng hai giống lợn cần thu thập số liệu liên quan đến khả sinh trƣởng cá thể hai quần thể này, đồng thời tiến hành bố trí thí nghiệm nuôi hai giống lợn điều kiện Dựa vào kết xác định tỷ lệ kiểu gene GH quần thể lợn tiến hành phân tích tần số alen D1 D2 quần thể lợn Tần số alen đƣợc thể bảng sau: Bảng 4.3: Tần số alen D1 D2 gene GH quần thể lợn Tần số alen Quần thể lợn Lợn rừng lai Lợn Yorkshire D1 0,62 0,82 D2 0,38 0,18 44 Hình 4.6: Biểu đồ tần số alen D1 alen D2 đoạn gene GH Từ kết phân tích tần số alen cho thấy lợn rừng lai có tần số alen D1 chiếm ƣu alen D2 hai quần thể Tuy nhiên, tần số alen D1 (0,62) lợn rừng lai thấp so với tần số alen D1 (0,82) giống đối chứng Yorkshire ngƣợc lại, tần số alen D2 (0,38) lợn rừng lai lại cao tần số alen D2 (0,18) lợn Yorkshire Sự sai khác lần cho thấy nguồn gốc lợn nhƣ hƣớng chọn lọc khác nguyên nhân dẫn đến sai khác 4.3 Kết phân tích mối tƣơng quan đoạn gene GH đến khả sinh trƣởng lợn rừng lai Tiếp theo, để đánh giá mối tƣơng quan đoạn gene GH đến khả sinh trƣởng lợn rừng lai lợn Yorkshire đối chứng tiến hành đo tiêu liên quan đến sinh trƣởng hai giống lợn Kết đo số cá thể đại diện đƣợc thể bảng sau: Bảng 4.4: Sinh trƣởng tích lũy lợn rừng lai lợn Yorkshire đối chứng (kg) Lợn rừng lai Lợn Yorkshire 45 Mẫu Mẫu 3 Kiểu Kiểu nghiên tháng tháng tháng nghiên tháng tháng tháng gene gene cứu cứu tuổi tuổi tuổi tuổi tuổi tuổi D1D1 2,4 4,3 6,5 D1D1 6,4 18,2 59,6 16 D1D1 2,5 4,4 6,6 D1D1 6,2 18,1 59,4 17 D1D1 2,3 4,1 6,2 D1D1 6,3 18,2 59,5 44 D1D1 2,3 4,1 6,3 D1D1 6,5 18,4 60,0 50 D1D1 2,4 4,3 6,4 10 D1D1 6,2 18,0 59,4 D1D2 2,8 4,9 7,6 11 D1D1 6,3 18,2 59,6 10 D1D2 2,6 4,7 7,1 13 D1D1 6,3 18,2 59,7 20 D1D2 2,7 4,8 7,3 17 D1D1 6,4 18,4 59,8 21 D1D2 2,6 4,8 7,3 27 D1D1 6,2 18,2 59,5 32 D1D2 2,4 4,6 7,1 D1D2 6,5 18,6 60,5 33 D1D2 2,5 4,6 7,0 D1D2 6,9 19,0 61,2 34 D1D2 2,7 4,7 7,2 22 D1D2 6,7 18,9 61,0 D2D2 2,4 4,4 6,6 28 D1D2 6,7 18,8 60,8 D2D2 2,4 4,3 6,5 37 D1D2 7,1 19,5 62,1 31 D2D2 2,3 4,2 6,3 31 D1D2 7,0 19,3 61,9 Sinh trƣởng tích lũy hay khả tăng khối lƣợng thể, tiêu quan trọng đƣợc nhà chăn nuôi quan tâm, tiêu phản ánh khả sinh trƣởng gia súc Khối lƣợng thể lợn qua tháng nuôi tiêu chuẩn để đánh giá khả sinh trƣởng đàn lợn Trong chăn nuôi, sinh trƣởng tích lũy cao rút ngắn đƣợc thời gian chăn nuôi giảm chi phí thức ăn công chăm sóc (Nguyễn Văn Nơi, Trần Văn Phùng et al, 2010) [6] Nhìn vào bảng kết số liệu thu đƣợc ta thấy phần lớn lợn rừng lai mang kiểu gene D1D2 cho khối lƣợng sau 1, 2, tháng nuôi cao so với 46 hai kiểu gene D1D1, D2D2 khối lƣợng lợn rừng lai mang kiểu gene D1D1, D2D2 sau tháng nuôi gần tƣơng đƣơng Tuy nhiên, để đánh giá xác khả sinh trƣởng lợn mang kiểu gene D1D1 so với lợn mang kiểu gene D2D2 cần tiến hành quan sát phân tích với số lƣợng mẫu nhiều Ngoài ra, nhìn vào bảng số liệu thấy đƣợc khối lƣợng lợn Yorkshire đối chứng mang kiểu gene D1D2 sau 1, 2, tháng nuôi cao so với lợn Yorkshire mang kiểu gene D1D1 Theo nghiên cứu Franco MM (2005)[19] giống lợn ngoại Landrace cho kết số ADG (tăng trọng bình quân/ngày) lợn mang kiểu gene D1D2 cao lợn mang kiểu gene D1D1, điều chứng tỏ lợn Landrace mang kiểu gene D1D2 có khả sinh trƣởng cao lợn Landrace mang kiểu gene D1D1 Những kết nghiên cứu nhằm tăng tính tin cậy mối tƣơng quan kiểu gene D1D1 D1D2 đến khả sinh trƣởng lợn rừng lai, cho thấy quần thể lợn rừng lai nghiên cứu, cá thể mang kiểu gene D1D2 có khả sinh trƣởng cao cá thể mang kiểu gene D1D1 Đây kết vị trí gene xuất đa hình đơn nucleotide làm thay đổi ba mã hóa dẫn đến làm thay đổi amino acid trình tự protein, từ làm thay đổi số lƣợng hormone sinh trƣởng đƣợc tạo thể Việc đánh giá khả sinh trƣởng lợn thể việc tăng khối lƣợng thể, đƣợc tính dƣới dạng sinh trƣởng tuyệt đối (g/con/ngày) sinh trƣởng tƣơng đối (%) Trong nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp theo dõi sinh trƣởng tuyệt đối Kết theo dõi sinh trƣởng tuyệt đối lợn thí nghiệm đƣợc trình bày bảng 4.5: Bảng 4.5: Sinh trƣởng tuyệt đối lợn rừng lai lợn Yorkshire đối chứng (g/con/ngày) 47 Lợn rừng lai Lợn Yorkshire Mẫu nghiên cứu Kiểu gene 1-2 tháng tuổi 2-3 tháng tuổi Mẫu nghiên cứu Kiểu gene 1-2 tháng tuổi 2-3 tháng tuổi D1D1 63,3 73,3 D1D1 393,3 1380,0 16 D1D1 63,3 73,3 D1D1 396,7 1376,7 17 D1D1 60,0 70,0 D1D1 396,7 1376,7 44 D1D1 60,0 73,3 D1D1 396,7 1386,7 50 D1D1 63,3 70,0 10 D1D1 393,3 1380,0 D1D2 70,0 90,0 13 D1D1 396,7 1380,0 10 D1D2 70,0 80,0 17 D1D1 396,7 1383,3 20 D1D2 70,0 83,3 22 D1D1 400,0 1380,0 21 D1D2 73,3 83,3 27 D1D1 400,0 1376,7 32 D1D2 73,3 83,3 11 D1D2 403,3 1396,7 33 D1D2 70,0 80,0 D1D2 403,3 1406,7 34 D1D2 66,7 83,3 28 D1D2 406,7 1403,3 D2D2 66,7 73,3 37 D1D2 403,3 1400,0 D2D2 63,3 73,3 D1D2 413,3 1420,0 31 D2D2 63,3 70,0 30 D1D2 410,0 1420,0 Kết bảng 4.5 cho thấy, sinh trƣởng tuyệt đối lợn thí nghiệm có diễn biến tƣơng tự nhƣ trƣởng tích lũy tuân theo quy luật chung sinh trƣởng gia súc Ở hai quần thể lợn nghiên cứu phần lớn thấy sinh trƣởng tích lũy cá thể mang kiểu gene D1D2 cao so với cá thể mang kiểu gene D1D1 Ở quần thể lợn rừng lai, sinh trƣởng tuyệt đối cá thể mang kiểu gene D1D1 D2D2 gần tƣơng đƣơng nhau, việc đánh giá tƣơng quan hai kiểu gene đến khả sinh trƣởng quần thể lợn rừng lai chƣa 48 đƣợc khẳng định xác, cần nghiên cứu với số lƣợng mẫu nhiều để tăng tần số xuất kiểu gene D2D2, từ đánh giá đƣợc khả sinh trƣởng cá thể lợn rừng lai mang kiểu gene D1D1 so với cá thể mang kiểu gene D2D2 49 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Sử dụng enzyme DdeI phân tích đa hình đoạn gene GH lợn rừng lai giống lợn đối chứng Yorkshire cho thấy tỷ lệ kiểu gene hai giống lợn tƣơng đối khác nhau: Ở lợn rừng lai xuất kiểu gene D1D1, D1D2 D2D2 với tỷ lệ tƣơng ứng 33,3%, 56,7%, 10% lợn Yorkshire xuất kiểu gene D1D1, D1D2 với tỷ lệ tƣơng ứng 63,3%, 36,7% Tần số alen D1 chiếm ƣu giống lợn Tuy nhiên, lợn Yorkshire tần số alen D1 (0,82) cao alen D2 (0,18) nhiều, lợn rừng lai tần số alen D1 (0,62) alen D2 (0,38) chênh lệch nhiều - Đã nghiên cứu đƣợc mối tƣơng quan kiểu gene D1D2 D1D1, D2D2 tới khả sinh trƣởng lợn rừng lai Những cá thể lợn rừng lai mang kiểu gene D1D2 có khả sinh trƣởng cao cá thể mang kiểu gene D1D1 D2D2 5.2 Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu mối tƣơng quan kiểu gene đến khả sinh trƣởng lợn rừng lai số lƣợng mẫu nghiên cứu nhiều để đánh giá xác đƣợc khả sinh trƣởng cá thể mang kiểu gene D1D1 so với cá thể mang kiểu gene D2D2 - Tiếp tục nghiên cứu đánh giá tính đa hình đoạn gene GH đối tƣợng lợn rừng lai nghiên cứu với số lƣợng cá thể nhiều kiểm tra tính đa hình hệ sau Đồng thời theo dõi di truyền 50 alen mối liên quan đến tốc độ tăng trọng từ đời bố mẹ sang đời F1 F2 nhƣ - Thu thâ ̣p thêm số liệu khả sinh trƣởng suất thịt cá thể lợn rừng lai có kiểu gene đƣợc xác định, để tìm xem mối tƣơng quan tính đa hình locus gene ảnh hƣởng đến khả sinh trƣởng suất, chất lƣợng thịt hệ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Cục chăn nuôi (2012), Báo cáo tình hình sản xuất, tiêu thụ sản phẩm ngành chăn nuôi, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, Hà Nội Ngô Xuân Bình (2004), Giáo trình công nghệ sinh học, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Hậu, et al (1999), Phân tích trình tự nucleotide gen hormone sinh trưởng số giống lợn nội Việt Nam, Tóm tắt báo cáo khoa học năm 1999, Hội nghị khoa học Viện chăn nuôi, 13-14/7/2000: 156-157 Phạm Thành Hổ (2008), Di truyền học, NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Văn Nơi, et al (2010), "Nghiên cứu đa hình số gen khả sinh trƣởng đa hình kiểu gen Mc4R GHRH lợn rừng lai lợn đực Thái Lan nái địa phƣơng Pác Nặm", Tạp chí Khoa học & Công nghệ Nông nghiệp &PTNT Nguyễn Văn Nơi, et al (2010), Phân tích đa hình gen Mc4R GHRH lợn đực rừng lai giữaq đực rừng nái địa phƣơng Pác Nặm, "Tạp chí Khoa học công nghệ Chăn nuôi Viện chăn nuôi quốc gia Hà Nội" Nguyễn Thanh Sơn, et al (2008), Tài liệu tập huấn Kỹ Thuật Chăn Nuôi Lợn Sinh Sản Hướng Nạc, Bộ NN & PTNT, Trung tâm khuyến nông khuyến ngƣ quốc gia Khuất Hữu Thanh (2006) "Kỹ thuật gen Nguyên lý ứng dụng." NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Khuất Hữu Thanh (2012), Cơ sở Di Truyền Phân Tử Kỹ Thuật Gen", NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 52 10 Lƣu Thị Thúy, et al (2004), "Đa hình kiểu gen Leptin liên quan đến tính rạng kinh tế số giống lợn nuôi Việt Nam", Tạp chí di truyền ứng dụng, số 11 Nguyễn Thị Diệu Thúy, et al (2004), Đa hình di truyền gen hormone sinh trưởng giống lợn Móng Cái, Viện công nghệ sinh học 2(1): 19-24 12 Trung Tâm Khuyến Nông Lâm Đồng, Sở Nông Nghiệp Và Phát triển nông thôn Lâm Đồng (2010), Kỹ thuật nuôi heo rừng lai 13 Nguyễn Đăng Vang (2005), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tử chọn tạo giống vật nuôi suất cao, Báo cáo tổng kết đề tài cấp nhà nƣớc KC 04-03 II Tiếng Anh 14 Baskin, L C and D Pomp (1997), Rapid communication: restriction fragment length polymorphism in amplification products of the porcine growth hormone-releasing hormone gene, J Anim Sci 75(8): 2285 15 C Knorr, et al (1997), Association of GH gene veriants with performce traits in F2 generation of European wild boar, Pietrain and Meishan pigs, Anim.Genet, (28): 124-128 16 Cogan, J D and J A Phillips, 3rd (1998), Growth disorders caused by genetic defects in the growth hormone pathway, Adv Pediatr 45: 337-361 17.Cheng, W T., et al (2000), Growth hormone gene polymorphisms and growth performance traits in Duroc, Landrace and Tao-Yuan pigs, Theriogenology 54(8): 1225-1237 18 Chowdhary, B P., et al (1994), Precise localization of the genes for glucose phosphate isomerase (GPI), calcium release channel (CRC), hormone-sensitive lipase (LIPE), and growth hormone (GH) in pigs, using nonradioactive in situ hybridization, 67(3): 211-214 Cytogenet Cell Genet 53 19 Franco, M M., et al (2005), Association of PIT1, GH and GHRH polymorphisms with performance and carcass traits in Landrace pigs, J Appl Genet 46(2): 195-200 20 Kato, Y., et al (1990), Porcine growth hormone: molecular cloning of cDNA and expression in bacterial and mammalian cells, Biochim Biophys Acta 1048(2-3): 290-293 21 Larsen, N J and V H Nielsen (1993), ApaI and CfoI polymorphisms in the porcine growth hormone gene, Anim Genet 24(1): 71 22 Mariusz Pierzchała, et al (2004), Growth rate and carcass quality in relation to GH/MspI and GH/HaeII PCR-RFLP polymorhism in pigs, Animal Science Papers and Reports 22(1): 57-64 23 Nielsen VH and Larsen NJ (1991), Restriction fragment length polymorphism at the growth hormone gene in pigs, Anim Genet 22.: 291-294 24 Nielsen, V H., et al (1995), Association of DNA polymorphism in the growth hormone gene with basal plasma growth hormone concentraction and production traits in pigs, J.Anim Breed gene(112): 205-212 25 Song, C Y., et al (2003), Study on pig growth hormone gene polymorphisms in western meat-type breeds and Chinese local breeds, J Zhejiang Univ Sci 4(6): 734-739 26 Vize PD and Wells JR ( 1987), Isolation and characterization of the porcine growth hormone gene, (55): 339-344 27 Wang, W P., et al (2009), Estimation of allele frequency in pooled DNA by using PCR-RFLP combined with microchip electrophoresis, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 877(14-15): 1603-1606 28 Yerle, M., et al (1993), Localization of the porcine growth hormone gene to chromosome 12p1.2 >p1.5, Anim Genet 24(2): 129-131 III Các tài liệu tham khảo từ Internet 54 29.http://www.rovimeo.com/vn/ky-thuat/ky-thuat-lai-tao-va-chon-giong/cacnguyen-ly-ve-giong-va-di-truyen/ 55 PHỤ LỤC Trình tự đoạn gene GH (GenBank accession: M17704.1) cccgggggac atgaccccag aggaggagcg ggaacaggat gagtgggagg aggttctaaa 61 ttatccatta gcacatgcct gccagtgggc catgcataaa tgtatagaga aaataggtgg 121 gggcagaggg agagagaaga ggccagggta taaaaagggc ccaaaaggga ccaattccag 181 aatcccagga cccagctccc cagaccactc agggacctgt ggacagctca ccggctgtga 241 tggctgcagg caagtgcccc taaaatccca gtggcttggt gtgttctgaa gggtgacgtg 301 ggggccatgc agatggatgg ggcaccaacc ttgggctttg gggtttccga atgtgagcat 361 ggatatctac tcctagatat gaggccaagt tttaaatgtc cctgggggag ggggaggaga 421 agggacaggg ctggtggagc caggcctctt gtctctggga tccctctctc acgggccctc 481 ctggtctcta ggccctcgga cctccgcgct cctggctttc gccctgctct gcctgccctg 541 gactcgggag gtgggcgcct tcccagccat gcccttgtcc agcctatttg ccaacgccgt 601 gctccgggcc cagcacctgc accaactggc tgctgacacc tacaaggagt ttgtaagctc 661 cccagggagg gtgctggagg ggggtggtgg agaggggtga attcgtccct ctctgcctag 721 tgggaggaaa atgaggggtt ctggagtatt gaggccaacc gaagatgcta tcaggtgagt 781 gtaaactgaa ggggattccc aagaaaagca gcaaggagaa ccgcgcccca gtgtagacct 841 ggatggctgt cccctctccc aggagcgcgc ctacatcccg gagggacaga ggtactccat 901 ccagaacgcc caggctgcct tctgcttctc ggagaccatc ccggccccca cgggcaagga 961 cgaggcccag cagagatcgg tgagtggcca cctgccacct gccagccggg gagcaggggc 1021 ctccctcttc ctaagaaggc tgccccatct ctcatcatca gggccttggg cggccttctc 1081 cccgagctgg tgggggtgat ggtggcagag ggcggggtgg tgagggggac gcccaccggc 1141 ggaggcagcg ccccccatcc acgcatctgc ccgcaggacg tggagctgct gcgcttctcg 1201 ctgctgctca tccagtcgtg gctcgggccc gtgcagttcc tcagcagggt cttcaccaac 1261 agcctggtgt ttggcacctc agaccgcgtc tacgagaagc tgaaggacct ggaggagggc 1321 atccaggccc tgatgcgggt ggggaggcgc gctcgggtcc cgcacactgg ggcccatgcc 1381 ggctctctcc cggctgagcg gagcggtggg gggacgcacg tgggctgggg gagagggtcc 1441 cgatgctctc tctgtagcag ttcactctcg acccggagaa atcttttcct catttccccc 1501 tgcggagtct tccctctttg tccttctcca agcatggagg ggagggtgga agacggaggg 1561 gacaggagag cgccgctgcc aaggactcgg cctctgtctc tctctccctt ttgcaggagc 1621 tggaggatgg cagcccccgg gcaggacaga tcctcaagca aacctacgac aaatttgaca 1681 caaacttgcg cagtgatgac gcgctgctta agaactacgg gctgctctcc tgcttcaaga 1741 aggacctgca caaggctgag acatacctgc gggtcatgaa gtgtcgccgc ttcgtggaga 1801 gcagctgtgc cttctagttg ctgggcatct ctgttgcccc tccccagtac ctcccctgac 1861 cctggaaagt gccaccccaa tgcctgctgt cctttcctaa taaaaccagg ttgcatcgta 1921 ttgtctgagt aggtgtcact ctgcgatgga gggaggtggg gcagtagggc aaggggtggg 1981 ggtgggaaga caacctgcag gcatccttgg gggtctcctg gggacctaga cactgaatga 2041 tggttgaccc ggcttcttcc tgggcttgaa agagcaggca cattaccttc tctctgttac 2101 acacccactg cacccactgc tcaggtctgc agtccagctt gctgggcact cataggtcag 56 2161 gaccaccccc catcctgcta caccccccgc ctcccataaa gtacccaaga atggaaagag 2221 atgaaagcaa g [...]... cứu đa hình đoạn gene GH trên lợn rừng lai - Nghiên cứu mối tƣơng quan của phân đoạn gene GH đến khả năng sinh trƣởng của lợn rừng lai và lợn Yorkshire đối chứng 1.3 Ý nghĩa của đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học - Xác định đƣợc đa hình đoạn gene GH là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu mối tƣơng quan giữa kiểu gene GH tới tốc độ sinh trƣởng của lợn rừng lai và lợn Yorkshire 3 1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn... ở lợn cũng đƣợc nghiên cứu khá phổ biến Tuy nhiên, các nghiên cứu hầu hết chỉ thực hiện trên các giống lợn ngoại và lợn nội thuần, các giống lợn lai vẫn chƣa đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu 23 PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Lợn Rừng Lai - Lợn đối chứng (Yorkshire) 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu. .. chỉ tiêu theo dõi 3.5.2.1 Các chỉ tiêu nghiên cứu đa hình gene - Nhân đoạn gene GH ở lợn thí nghiệm - Tính đa hình đoạn gene GH ở lợn nghiệm - Các kiểu gene GH ở lợn thí nghiệm - Ảnh hƣởng của kiểu gene đến tăng trọng của lợn thí nghiệm 3.5.2.2 Các chỉ tiêu theo doĩ về sinh trưởng - Sinh trƣởng tích luỹ của lợn thí nghiệm - Sinh trƣởng tuyệt đối của lợn thí nghiệm ... ứng dụng những tiến bộ của kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử vào trong chăn nuôi lợn rừng lai để có đƣợc hiệu quả kinh tế cao nhất cho ngƣời chăn nuôi mà sản phẩm vẫn giữ đƣợc phẩm chất và hƣơng vị đặc trƣng, tôi tiến hành thực hiện đề tài: Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong nghiên cứu mối tƣơng quan của đoạn gene GH đến sinh trƣởng của lợn rừng lai 1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài - Nghiên cứu. .. tài: Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong nghiên cứu mối tương quan của đoạn gene GH đến sinh trưởng của lợn rừng lai đƣợc thực hiện từ tháng 1/2015 đến tháng 6/2015 3.3 Vật liệu, hóa chất và trang thiết bị 3.3.1 Vật liệu - Tổng số 60 mẫu mô tai lợn gồm 30 mẫu mô tai lợn rừng lai và 30 mẫu mô tai lợn Yorkshire làm đối chứng 24 - Mẫu mô tai đƣợc bảo quản trong cồn 70% và cất trong tủ lạnh -200C cho đến. .. cứu - Phân tích đa hình kiểu gene GH bằng phƣơng pháp PCR-RFLP - Xác định các kiểu gene của đoạn gene GH Nội dung 2 Nghiên cứu mối tƣơng quan giữa đa hình kiểu gene GH với khả năng sinh trƣởng của lợn rừng lai 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi 27 3.5.1 Quy trình thực hiện Hình 3.1: Sơ đồ quy trình phân tích mối tƣơng quan của đoạn gene GH đến khả năng sinh trƣởng 3.5.2 Các chỉ tiêu... trọng của giống lợn ngoại và giống lợn nội Móng Cái (Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Thu Thúy et al, 2004) [11] Các gene liên quan đến khả năng sinh trƣởng ở lợn đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu tƣơng đối phổ biến bằng cách sử dụng các enzyme giới hạn khác nhau Các nghiên cứu đã cho thấy đƣợc mối tƣơng quan của các kiểu gene tới tốc độ sinh trƣởng ở lợn Trong đó, gene GH liên quan đến khả năng sinh trƣởng...2 đó, nghiên cứu các mối liên quan về đa hình gene với các tính trạng sinh trƣởng là rất quan trọng trong công tác chọn giống (Nguyễn Văn Nơi, Trần Văn Phùng et al, 2010) [6] Gene GH (Growth Hormone – Hormone sinh trƣởng) là một trong những gene liên quan đến khả năng sinh trƣởng của lợn đã đƣợc các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu Hormone sinh trƣởng (GH) là một trong những nhân tố quan trọng... Phân đoạn gene GH (605 bp) Hình 2.6: Đoạn gene GH nghiên cứu, vị trí cắt của enzyme DdeI và trình tự dich mã sang protein của đoạn gene GH Chú ý: - (1) Trình tự màu tím l vị trí đoạn gene GH có thể bị cắt bởi enzyme DdeI để làm xuất hiện kiểu gene D1D1, D1D2 - (2) Hai trình tự mầu đỏ là hai vị trí bám của mồi xuôi và mồi ngƣợc trong phản ứng PCR nhân đoạn gene GH (605 bp) Trình tự phân đoạn gene GH bắt... (Wang, Zhang et al, 2009) [27] 12 Trong nghiên cứu này tôi sử dụng kỹ thuật PCR để nhân đoạn gene GH với kích thƣớc 605 bp và sử dụng enzyme cắt giới hạn DdeI để nghiên cứu đa hình gene GH trong quần thể lợn nghiên cứu Vị trí cắt của enzyme giới hạn DdeI đƣợc mô tả nhƣ bảng sau: Bảng 2.1: Vị trí cắt của enzyme giới hạn DdeI Cặp mồi Nguồn gốc Vi khuẩn GH/ DdeI Desulfovibrio desulfuricans Trình tự 5’