NGHIÊN CỨU ĐỒNG BIỂU HIỆN CỦA GEN crtB, At-VTE3 VÀ At-VTE4 Ở ĐẬU TƯƠNG Phạm Thu Dung1, Trần Vũ Hải1, Phạm Ngọc Tú1, Trần Như Ngọc1, Zhanyuan Zhang Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Thành phố Cần Thơ Trường Đại học Missouri- Columbia (Bang Missouri, Hoa Kỳ) E-mail: tranvuhai2005@yahoo.com TÓM TẮT Đậu tương nguồn dinh dưỡng quý giá với hàm lượng protein dầu cao, nhiên hàm lượng vitamin lại thấp Mục tiêu nghiên cứu tăng hàm lượng carotenoid (tiền vitamin A) vitamin E (tocopherol) hạt đậu tương Bằng cách biến đổi trình sinh tổng hợp carotenoid tocopherol hạt đậu tương với việc đồng biểu ba gen: phytoene synthase (crtB) từ khuẩn Erwinia uredovora, 2-methyl-6-phytylbenzoquinol methyl (At-VTE3) từ Arabidopsis γ-tocopherol methyl transferase (VTE4) từ đậu tương cách dùng trình tự FMDV 2A tạo thành cấu trúc 2A-polyprotein Cấu trúc chuyển vào đậu tương phương pháp lây nhiễm với Agrobacterium tumefaciens thông qua nốt mầm Kết thí nghiệm tạo dòng đậu tương chuyển gen có hạt màu vàng Phân tích HPLC cho thấy hàm lượng carotenoid tổng số hạt đậu tương chuyển gen 128µg/g, cao 25 lần so với hạt đậu tương không chuyển gen; đó, 98% tiền-vitamin A Tuy nhiên, hạt đậu tương chuyển gen lại giảm hàm lượng vitamin E có biến đổi thành phần fatty acid Ngoài ra, tỉ lệ nảy mầm đậu tương chuyển gen thí nghiệm thấp (50%) chậm, kiểu hình còi cọc giai đoạn đầu phát triển ghi nhận đậu tương chuyển gen Từ khóa: đậu tương, tiền vitamin A (carotenoid), vitamin E (tocopherol), FMDV 2A (Foot and Mouth Disease Virus) I ĐẶT VẤN ĐỀ Đậu tương [Glycine max (L.)] giống trồng quan trọng giới, việc nâng cao giá trị dinh dưỡng chức hạt đậu tương nhận nhiều quan tâm nhằm tăng giá trị thực phẩm sức khỏe người Carotenoid (tiền vitamin A) tocopherol (vitamin E) chất chống oxy hóa, việc hấp thu chất phần ăn cho giảm nguy gây nhiều bệnh nguy hiểm người Tuy nhiên, hai vitamin có ích tổng hợp trồng sinh vật quang hợp Việc biến đổi trình sinh tổng hợp carotenoid tocopherol thực thành công trồng khác “Gạo vàng” (“Golden rice”) ví dụ điển hình cho trồng chuyển gen, thành công việc tăng hàm lượng β-carotene 0,8µg/g “Golden rice 1” 35µg/g β-carotene “Golden rice 2” ) Trong “Golden rice 1” “Golden rice 2”, hai gen mã hóa enzyme phytoene synthase (psy) phytoene desaturase (crtI) chuyển vào lúa hai vector riêng biệt, báo cáo gần đề cập đến hệ gạo vàng “New Golden rice” tăng hàm lượng carotenoid việc biểu đồng thời hai gen vector sử dụng trình tự 2A (psy-2A-crtI) hay gọi PAC Nhiều nhóm nghiên cứu giới thành công việc tạo trồng chuyển gen tăng hàm lượng tocopherol việc tăng cường biểu số enzyme trình sinh tổng hợp tocopherol Arabidopsis đậu tương Trong nghiên cứu này, tiến hành đánh giá khả thay đổi hàm lượng thành phần carotenoid tocopherol hạt đậu tương qua việc sử dụng trình tự 2A cho biểu đồng thời gen đường sinh tổng hợp carotenoid tocopherol II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu điều kiện nuôi trồng Hạt đậu tương dùng cho thí nghiệm chuyển nạp gen nghiên cứu giống Maverick lấy từ quỹ tài trợ hạt giống Missouri (Hoa Kỳ) Hạt T thu từ tái sinh (cây T0) thí nghiệm chuyển nạp gen đậu tương dùng để phân tích sinh hóa chạy qRT-PCR với lần phân tích hạt đậu tương, thí nghiệm lặp lại lần Tất đậu tương chuyển gen không chuyển gen (wild type) trồng nhà lưới nhiệt độ 24 -260C tương ứng quang chu kỳ 16h/8h (sáng/tối) Thiết kế cấu trúc 2A (2A-cassette) Cấu trúc gồm ba gen crtB (phytoene synthase), At-VTE3 (Arabidopsis thaliana 2-methyl-6phytylbenzoquinol methyl transferase), VTE4 (Glycine max γ-tocopherol methyltransferase) Mỗi gen gắn transit peptide (TP) (soybean Rubisco small subunit transit peptide) đầu 5’ cách trình tự 2A Trình tự cấu trúc điểu khiển Glycinin promoter Tvsp terminator Trình tự enzyme phân cắt giới hạn EcoRI tạo hai đầu biên cấu trúc clone vào plasmid pUC57 (Hình 1) Toàn cấu trúc dùng để biểu poly-protein crtB-2A-AtVTE3-2A-VTE4 tổng hợp cty GenScript (Hoa Kỳ) Cấu trúc sau gắn vào vector pZY101 chuyển vào Agrobacterium tumefaciens chủng AGL1 Chuyển nạp gen đậu tương: Chuyển nạp gen đậu tương khuẩn Agrobacterium thông qua nốt mầm theo phương pháp với vài cải tiến Phân tích gen (transgene) đậu tương chuyển gen Khảo sát có mặt gen chọn lọc (gen bar): Tất tái sinh sau chuyển gen tiến hành quét (leaf-painting) với Libety 200mg/L ngày sau quét Liberty có tượng chuyển màu vàng chứng tỏ đậu tương không kháng thuốc Liberty (chưa có gen bar chuyển vào) Nếu xanh (kháng thuốc Liberty) bước đầu xác định có gen bar chuyển vào Kiểm tra diện gen quan tâm kỹ thuật PCR: DNA tổng số từ non T0 có kết kháng thuốc Liberty tách chiết tinh kit REDExtractN-AmpTM Plant PCR (Sigma-Aldrich) Trình tự vị trí primer dùng phản ứng PCR liệt kê hình bảng Bảng Các mồi sử dụng phản ứng PCR Mồi (phản ứng PCR) BE3 E3E4 Bar Trình tự (5’-3’) ATGAATAATCCGTCGTTACTCAATCATGCG TTGAAACCGGCATTCTTGAACCACTCAATG ATTGGACCGAGGATATGAGAGACGAC TCAGGTTTTCGACATGTAATGATGGCAAAC CAGCAGGTGGGTGTAGAGCGT CACCATCGTCAACCACTACATCG Mồi (phản ứng qRTPCR) crtB AtVTE3 VTE4 cons7 Trình tự (5’-3’) TTATTGACGATCAGACGCTGG CTTCCTGAAAAGCCGCAAAC GAGCCGTTGAAAGAATGCAAG CCCTGTACGCTTCCCTTATTC CATGGAGAGTGGAGAGCATATG TGTAAGGATTGTTCGTCAGGG ATGAATGACGGTTCCCATGTA GGCATTAAGGCAGCTCACTCT Phân tích qRT-PCR (quantitative real time PCR): Hạt đậu tương non đông lạnh nitơ lỏng trữ tủ đông -80 0C trước phân tích Hạt đậu tương (1 hạt / lần phân tích, thí nghiệm lặp lại lần) nghiền nitơ lỏng trích RNA Trizol (Invitrogen) Mẫu RNA loại bỏ DNA dùng “DNase I, RNase-free” (Thermo Scientific, USA) Mạch cDNA tổng hợp dùng kit iScripTM Reverse Transcription Supermix for RT-PCR (Bio-Rad) Phản ứng qRT-PCR chạy hệ thống CFX-96 TM Real-Time (Bio-Rad, Hoa Kỳ) Mỗi phản ứng gồm 20ng cDNA, 10µM primer, 10µl SsoFast TMEvagreen Supermix (Bio-Rad) thể tích phản ứng điều chỉnh 20µl nước RNase Chu trình PCR: 95 0C phút; (950C 10 giây, 550C 10 giây 720C 20 giây) x 35 chu kỳ; 950C 10 giây, đường nóng chảy (melting curve) tạo việc tăng nhiệt độ từ 65 0C-950C để khảo sát khả khuyếch đại Ba cặp primer dùng để xác định mức độ phiên mã gen cấu trúc 2A (crtB-2A-AtVTE3-2A-VTE4): gen crtB (cặp primer crtB-F/crtB-R), gen At-VTE3 (primer VTE3-F/VTE3-R) gen VTE4 (VTE4-F/VTE4-R) cons7 gen có mức độ biểu ổn định mạnh mô khác hạt đậu tương Do đó, cons7 dùng làm gen tham chiếu thí nghiệm qRT-PCR Trình tự mồi dùng phản ứng liệt kê bảng Ly trích phân tích carotenoid phương pháp HPLC (High performance liquid chromatography) Carotenoid ly trích từ hạt đậu tương theo phương pháp Kean tóm tắt sau: hạt đậu tương (1 hạt / lần phân tích, thí nghiệm lặp lại lần) nghiền thành bột mịn nitơ lỏng 3ml ethanol (0,1% ascorbic axít w/v) cho vào 0,1g bột đậu tương, vortex 20 giây để bể ổn nhiệt 850C phút Dịch trích carotenoid xà phòng hóa 120µl KOH (80% w/v) để 850C 10 phút Thêm 1,5ml nước lạnh vào dịch trích đặt lên đá Carotenoid trích hexane (1,5ml), dịch trích thu sau ly tâm phút (1200 vòng/phút) làm khô dòng chảy nitơ (stream of nitrogen) Mẫu carotenoid khô hòa tan dichloromethane/methanol (50:50 v:v) phân tách cột C30YMC hệ thống HPLC (Hewlett-Packard 1090A) Biểu đồ sắc kí ghi bước sóng 450nm Các mẫu chuẩn (standard) dung môi dùng thí nghiệm giống báo cáo Kean Ly trích phân tích tocopherol phương pháp HPLC (High performance liquid chromatography) Hạt đậu tương (1 hạt / lần phân tích, thí nghiệm lặp lại lần) nghiền thành bột nitơ lỏng, chuyển 50mg bột vào ống thủy tinh có nút vặn, trộn với dịch trích (gồm 80%EtOH 1,5µg/ml tocol internal standard) (Matreya, #1797) Mẫu sau để 15 phút nhiệt độ phòng, ủ 40C 30 phút sau ly tâm 2500 vòng (rpm) 10 phút Hút 0,5µl dịch trích pha lỏng phía vào lọ nhỏ Phân tích tocopherol phương pháp HPLC theo Phân tích fatty acid Ly trích dầu phân tích fatty axít sắc kí khí theo phương pháp công bố trước Hạt đậu tương sau nghiền búa trích qua đêm 1ml chloroform-hexane-methanol (8:5:2, v/v/v) Chuyển 1,5ml dịch trích sang ống 1,5ml trộn với chất methyl hóa (methylating reagent) (gồm 0,5M methanolic sodium methoxide-petroleum ether-ethyl ether, 1:5:2, v/v/v) sau bổ sung thêm hexane cho 1ml Hệ thống máy Agilent seri 6890 (Palo Alto) dùng với cột mao dẫn AT-Silar (Alltech Associates, Deerfield, IL) III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thệ hệ T0: Kết chuyển nạp gen đậu tương thu tái sinh tổng số 400 mẫu (explants) ban đầu tái sinh (HYX-7-1, HYX-7-3 HYX-7-4) xác định có mang gen bar phản ứng PCR (Hình 2) trùng khớp với kết phết với Liberty Kết PCR sử dụng cặp primer (BE3-F/BE3-R E3E4-F/ E3E4-R) xác định mang gen mong muốn (cấu trúc crtB-2A-AtVTE3-2A-VTE4) Hình 2: Phân tích diện gen bar T0 sử dụng cặp primer bar-F/bar-R với chuyển nạp dùng vector pZY101 đối chứng dương, WT (Maverick) đối chứng âm Marker 100bp DNA (NewEngland Biolab) (a) WT HYX-7-1 (b) WT HYX-7-1 Thế hệ T1: Hạt T0 (HYX7-1, HYX-7-3, HYX-7-4) trồng nhà lưới để phân tích di truyền Hình 3: Kiểu hình hạt đậu tương hệ T1 HYX-7-1 WT (Maverick) vỏ đậu (a); Hạt đậu phân ly gen tương tách đôi (b) bar gen mong muốn (2A-cassette) Phản ứng PCR quét Liberty cho kết gen bar bắt gặp T1 HYX-7-1 event mà HYX-7-3 HYX-7-4 Tương tự với kết gen bar, gen mong muốn/ 2A-cassette có T1 HYX-7-1 Kết cho thấy có HYX7-1 mang gen mong muốn tiếp tục phân tích qRT-PCR HPLC Kiểu hình đậu tương chuyển gen Trong tổng số chuyển gen, có HYX-7-1 cho hạt đậu tương màu vàng chứng tỏ hàm lượng carotenoid tăng cao gen crtB mã hóa cho enzyme phytoene synthase biểu (Hình 3) Vì hệ nên HYX-7-1 cho hạt đậu tương (T 1) phân ly với tỉ lệ hạt vàng: hạt trắng 3:1 (trong 59 hạt vàng 189 hạt trắng) Trong đó, hạt T HYX7-3 HYX-7-4 có kiểu hình màu bình thường giống đối chứng (wild type) Hạt T T0 (HYX-7-1, HYX-7-3 HYX-7-4) tiếp tục trồng nhà lưới để phân tích hệ Kết quan sát cho thấy đậu tương trồng từ hạt màu vàng HYX-7-1 có nhiều không hạt làm giảm sản lượng đáng kể hệ T2 qRT-PCR xác định mức độ biểu gen Các hạt đậu tương màu vàng sau nghiền nitơ lỏng, ly trích RNA chạy qRT-PCR để phân tích mức độ biểu gen mong muốn (crtB, AtVTE3, VTE4) cấu trúc 2A (crtB-2A- AtVTE3-2A- VTE4) Kết phân tích cho thấy tất gen biểu mạnh hạt đậu tương HYX-7-1(G) Như dự kiến, đối chứng pZY101 wild type có biểu gen nội sinh (endogenous) VTE4 thấp HYX-7-1(G) từ 3- 10 lần Mặc dù hạt đậu tương màu vàng có mức độ biểu gen cao lại có khác biệt hạt (Hình 4) Hình 4: Phân tích qRT-PCR hạt đậu tương HYX-7-1, WT (Maverick) empty vector pZY101 xác định mức độ biểu gen mục tiêu crtB, AtVTE3, VTE4, với gen cons7 gen tham chiếu, crtB At-VTE3 WT (Maverick) pZY101 nên đưa giá trị Hàm lượng carotenoid tocopherol hạt đậu tương chuyển gen Phân tích carotenoid HPLC nhằm xác định carotenoid tổng số thành phần carotenoid hạt đậu tương HYX-7-1, WT (Maverick) pZY101 Các thành phần carotenoid phân tích HPLC bao gồm: or 9'-cis-lutein, all-trans-lutein, zeaxanthin, 13- or 13'cis-lutein, α-cryptoxanthin, β-crytpoxanthin, 15-cis-β-carotene, 13-cis-β-carotene, α-carotene, all-trans-β-carotene, 9-cis-β-carotene Hạt đậu tương màu vàng tăng carotenoid tổng (tổng carotenoid phân tích) thành phần tiền vitamin A (giá trị tổng β-crytpoxanthin, 15-cisβ-carotene, 13-cis-β-carotene, α-carotene, all-trans-β-carotene, 9-cis-β-carotene) so với đối chứng pZY101 Hàm lượng carotenoid tổng hạt HYX-7-1 tăng cao (giá trị cao 128µg/g), cao 25 lần so với đối chứng (giá trị cao 5,03 µg/g) 45 lần so với hạt pZY101 (giá trị cao 2,85µg/g) Thành phần tiền vitamin A hạt đậu tương màu vàng HYX-7-1 tăng cao chiếm 98% tổng carotenoid, thành phần tiền vitamin A đối chứng pZY101chỉ có 2-3% hay 3-16% Chính vậy, việc sử dụng gen crtB cấu trúc 2A điều khiển promoter Glycinin giúp tăng hàm lượng β-carotenoid hạt đậu tương chuyển gen Tuy nhiên, có khác biệt lớn hàm lượng carotenoid hạt đậu tương event dao động từ 23,54µg/g - 128µg/g HYX-7-1, 1,8µg/g -5 µg/g đối chứng 0,4 µg/g – 2,8 µg/g pZY101 (Hình 5) pZY101 Hàm lượng carotenoid tổng số (µg/g trọng lượng tươi) Hàm lượng tiền vitamin A tổng số (µg/g trọng lượng tươi) Maverick HYX-7-1 Hình 5: Hàm lượng tiền vitamin A carotenoid tổng số hạt đậu tương chuyển gen HYX-7-1 event, pZY101 wild type Maverick Phân tích tocopherol HPLC: Để đánh giá khả biểu gen At-VTE3 mã hóa 2methyl-6-phytylbenzoquinol methyltransferase VTE4 mã hóa γ-tocopherolmethyltransferase đến hàm lượng tocopherol hạt đậu tương chuyển gen, tiến hành phân tích tocopherol hạt đậu tương màu vàng HYX-7-1, đối chứng pZY101 Kết cho thấy hạt đậu tương màu vàng có hàm lượng carotenoid tăng tocopherol lại giảm (dao động từ 0,106 – 0,173 µg/mg) so với đối chứng (0,176 - 0,229 µg/mg) pZY101 (0,176 - 0,221 µg/mg) Cụ thể hạt đậu tương màu vàng giảm γ-tocopherol (0,07 - 0,12 µg/mg) δ-tocopherol (0,03 µg/mg), α-tocopherol thay đổi lớn chí số hạt có hàm lượng tăng so với WT (Bảng 2) Trong đó, hạt đậu tương màu vàng lại giảm tất thành phần tocopherol so sánh với pZY101 Bảng 2: Hàm lượng tocopherol hạt đậu tương chuyển gen HYX-7-1, pZY101 wild type Maverick Tocopherol thành phần (µg/mg) Mẫu Tocopherol tổng δ-tocopherol γ-tocopherol α-tocopherol Maverick 0.05±0.01 0.13±0.01 0.01±0.00 0.19±0.02 pZY101 0.03±0.01 0.13±0.04 0.02±0.00 0.19±0.04 HYX-7-1G 0.03±0.00 0.09±0.02 0.01±0.01 0.14±0.02 Dữ liệu (µg/g trọng lượng tươi) giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn lần lặp lại (pZY101, HYX-7-1) lần lặp lại WT (Maverick) Tocopherol tổng tổng giá trị δ-, γ-, and α-tocopherol Phân tích thành phần fatty acid Mặc dù tocopherol xem đóng vai trò quan trọng thành phần dinh dưỡng tính ổn định oxi hóa cho dầu đậu tương, nhiên mối tương quan thay đổi thành phần hàm lượng tocopherol thành phần fatty acid chưa hiểu rõ đậu tương Để tìm hiểu vấn đề này, thành phần fatty acid hạt đậu tương màu vàng HYX-7-1, WT pZY101 phân tích phương pháp sắc kí khí Kết cho thấy có thay đổi thành phần fatty acid hạt đậu tương màu vàng với thành phần oleic acid, linolenic acid palmitic giảm, linolenic tăng so với WT pZY101 (Bảng 3) Bảng 3: Hàm lượng fatty acid hạt đậu tương chuyển gen HYX-7-1, pZY101 wild type Maverick Fatty acid (%) Mẫu Linolenic acid (18:3) Palmitic acid (16:0) Stearic acid (18:0) Oleic acid (18:1) Linoleic acid (18:2) Maverick 13.10±0.96 3.00±0.17 19.60±0.96 55.83±1.19 8.53±0.42 pZY101 12.53±0.12 4.17±0.06 16.17±0.60 57.93±0.64 9.30±0.66 HYX-7-1G 10.70±0.98 3.70±0.26 13.50±2.48 51.10±3.44 21.00±6.52 Dữ liệu (%) giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn lần lặp lại (pZY101, HYX-7-1và WT (Maverick) Giá trị tổng thành phần fatty acid 100% Kết thí nghiệm cho thấy hạt đậu tương chuyển gen tăng hàm lượng carotenoid giảm tocopherol Hàm lượng carotenoid mà chủ yếu β-carotene thành phần tương đương hạt đậu tương chuyển gen chiếm 98% tổng carotenoid Bên cạnh đó, kết nghiên cứu nguồn gen phytoene synthase có ảnh hưởng đến hàm lượng carotenoid tích lũy: Phytoene synthase dùng “Golden rice 1” “Golden rice 2” trích từ thủy tiên ngô , nghiên cứu cho thấy với việc biểu gen phytoene synthase từ vi khuẩn (crtB) tăng hàm lương β-carotene hạt đậu tương Kết tương tự thành công cải dầu (canola) , gai (flax) với việc dùng gen crtB Tuy nhiên hạt T1 HYX-7-1 event có tỉ lệ nảy mầm thấp gần 50% (5 hạt nảy mầm tổng 12 hạt đem trồng) chậm (sau tuần) so với WT pZY101 Cây T HYX-7-1- nhỏ lùn, nhỏ nhăn so với đối chứng dòng khác Nhưng trồng tháng khác biệt kiểu hình quan sát dòng Nảy mầm chậm hạt chuyển gen gặp Arabidopsis chuyển gen tăng hàm lượng carotenoid Theo Manz nguyên nhân βcarotene tiền chất (precursor) abscisis acid (ABA), β-carotene tăng hàm lượng ABA tăng ức chế nảy mầm hạt Kiểu hình còi cọc tìm thấy thuốc cà chua chuyển gen dùng phytoene synthase Hiện tượng giải thích có cạnh tranh hợp chất GGDP (geranylgeranyl diphosphate) trình sinh tổng hợp gibberellic acid (GA) carotenoid Đây nguyên nhân dẫn đến hàm lượng tocopherol giảm hạt đầu tương màu vàng nguồn GGDP cho trinh sinh tổng hợp tocopherol GA, chlorophyll, phylloquinone bị giới hạn chuyển vào trình sinh tổng hợp carotenoid Với việc biểu gen homogentisate phytyltransferase (AtVTE2) Arabidopsis, Collakova DellaPenna làm tăng hàm lượng tocopherol tổng lên 40% so với đối chứng không chuyển gen ( Collakova and DellaPenna , 2003) Do giả thuyết với việc đồng biểu gen AtVTE2, AtVTE3, AtVTE4 trình tổng hợp tocopherol với gen thứ crtB mã hóa cho enzyme trình tổng hợp carotenoid thúc đẩy tăng tổng hàm lượng tocopherol carotenoid đặc biệt tích lũy αtocopherol β-carotene Hơn nữa, trình tự gen thay đổi với việc gen mã hóa cho enzyme trình tổng hợp tocopherol (AtVTE2, AtVTE3, and AtVTE4) thay đổi đảo ngược lên trước crtB VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Qua kết nghiên cứu, tạo dòng đậu tương chuyển gen có hạt màu vàng Phân tích HPLC dòng đậu tương chuyển gen cho thấy hàm lượng carotenoid tổng số 128µg/g, cao 25 lần so với hạt đậu tương không chuyển gen (2,8µg/g) Hàm lượng carotenoid mà chủ yếu β-carotene thành phần tương đương hạt đậu tương chuyển gen chiếm 98% tổng carotenoid Tuy nhiên, hạt đậu tương chuyển gen lại giảm hàm lượng vitamin E có biến đổi thành phần fatty acid Hạt đậu tương từ chuyển gen HYX7-1 tiếp tục trì nhân lên theo dõi đặc tính hệ tiếp theo, dùng làm vật liệu ban đầu cho nghiên cứu sau Cấu trúc 2A cải tiến cách thêm gen AtVTE2, vị trí gen AtVTE2, AtVTE3, AtVTE4 thiết kế gần promoter, thay vào crtB gần terminator (cấu trúc 2A cải tiến AtVTE2-2A-AtVTE2-2A-AtVTE3-2A-AtVTE4-2A- crtB) Sự thay đổi hi vọng góp phần kiểm tra việc sử dụng trình tự 2A cho biểu đồng thời gen có thật xảy TÀI LIỆU THAM KHẢO Al-Babili S and P Beyer 2005 Golden Rice – five years on the road – five years to go? Trends in Plant Science 10: 565-573 Barampuram S and Z.J Zhang 2011 Recent advances in plant transformation Methods In Molecular Biology (Clifton, N.J.) 701: 1-35 Beuselinck P.R., D.A Sleper and K.D Bilyeu 2006 An Assessment of Phenotype Selection for Linolenic Acid Using Genetic Markers Crop Science 46: 747-750 Collakova E and D DellaPenna 2003 Homogentisate phytyltransferase activity is limiting for tocopherol biosynthesis in Arabidopsis Plant Physiology 131: 632-642 Fray R.G., P Hedden, P.M Bramley, D Grierson, A Wallace, P.D Fraser, et al 1995 Constitutive expression of a fruit phytoene synthase gene in transgenic tomatoes causes dwarfism by redirecting metabolites from the gibberellin pathway Plant Journal 8: 693-701 Ha S.H., Y.S Liang, H Jung, M.J Ahn, S.C Suh, S.J Kweon, et al 2010 Application of two bicistronic systems involving 2A and IRES sequences to the biosynthesis of carotenoids in rice endosperm Plant Biotechnology Journal 8: 928-938 Kean E.G., M.G Ferruzzi and B.R Hamaker 2008 Carotenoid Bioaccessibility from Whole Grain and Degermed Maize Meal Products [electronic resource] Journal of Agricultural and Food Chemistry 56: 99189926 Lindgren, L.O., K.G Stålberg and A.-S Höglund 2003 Seed-specific overexpression of an endogenous Arabidopsis phytoene synthase gene results in delayed germination and increased levels of carotenoids, chlorophyll, and abscisic acid Plant Physiology 132: 779-785 9 Manz B., K Müller, B Kucera, F Volke and G Leubner-Metzger 2005 Water Uptake and Distribution in Germinating Tobacco Seeds Investigated in Vivo by Nuclear Magnetic Resonance Imaging Plant Physiology 138: 1538-1551 10.Paine J.A., C.A Shipton, S Chaggar, R.M Howells, M.J Kennedy, G Vernon, et al 2005 Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content Nature Biotechnology 23: 482-487 Savidge B., J.D Weiss, Y.-H.H Wong, M.W Lassner, T.A Mitsky, C.K Shewmaker, et al 2002 Isolation and characterization of homogentisate phytyltransferase genes from Synechocystis sp PCC 6803 and Arabidopsis Plant Physiology 129: 321-332 11.Shewmaker C.K., J.A Sheehy, M Daley, S Colburn and D.Y Ke 1999 Seed-specific overexpression of phytoene synthase: increase in carotenoids and other metabolic effects Plant Journal 20: 401-412 12.Tavva V.S., Y.-H Kim, I.A Kagan, R.D Dinkins, K.-H Kim and G.B Collins 2007 Increased alphatocopherol content in soybean seed overexpressing the Perilla frutescens gamma-tocopherol methyltransferase gene Plant Cell Reports 26: 61-70 13.Van Eenennaam A.L., K Lincoln, T.P Durrett, H.E Valentin, C.K Shewmaker, G.M Thorne, et al 2003 Engineering vitamin E content: from Arabidopsis mutant to soy oil The Plant Cell 15: 3007-3019 14.Winklhofer-Roob B.M., E Rock, J Ribalta, D.H Shmerling and J.M Roob 2003 Effects of vitamin E and carotenoid status on oxidative stress in health and disease Evidence obtained from human intervention studies Molecular Aspects of Medicine 24: 391 15.Yang W., R.E Cahoon, S.C Hunter, C Zhang, J Han, T Borgschulte, et al 2011 Vitamin E biosynthesis: functional characterization of the monocot homogentisate geranylgeranyl transferase Plant Journal 65: 206217 16.Ye X., S Al-Babili, A Kloti, J Zhang, P Lucca, P Beyer, et al 2000 Engineering the Provitamin A (BetaCarotene) Biosynthetic Pathway into (Carotenoid-Free) Rice E Science 287: 303 17.Zeng P., J.C Polacco, Z Zhang and D.A Vadnais 2004 Refined glufosinate selection in Agrobacteriummediated transformation of soybean (Glycine max (L.) Merrill) Plant Cell Reports 22: 478-482 18.Zhang Z., T.E Clemente, P Staswick and A Xing 1999 The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean Plant Cell, Tissue and Organ Culture 56: 37-46 CO-ORDINATED EXPRESSION OF CRTB, At-VTE3 AND VTE4 IN SOYBEAN Phạm Thu Dung1, Trần Vũ Hải1, Phạm Ngọc Tú1, Tran Nhu Ngoc1, Zhanyuan Zhang2 Summary Although soybean is an excellent general nutritional source with the high amount of protein and oil, it is not very rich in particular vitamins The main goal of this study is to enhance both pro-vitamin A (carotenoids) and vitamin E (tocopherol) content in soybean seeds We have genetically engineered the carotenoid and the tocopherol biosynthetic pathways in soybean seeds by ectopically expressing three genes: Erwinia uredovora phytoene synthase (crtB), Arabidopsis 2-methyl-6-phytylbenzoquinol methyl transferase (At-VTE3) and soybean γ-tocopherol methyl transpherase (VTE4) FMDV 2A sequence joined two adjacent proteins to create 2A-polyprotein This construct was introduced to soybean via Agrobacterium-mediated cotyledonary node transformation method One inheritable transgenic event displayed “golden”- colored seeds HPLC analysis of individual golden soybean seeds revealed that the seeds accumulated as high as 128µg/g of total carotenoids, approximately 25- fold higher than wild type Of complete carotenoids, 98% were pro-vitamin A By contrast, golden seeds showed a decrease of tocopherol and a change of fatty acid profile Besides that, the transgenic golden soybean lines also displayed a delay in germination with a decreased rate (50%) and dwarf phenotype at early developmental stage, but showed normal development later Keyword: soybean, pro-vitamin A (carotenoids), vitamin E (tocopherols), FMDV 2A (Foot and Mouth Disease Virus)