Đang tải... (xem toàn văn)
29. Nguyên tắc cơ bản của việc phân tích đối ngẫu, sắc ký lỏng cao áp. 1. Phân tích đối ngẫu (Heteroduplex Analysis) 2 sản phẩm khuyếch đại PCR được trộn với nhau với một lượng tương đương, biến tính ở 95°C và sau đó làm lạnh Trong suốt quá trình làm lạnh, những chuỗi đơn được gắn lại để hình thành những DNA đối ngẫu ........ 30. Các kiểu biến động DNA mà có thể thăm dò được bằng chỉ thị sequencing, EST và SNP. DNA sequencing cho phép thăm dò các biến động ở mức độ nucleotide ESTs là công cụ có hiệu lực để thăm dò sự đa hình trong những vùng coding; Phương pháp này có hiệu quả cực kỳ cao trong việc tìm ra gene mới. Chúng có thể được dùng để xác định phiên bản gene, là công cụ để khám phá gene và xác định trình tự gene ...... 2. Biến động di truyền là gì? Biến động di truyền được xác định như thế nào? Biến động di truyền là những sự biến đổi ngẫu nhiên vô hướng về tần số allele và các kiểu gen trong tất cả các quần thể, nhưng đặc biệt là ở các quần thể nhỏ và không cần có sự chọn lọc tự nhiên. Biến động di truyền xảy ra thuần túy ngẫu nhiên, mang tính xác suất và tỷ lệ nghịch với kích thước quần thể. Trong một quần thể lớn, thông thường biến động di truyền chỉ gây ra một sự thay đổi ngẫu nhiên nhỏ. Nhưng trong các quần thể nhỏ, nó có thể gây ra những sự biến động lớn về tần số allele qua các thế hệ khác nhau. Chính hiện tượng này là nguyên nhân tạo nên sự khác biệt đa dạng về mặt di truyền ở các quần thể nhỏ và dần dần dẫn tới sự cách ly sinh sản trong quá trình tiến hóa của loài. Và sự biến động di truyền có thể là nguyên nhân làm cho mức dị hợp tử thấp quan sát được ở một số loài có nguy cơ bị diệt vong Biến động di truyền được xác định như thế nào? Để xác định được biến động di truyền trong quần thể, các thí nghiệm cần bố trí hợp lý về vị trí và số lượng cá thể thu thập. Phương pháp nghiên cứu có thể áp dụng là thăm dò mức độ biến động, đa hình mức độ DNA như các kỹ thuật RAPDs (đánh giá tính đa hình của các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên), RFLPs (đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzyme hạn chế), AFLP (RFLP + PCR nhằm tăng độ nhạy truy tìm dấu vết biến đổi DNA), Microsatellite (kỹ thuật giúp phát hiện các đột biến, biến đổi bên trong các đoạn DNA siêu vệ tinh). Hoặc áp dụng kỹ thuật isozymes giúp phát hiện biến đổi trong các locus mã hóa cho 1 loại enzyme bất kỳ, tính toán thống kê, khoảng cách di truyền, để thiết lập bản đồ di truyền, đánh giá biến động di truyền trong quần thể. 3. Các kiểu chỉ thị di truyền? Ưu điểm và nhược điểm chính của các kiểu chỉ thị này? 3.1. Những đặc điểm hình thái Về mặt truyền thống, sự đa dạng bên trong hoặc giữa các quần thể được xác định bằng sự đánh giá sự khác biệt về mặt hình thái. Sự đánh giá này có ưu điểm là có sẵn, không đòi hỏi những dụng cụ phức tạp và là phương pháp xác định trực tiếp dựa vào kiểu hình. Tuy nhiên việc xác định hình thái cần phải có các chuyên gia về loài, chúng lại ảnh hưởng bởi những thay đổi của các điều kiện môi trường, và có thể biến động qua các giai đoạn khác nhau và số lượng của chúng cũng bị giơíi hạn. 3.2. Chỉ thị sinh hoá (protein) Để khắc phục những giới hạn của phương pháp phân tích hình thái, một số chỉ thị khác vừa mới được phát triển dựa vào cả 2 mức độ, mức đọ protein (kiểu hình) và mức độ DNA (kiểu gene). Chỉ thị protein thường được gọi là ‘chỉ thị” sinh hoá, và chúng thường được xếp sai vào nhóm của các “chỉ thị phân tử”. Chỉ thị protein (những protein dự trữ trong hạt và isozymes) được tạo ra thông qua quá trình điện di, nhờ vào đặc tính di chuyển của protein và enzymes và được biểu lộ bằng thuốc nhuộm đặc biệt đối với protein được phân tích. Việc thăm dò sự đa hình, những khác biệt có thể thăm dò được ở chỉ thị đưa ra xảy ra bên trong các cá thể, trong những chỉ thị prtein là một kỹ thuật mà chia sẽ một vài ưu điểm của việc sử dụng chỉ thị hình thái. Tuy nhiên, chỉ thị protein là cũng bị giới hạn do bị ảnh hưởng bởi những điều kiện môi trường và những thay đổi trong những giai đoạn phát triển khác nhau. Mặc dù vậy isozyme là một phương pháp hổ trợ thô cho sự phận tích những biến động hình thái đơn giản. 3.3. Chỉ thị phân tử Sự đa hình có thể được thăm dò bên trong DNA của nhân hoặc của các bào quan, mà được tìm thấy có ở trong ti thể và lạp thể. Chỉ thị phân tử nói đến chính phân tử DNA và vì vậy mà được coi như là một phương pháp đo lường các biến dị một cách khách quan. Chúng không phụ thuộc vào những ảnh hưởng của môi trường, việc đánh giá có thể được thực hiện ở bất kỳ thời điểm nào trong quá trình phát triển của thực vật và hơn tất cả đó là chũng có tiềm năng cho một sự tồn tại không giới hạn về mặt số lượng, bao phủ toàn bộ bộ gen. Ưu điểm – Không phụ thuộc vào những ảnh hưởng của môi trường – Khả năng không bị giới hạn về số lượng – Đánh giá khách quan các biến dị Nhược điểm chính là cần những phương tiện kỹ thuật tương đối phức tạp
Trường THPT chuyên Nguyễn Huệ Bộ môn Sinh học Bộ câu hỏi ôn thi học sinh giỏi thành phố môn Sinh học (Lưu hành nội bộ) CHỈ THỊ PHÂN TỬ Đa dạng di truyền gì? Đa dạng di truyền ý nói đến biến động gene bên loài, biến dị thừa kế bên quần thể cá thể Kết tất biến dị lại bên chuỗi base pairs mà bao gồm phân tử DNA tạo thành code di truyền Những kiểu đa dạng di truyền khác xác định tất mức độ thể nhân, bao gồm lượng DNA tế bào, số lượng chromosome cấu trúc DNA Các hệ biến dị di truyền xảy liên tục cá thể thông qua đột biến nhiễm sắc thể đột biến gene, mà cá thể sinh sản hữu tính nhân giống thông qua tái tổ hợp Biến dị di truyền bị ảnh hưởng chọn lọc Kết tượng thay đổi gene allele mà liên quan đến tiến hoá quần thể Những trạng thái tương tự xảy thông qua chọn lọc nhân tạo việc nuôi dưỡng rèn luyện Biến động di truyền gì? Biến động di truyền xác định nào? Biến động di truyền biến đổi ngẫu nhiên vô hướng tần số allele kiểu gen tất quần thể, đặc biệt quần thể nhỏ không cần có chọn lọc tự nhiên Biến động di truyền xảy túy ngẫu nhiên, mang tính xác suất tỷ lệ nghịch với kích thước quần thể Trong quần thể lớn, thông thường biến động di truyền gây thay đổi ngẫu nhiên nhỏ Nhưng quần thể nhỏ, gây biến động lớn tần số allele qua hệ khác Chính tượng nguyên nhân tạo nên khác biệt đa dạng mặt di truyền quần thể nhỏ dẫn tới cách ly sinh sản trình tiến hóa loài Và biến động di truyền nguyên nhân làm cho mức dị hợp tử thấp quan sát số loài có nguy bị diệt vong Biến động di truyền xác định nào? Để xác định biến động di truyền quần thể, thí nghiệm cần bố trí hợp lý vị trí số lượng cá thể thu thập Phương pháp nghiên cứu áp dụng thăm dò mức độ biến động, đa hình mức độ DNA kỹ thuật RAPDs (đánh giá tính đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên), RFLPs (đa hình chiều dài phân đoạn DNA dựa điểm cắt enzyme hạn chế), AFLP (RFLP + PCR nhằm tăng độ nhạy truy tìm dấu vết biến đổi DNA), Microsatellite (kỹ thuật giúp phát đột biến, biến đổi bên đoạn DNA siêu vệ tinh) Hoặc áp dụng kỹ thuật isozymes giúp phát biến đổi locus mã hóa cho loại enzyme bất kỳ, tính toán thống kê, khoảng cách di truyền, để thiết lập đồ di truyền, đánh giá biến động di truyền quần thể Các kiểu thị di truyền? Ưu điểm nhược điểm kiểu thị này? 3.1 Những đặc điểm hình thái Về mặt truyền thống, đa dạng bên quần thể xác định đánh giá khác biệt mặt hình thái Sự đánh giá có ưu điểm có sẵn, không đòi hỏi dụng cụ phức tạp phương pháp xác định trực tiếp dựa vào kiểu hình Tuy nhiên việc xác định hình thái cần phải có chuyên gia loài, chúng lại ảnh hưởng thay đổi điều kiện môi trường, biến động qua giai đoạn khác số lượng chúng bị giơíi hạn 3.2 Chỉ thị sinh hoá (protein) Để khắc phục giới hạn phương pháp phân tích hình thái, số thị khác vừa phát triển dựa vào mức độ, mức đọ protein (kiểu hình) mức độ DNA (kiểu gene) Chỉ thị protein thường gọi ‘chỉ thị” sinh hoá, chúng thường xếp sai vào nhóm “chỉ thị phân tử” Chỉ thị protein (những protein dự trữ hạt isozymes) tạo thông qua trình điện di, nhờ vào đặc tính di chuyển protein enzymes biểu lộ thuốc nhuộm đặc biệt protein phân tích Việc thăm dò đa hình, khác biệt thăm dò thị đưa xảy bên cá thể, thị prtein kỹ thuật mà chia vài ưu điểm việc sử dụng thị hình thái Tuy nhiên, thị protein bị giới hạn bị ảnh hưởng điều kiện môi trường thay đổi giai đoạn phát triển khác Mặc dù isozyme phương pháp hổ trợ thô cho phận tích biến động hình thái đơn giản 3.3 Chỉ thị phân tử Sự đa hình thăm dò bên DNA nhân bào quan, mà tìm thấy có ti thể lạp thể Chỉ thị phân tử nói đến phân tử DNA mà coi phương pháp đo lường biến dị cách khách quan Chúng không phụ thuộc vào ảnh hưởng môi trường, việc đánh giá thực thời điểm trình phát triển thực vật tất chũng có tiềm cho tồn không giới hạn mặt số lượng, bao phủ toàn bộ gen Ưu điểm –Không phụ thuộc vào ảnh hưởng môi trường –Khả không bị giới hạn số lượng –Đánh giá khách quan biến dị Nhược điểm cần phương tiện kỹ thuật tương đối phức tạp Tiêu chuẩn thị phân tử gì? - Đa hình cao: biến động bên cá thể Mức độ đa hình thăm dò phụ thuộc vào kỹ thuật dùng để đánh giá - Có thể lặp lại được: Có thể tạo thị phòng thí nghiệm nào, có nghĩa dùng để đánh giá nhiều phòng thí nghiệm khác - Đồng ưu (đồng trội): Phụ thuộc vào kiểu áp dụng, kỹ thuật chọn lọc phải thăm dò dạng khác marker, phân biệt đồng hợp tử, dị hợp tử (đồng kế thừa) Một cá thể dị hợp cho thấy đồng thời kiểu gene kết hợp hai bố mẹ đồng hợp tử - Được phân bố cách đặn qua toàn bộ gene Sự bao phủ toàn gene dày đặc rãi rác việc đánh giá đa hình tốt - Sự biểu lộ rõ, nghĩa thăm dò khác biệt cá thể có quan hệ họ hàng gần gũi - Không phụ thuộc vào ảnh hưởng môi trường Tính xác kiểu gene marker nên không phụ thuộc vào môi trường mà thể sống hay giai đoạn phát triển - Tính trung tính Allele diện vị trí marker không phụ thuộc hay ảnh hưởng áp lực chọn lọc tác động lên cá thể Đây giả thiết chưa có liệu có sẵn để xác minh hoạc phản kháng đặc tính - Không đắt Dễ, nhanh rẽ việc thăm dò qua nhiều cá thể Nếu có thể, phương tiên nên có khả sử dụng đa mục đích thí nghiệm Protein ? Enzyme? Protein: - Protein hợp chất hữu có ý nghĩa quan trọng bậc thể sống Về mặt số lượng, chiếm không 50% trọng lượng khô tế bào Về thành phần cấu trúc, protein tạo thành chủ yếu từ amino acid qua liên kết peptide Cho đến người ta thu nhiều loại protein dạng cao kết tinh xác định thành phần nguyên tố hoá học, thông thường cấu trúc chúng gồm bốn nguyên tố C H O N với tỷ lệ C ≈ 50%, H ≈ 7%, O ≈ 23% N ≈ 16% - Protein tham gia hoạt động sống thể sinh vật, từ việc tham gia xây dưng tế bào, mô, đến tham gia hoạt động xúc tác nhiều chức khác - Cùng với acid nucleic, protein sở vật chất sống Enzyme: Enzyme protein có khả xúc tác đặc hiệu cho phản ứng hoá học, chất xúc tác sinh học có ý nghĩa đặc biệt quan trọng Cấu trúc protein liên quan đến chức chúng? *Thành phần cấu trúc P: Protein đại phân tử sinh học tế bào, chứa nguyên tố C, H, O, N, S, P… - Đơn vị tạo nên Cấu trúc P acid amin - Các a.a có c.thức TQ (H2N-CH-COOH) - Có khoảng 20 loại a.a, chúng liên kết với = lk peptide - Lk peptide kết hợp nhóm amine a.a với nhóm cacboxyl a.a (H2N-CH(R)-COOH) Peptide phức hợp gồm ->c30a.a dài gọi olypeptide - Bản chất gốc R khác tạo nên nhóm P, a.a khác Căn vào ta chia a.a thành nhóm +Nhóm kiềm, nhóm acid, nhóm trung tính kị nước ko mang điện tíc, nhóm trung tính ưa nước mang tính phân cực - Nhóm NH2 COOH: Là nhóm q.trọng chúng phân li nước làm cho acid amin trở thành ion trái dấu NH3+ COO- - Tất chuỗi polypeptide có amino acid đầu tận cùng, đính vào nhóm amin, đầu đính nhóm COOH tự đc tổng hợp từ trái sang phải, acid amin chứa đầu amin (N )và kết thúc acid amin chứa đầu cacboxyl (C) - Các P khác có trình tự thành phần amino acid khác nhau, trình tự thành phần acid amin định tính chất chất lượng Protein - Trong thể, protein đảm nhận nhiều chức quan trọng cấu trúc, vận chuyển, dự trữ, xúc tác, điều hòa trao đổi chất, miễn dịch… * Tính chất P phụ thuộc vào: trình tự, số acid amin số chuỗi polypeptide phản ánh mức độ phức tạp chức P Cấu trúc không gian mức độ cuộn xoắn chuỗi polypeptide * Cấu trúc P - Cấu trúc b1 Là trình tự xếp a.a chuỗi polypeptidetừ 20 loại acid amin khác Các a.a có nhóm gốc giống amin(-NH2), cacboxyl (COOH) hydro(-H) gốc R khác quy định Tính chất khác biệt a.a ->Cấu trúc b1 quy định tính đặc thù cấu hình không gian pt P Nếu chuỗi polypeptide bị mất, thêm or thay đổi trình tự dù a.a dẫn đến thay đổi tính đặc thù tính chất phân tử protein - Cấu trúc b2: Là uốn phần chuỗi polypeptide thành Cấu trúc đặn không gian theo kiểu dạng xoắn α hay phiến gấp nếp β Lk H đóng vai trò tạo nên Cấu trúc b2 -> Ảnh hg đến hoạt tính chức P Là dạng trung gian chuyển tiếp để pt P hình thành nên Cấu trúc b3 phức tạp -Cấu trúc b3: Đc hình thành chuỗi polypeptide cuộn xoắn hay gấp khúc tạo nên pt có cấu hình không gian chiều, cấu hình không gian P Cấu trúc không gian đc tạo nên lk yếu lk ion, lk kỵ nc lk disulphite a.a chứa S -> Cấu hình không gian quy định hoạt tính chức P -Cấu trúc b4: đc hình thành or nhiều chuỗi polypeptide thành phần tg tác với tạo nên ->Ảnh hưởng đến chức P Nêu yếu tố ảnh hưởng đến PCR? Nó ảnh hưởng nào? Trình tự primer: Trình tự primer có khoảng 50% GC để tăng khả gắn mồi Tránh GC đầu 3’ primer làm tăng hội tạo tượng primer-dimers Tránh chọn vùng có trình tự tương đồng để hạn chế primer gắn với Nhiệt độ trình ủ: Nhiệt độ ủ thích hợp nhiệt độ mà 1/2 primer gắn với DNA khuôn mẫu Số base primer nhiệt độ ủ thấp ngược lại T¬a = 4(G+C) + 2(A+T) - 5oC Nồng độ Mg2+ Nồng độ Mg2+ ảnh hưởng đến nhiệt độ biến tính DNA khuôn mẫu, trình ủ primer, tính đặc hiệu sản phẩm PCR, hoạt tính Taq pol độ xác kết Các dNTPs Dung dịch stock dNTP phải có pH 7, hàm lượng xác dNTP khoảng 20-200μM cho kết ổn định, xác đặc hiệu Bốn loại dNTP sử dụng cần có nồng độ tương đương để giảm thiểu tối đa tượng sai biệt kết hợp sai mã di truyền Enzyme Taq pol Nếu nồng độ E cao xuất sản phẩm PCR không đặc hiệu làm sai kết Nếu nồng độ thấp không đủ lượng E để xúc tác tạo sản phẩm mong muốn Đệm ổn định hoạt động Taq pol Nồng độ primer Sử dụng nồng độ primer cao không cần thiết thường tạo bất lợi thừa primer có tượng primer-dimers tượng gắn primer nhầm vị trí khuôn mẫu Nồng độ DNA khuôn mẫu Nếu chất thành phần phản ứng có nồng độ cao DNA khuôn có nồng độ thấp giai đoạn sàng lọc PCR sẻ trở nên khó khăn tần suất DNA primer gặp giảm rõ rệt Tỷ lệ primer DNA khuôn Nếu tỉ lệ cao gây tượng primer-dimers, tỷ lệ thấp sản phẩm k nhiều Khởi động nóng PCR Làm tăng khả bắt cặp primer DNA khuôn, giúp thu đc sp Cơ sở phản ứng chuỗi polymerase (PCR)? PCR (polymerase chain reaction) kỹ thuật sử dụng phổ biến công nghệ sinh học đại đóng góp lớn cho tiến sinh học phân tử, đánh dấu bước tiến vô quan trọng tương đương với việc khám phá enzyme hạn chế kỹ thuật Southern blot PCR dựa sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro nucleic acid đặc trưng PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần đoạn DNA có chiều dài từ 200-3000 bp Đoạn DNA khuếch đại (DNA đích) nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide Các kiểu DNA? - Tổ chức trình tự DNA: DNA sinh vật nhân thật chia thành kiểu khác nhóm khác nhau: –Gene code protein phiên đơn –Sự diện DNA đa phiên +Những trình tự với chức biết: –Coding –Non-coding +Những trình tự với chức không biết: –Lặp lại (tản mạn hay theo thứ tự) –Transposons (gene nhảy) –DNA spacer (vùng đệm) Nhiều đoạn lặp lại tìm thấy DNA spacer Chúng bao gồm trình tự tìm thấy nhiều vị trí, đặc biệt centromere telomere Những lặp lại thay đổi kích cỡ, số lượng phân bố toàn gene, làm cho chúng dùng làm thị phân tử - Các loại DNA: Xét cấu trúc: B-DNA Cuộn xoắn tạo thành NST Xoắn phải đối song song, 10 cặp base vòng xoắn; mã hóa cho protein tế bào; tiến hành chép, phiên mã dịch mã, chép bước cần thiết cho trình phân bào A-DNA Cũng chuỗi xoắn phải có nhiều cặp base vòng xoắn B-DNA (11) Ít tìm thấy, tổng hợp phòng thí nghiệm Z-DNA Xoắn trái, hình dạng zíc-zắc Có 12 cặp base vòng xoắn nên mang nhiều gen Đóng vai trò trình phiên mã RNA, tạo mRNA từ chuỗi DNA cDNA cDNA (complementary or clonal DNA) dạng DNA dùng tạo nên thư viện thông tin di truyền Là sợ DNA bổ sung với mạch DNA gốc, ứng dụng thí nghiệm kiểm tra tính đặc hiệu thuốc… Xét vị trí: DNA nhân: Là DNA cuộn xoắn tạo nên sợi NST, mang thông tin di truyền tế bào, chứa đoạn mã hóa không mã hóa Trải qua trình phiên mã dịch mã tạo thành protein tế bào DNA bào quan (Cytoplasmatic DNA) –Chloroplast DNA (cpDNA) –Mitochondrial DNA (mtDNA) Một lượng nhỏ DNA tìm thấy cytoplasm bên nhân- lạp thể (chloroplast DNA ký hiệu cpDNA) ti thể (mitochondrial DNA kí hiệu mtDNA) Lạp thể ti thể có sợi sắc thể riêng với vài phiên Những gene qui định cho dịch mã mã riêng cấu thành bào quan, đóng vai trò chuyên biệt cao biểu kiểu hình thể Điểm đặc trưng cytoplasmatic DNA: –Tính kế thừa DNA bào quan thường (nhưng không luôn) di truyền thông qua mẹ, mẫu hình thừa kế qua mẹ –Sự khác biệt tốc độ tiến hoá (trật tự gene thông qua trình tự nucleotide) –Tích luỹ chậm đột biến Nguyên nhân tích luỹ đột biến chậm chưa giải thích rõ ràng, có lẽ kết qủa diện việc sửa chữa có hiệu cao thiệt hại DNA hay hệ thống tái tạo DNA lỗi tự Những nét DNA tế bào chất (cytoplasmic DNA)? Tế bào chất không môi trường hoạt động hệ gen nhân mà có bào quan chứa gen gọi gen nhân hay gen nhiễm sắc thể Gen nhiễm sắc thể có lạp thể, ti thể, plasmit vi khuẩn bào quan có khả tự nhân đôi Bản chất gen nhân DNA Lượng DNA tế bào chất nhiều so với lượng DNA nhân, hàm lượng không ổn định, phụ thuộc vào trạng thái hoạt động sinh lý tế bào.DNA NST có cấu trúc xoắn kép, trần, dạng vòng Ví dụ, DNA lạp thể tế bào thực vật có dạng vòng giống DNA số vi khuẩn virut DNA plasmit vi khuẩn phân tử nhỏ dạng vòng, chứa gen kháng thuốc, bền vững với ion kim loại có vai trò quan trọng kĩ thuật di truyền Bộ mã di truyền có nhiều điểm khác với mã di truyền nhân, gen NST có khả tự nhân đôi, nhân đôi không thật xác gen nhân Các đặc điểm di truyền tế bào chất - Lai thuận lai nghịch kết biểu kiểu hình đời thay đổi - Di truyền qua tế bào chất vai trò chủ yếu thuộc tế bào chất tế bào sinh dục - Các tính trạng di truyền qua tế bào chất truyền theo dòng mẹ (nhưng không thiết đặc điểm di truyền theo mẹ liên quan tới gen tế bào chất nguyên nhân khác) - Các tính trạng di truyền qua tế bào chất không tuân theo định luật thuyết di truyền qua nhiễm sắc thể phân bào tế bào chất không chia cho tế bào cách xác nhiễm sắc thể - Tóm lại, di truyền, nhân có vai trò tế bào chất có vai trò định Trong tế bào có hệ thống di truyền: di truyền qua nhiễm sắc thể di truyền nhiễm sắc thể tác động qua lại lẫn đảm bảo cho tồn sinh trưởng, phát triển thể 10 Enzyme cắt hạn chế gì? Trong tự nhiên, enzyme hạn chế diện hầu hết tế bào vi khuẩn để ngăn cản DNA ngoại lai tiếp quản máy tổng hợp protein tế bào DNA chúng bảo vệ khỏi tác dụng enzyme hạn chế có mặt enzyme nội bào methyl hóa (methylation) nucleotide đặc biệt, nucleotide không nhận biết enzyme hạn chế Enzyme hạn chế có khả nhận biết đoạn DNA có trình tự nucleotide xác định, bám vào đoạn DNA cắt hai sợi DNA vào nucleotide đối xứng điểm cắt Các enzyme hạn chế có ba loại (type): I, II III Các enzyme dùng phổ biến thuộc type II, có chế tác động đơn giản Đây nuclease cắt vị trí đặc hiệu nằm bên sợi DNA (chứ không phân hủy DNA từ hai đầu), nên gọi endonuclease Tên gọi đầy đủ chúng restriction endonuclease type II, hay gọi đơn giản enzyme hạn chế (restriction enzyme, RE).Mỗi enzyme cắt hạn chế cắt phân tử DNA thành đoạn xác định cách hoạt động trình tự đặc trưng Các enzyme hạn chế cắt phân tử DNA sợi đôi theo hai cách khác nhau: +Cắt đường thẳng đối xứng để tạo phân tử đầu Primer (10 base) bán sẵn nhiều công ty MgCl2 (thêm) để gia tăng số lượng bands khuyếch đại phản ứng Tuy nhiên cần phải tính toán để tìm nồng độ thích hợp, tránh việc khuyếch đại đoạn gene không đặc hiệu Chu kỳ gắn kết primer thực nhiệt độ thấp (32 - 40°C) Bước 3: Điện di phát hiện: Kết PCR – RAPD điện di gel agarose Bước 4: Dùng kết điện di mã hoá chạy chương trình NTSYS để phân tích đa dạng di truyền chủng giống Kết : Có bảng hệ số đồng dạng di truyền sơ đồ thông từ biết mức độ gần gũi loài Những nét Dùng primer ngẫu nhiên ngắn (10 bases) Khuyếch đại đoạn DNA chưa biết Các bước phòng thí nghiệm Phân lập DNA Phản ứng PCR với primer Tách phân đoạn DNA điện di gel Quan sát phân đoạn nhuộm ethidium bromide 17 Nguyên nhân đa hình phân tử DNA mà thăm dò kỹ thuật RADP? Sự đa hình DNA cá thể do: Lỗi trình ghép đôi điểm gắn mồi Sự xuất điểm primer Độ dài đoạn khuyếch đại điểm primer 18 Tiêu chuẩn để chọn lựa band RADP để phân tích đa dạng di truyền? Do chất thị RAPD, có diện hay vắng mặt bands riêng biệt đánh giá Tiêu chuẩn để chọn lựa bands: Khả lặp lại (reproducibility): cần để lặp lại thí nghiệm Độ dày Kích cỡ Sự chia cách quan sát quần thể lập đồ 19 Thuận tiện bất tiện kỹ thuật RADP? Ưu điểm RADP Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực dễ thành công không cần biết trước trình tự gene đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh cao Thời gian thực nhanh Khả nhân cao Về mặt kinh tế: Chi phí thực thấp kỹ thuật RAPD thường sử dụng kết hợp với kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền nhận diện thị phân tử có độ tin cậy cao Nhược điểm RADP markers trội Sự khuyếch đại xảy locus hay không Có nghĩa cá thể đồng hợp dị hợp phân biệt Thiếu thông tin sản phẩm khuyếch đại Khó để lặp lại (kết phụ thuôc vào chất lượng DNA, thành phần & điều kiện phản ứng PCR) Vấn đề việc đồng di chuyển (2 phân đoạn khác có độ dài, trọng lượng phân tử) Sự hình thành band kỹ thuật RAPD phụ thuộc vào: Số lương chất lượng DNA hệ gen tách chiết Các band khác enzyme DNA pol Các máy PCR khác 20 Những bước thăm dò biến động thị RFLP? Kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài phân đoạn DNA dựa điểm cắt enzim giới hạn Khi ủ DNA với enzim giới hạn dung dịch đệm thích hợp ( pH, nhiệt độ ) tạo phân đoạn DNA với kích thước khác Nguyên tắc chung: - Dựa độ đặc hiệu enzim cắt giới hạn vị trí nhận biết chúng DNA gen Sự khác biệt vị trí cắt hai cá thể tạo phân đoạn cắt khác Enzim cắt giới hạn Các loại Loại I: enzym nhận biết trình tự di chuyển phân tử DNA cách 1000-5000 nu giải phóng độ vài chục nu Loại II: enzym nhận biết trình tự cắt vị trí Loại III: enzym nhận biết trình tự cắt DNA vị trí cách 20 nu Một số quy tắc thực phản ứng cắt RE - Nồng độ NaCl dung dịch đệm, phải sử dụng nhiều RE có nồng độ NaCl dung dịch đệm khác nên cắt với RE có nồng độ NaCl thấp trước đến RE cần NaCl nồng độ cao - RE bảo quản dung dịch đệm có 50% glycerol -200C, nên thêm vào phản ứng sau cùng, thời gian để bên ngắn tốt Quy trình thực RFLP Tách chiết tinh DNA: - Điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động enzim nội bào (DNAase, RNAase) - Quá trình thực gồm bước Phá màng tế bào Loại protein Tủa DNA B1: Phá màng tế bào Tế bào bị phá vỡ biện pháp học chất tẩy mạnh để giải phóng DNA môi trường phân ly protein liên kết với DNA B2: Loại Protein Để thu DNA tinh ta cần Tách chiết vài lần với tác nhân tách chiết hổn hợp dung dịch phenol- chloroform để loại bỏ chất tạp nhiễm protein B3 Tủa DNA Có kiểu tủa - Tủa ethanol: thực nồng độ muối cao, nồng độ ethanol cao Nhiệt độ thấp thúc đẩy tủa - Sự tủa DNA cho phép thu nhận acid nucleic tinh nằm thể tích dung dịch lớn, dạng cặn tủa - Bảo quản cần hòa lại nước nồng độ xác định RE cắt mẫu DNA cần phân tích Điện di gel agarose : - Tách đoạn DNA theo kích thước Chuyển DNA phân tách lên màng lai Lai DNA: DNA probe: Mẫu dò RFLP đoạn DNA đánh dấu lai với nhiều trình tự mẫu DNA phân giải sau chúng phân tách điện di gel chuyển lên màng lai Các DNA nhân (DNA hệ gen, cDNA), DNA tế bào chất tiêu biểu, sử dụng mẫu dò RFLP Các đánh dấu mẫu dò thường dùng : đồng vị phóng xạ 32P ,biotin, streptavidin, a bioluminescent Các loại đa hình phát RFLP: RFLPs: Các nguyên nhân tạo đa hình A = Kiểu gốc (ban đầu) B = có đoạn chèn C = đoạn D = xuất điểm cắt hạn chế nằm trình tự đoạn probe (mẫu lai) E = điểm cắt hạn chế F = xuất điểm cắt hạn chế nằm trình tự đoạn probe 21 Các nguồn đầu dò khác nhau? - DNA nhân: lấy từ thư viện gene (có thư viện đầu dò cho phân tích RFLP) hay cDNA (complementary DNA-thư viện DNA bổ sung) - DNA cytoplasmic: Sự đặc trưng loài nhiều đầu dò vị trí đơn đòi hỏi phải xây dựng thư viện nghiên cứu loài Tuy nhiên đầu dò từ chi gần gũi sử dụng - Trình tự có tính lặp lại hay kiểu minisatelite: nhóm 10 đến 60bp xếp theo thứ tự từ đầu đến cuối Các trình tự lặp lại biến động cao cá thể số lượng trình tự lặp lại Một đầu dò chọn lọc dùng để thăm dò phân đoạn hạn chế mà diện nhiều vị trí Mẫu hình phân đoạn hạn chế mang minisatelite film (được gọi DNA- fingerprint) cho phép phân biệt rõ khác biệt cá thể khác 22 Ảnh hưởng kiện đột biến khác đến thăm dò mẫu hình band RFLP? Một đột biến tạo điểm cắt bên vùng target điểm đầu dò nhận biết chuỗi A Kết đầu dò đồng thời lai phân đoạn tạo enzyme Trên chuỗi B đột biến xảy ra, có phân đoạn lai với đầu dò Trong trình điện di, phân đoạn từ A di chuyển xa so với phân đoạn từ B Đột biến tạo điểm cắt vùng flanking (bên) điểm cắt hạn chế tạo phân đoạn nhỏ Vì điểm cắt không vùng nhận biết đầu dò nên đoạn lai A đoạn lai B Một đột biến chèn đoạn vùng flanking điểm cắt, tạo phân đoạn cắt lớn hơn Một đột biến đoạn xảy vùng flanking điểm cắt hạn chế tạo đoạn cắt hạn chế nhỏ Một điểm vùng flanking bị thay đổi thông qua đột biến hay đoạn 23 Ưu điểm nhước điểm kỹ thuật RFLP? Những ưu điểm RFLP: + Phương pháp có khả trao đổi tốt phòng thí nghiệm + Sự đồng ưu di truyền lại đánh giá dị hợp tử + Không đòi hỏi thông tin trình tự + Bởi dựa vào đồng dạng trình tự nên dùng cho nghiên cứu phát sinh loài loài có liên quan + Phù hợp tốt cho việc xây dựng đồ di truyền + Có thể phân biệt – mức độ loài quần thể, cá thể + Đơn giản Nhược điểm: + Đòi hỏi lượng lớn DNA + Không thể tự động hoá + Mức độ đa hình thấp vài loài + Chỉ vài vị trí thăm dò thí nghiệm + Cần phải có thư viện probe phù hợp sẵn có nguồn đầu dò phong phú phòng thí nghiệm + Tốn nhiều thời gian, đặc biệt với đầu dò mang phiên đơn + Đắt + Khá phụ thuộc vào kỹ thuật 24 Các bước tiến hành kỹ thuật AFLP? Kỹ thuật bao gồm bốn bước chính: DNA phân giải hai enzyme cắt hạn chế khác nhau: Phân tử DNA phân giải với loại enzyme cắt hạn chế khác nhau: loại cắt thường xuyên (enzyme hạn chế base) loại cắt (enzyme hạn chế base) Có nhiều loại enzyme/primer kết nối dùng, nhiên, Msel EcoRI dùng nhiều hệ gene nhiều AT chúng cho phân đoạn hệ gene giàu GC Ở bước cho sản phẩm tạo đoạn chứa vị trí cắt hạn chế đầu là: MseI-MseI; MseI-EcoRI; EcoRI-EcoRI Nối adapter (là oligonucleotide) vào đầu tận đoạn DNA cắt hạn chế Adapter phải chứa trình tự nucleotide bổ sung với đầu lồi hạn chế đoạn cắt DNA Tiến hành PCR chọn lọc sơ cấp (pre-selective PCR): Primer cho phản ứng gồm phần: phần bổ sung với trình tự adapter; phần bổ sung trình tự cắt hạn chế phần chọn lọc mở rộng nucleotide (A-T-G-C) Sau phản ứng thứ chọn lọc tập hợp đoạn DNA có số lượng giảm nhiều đoạn DNA chứa nu bổ sung với nu mở rộng primer khuếch đại, đoạn DNA có đầu hạn chế giống bị loại bỏ tự bắt cặp tạo vòng Sản phẩm dùng làm khuôn cho phản ứng PCR thứ cấp Tiến hành PCR chọn lọc thứ cấp Những sản phẩm khuyếch đại tiền chọn lọc dùng cho phản ứng PCR khác, lần tập hợp phân đoạn lại chọn Primer phản ứng PCR lần khác với lần đầu 3’ gắn phần nu mở rộng 2-3 nucleotide primer đầu cắt EcoRI đánh dấu huỳnh quang đoạn chứa trình tự hạn chế EcoRI phát máy đọc huỳnh quang Việc sử dụng nu chọn lọc hạn chế bắt cặp sai nhân lên đoạn chuyên biệt Thăm dò đa hình có thể thực với đồng vị phóng xạ, nhuộm huỳnh quang hay nhuộm bạc 25 Những vấn đề cần quan tâm dịch mã mẫu hình band AFLP Cơ sở phân tử đa hình AFLP thường tạo mức độ nucleotide Kỹ thuật AFLP thăm dò đa hình xuất từ thay đổi (hình dáng hay kích cỡ) điểm cắt hạn chế cạnh điểm cắt này, gây thiếu không bổ sung nu mở rộng đầu 3’ làm ngăn cản khuyếch đại Có thể sử dụng enzyme cắt hạn chế khác nhau, Thay đổi loại nucleotide chọn lọc tiền chọn lọc gia tăng tìm kiếm đa hình có ích Càng nhiều nucleotide chọn lọc đa hình thăm dò Những bands thường ghi diện hay không Những bands dị hợp khác với đồng hợp thăm dò dựa vào độ dày dấu hiệu, điều đòi hỏi tinh tế người làm thí nghiệm 26 Nguyên tắc phép điện di theo thang nồng độ biến tính Điện di theo thang nồng độ biến tính phương pháp phân tích dấu hiệu mức độ phân tử cách tách dần sản phẩm phản ứng PCR Sản phẩm DNA đưa vào điện di qua gel polyacrylamide điều kiện biến tính gia tăng dần Thang nồng độ ổn định thiết lập vuông góc với hướng điện di Chất gây biến tính thường dùng là: urea hay formamide (một amide hình thành từ acid formic) Dựa vào đặc tính tái biến tính chuỗi DNA, biến tính DNA xảy qua trình điện di o Phân tử DNA di chuyển theo chuỗi đôi, sau thành phần gel thay đổi, DNA “duỗi ra” (bị biến tính) tách thành chuỗi đơn o Sự thay đổi cấu trúc dẫn đến khả khác biệt dễ nhận thấy di chuyển qua gel o Phân tử DNA thay đổi hình dạng chúng ngừng di chuyển o Những khác biệt trình tự DNA xác định dựa vào khác biệt nồng độ biến tính khác (điểm tan) o Hay nói cách khác điểm tan DNA phụ thuộc vào trình tự DNA vùng tan dẫn đến mẫu hình bands khác Cho phép thăm dò đa hình DNA nhỏ hay đột biến áp dụng đoạn DNA dài hàng trăm bp mà không cần biết trước đa hình đoạn DNA nghiên cứu 27 Nguyên tắc microarray Microarray đoạn trình tự có gắn nhãn xác định (ESTs) tạo từ thư viện cDNA loci biết Những ESTs đặt lên kính có kích cỡ xác định, (ở 8x12 array) Trong thực tế, vi mạng chứa tới hàng ngàn ESTs Vi mạng xếp đốm nhỏ DNA (spots of DNA) gắn vào gương hay màng nylon Nguyên tắc sở chip cặp đôi base hay lai đầu dò ngắn trình tự DNA bổ sung Mỗi điểm chip đại diện cho chuỗi mã hóa khác từ gen khác nhau, làm mẫu dò DNA ghép nối với cDNA tạo Nguyên lý kỹ thuật cDNA microarray mRNA transcriptomes chuẩn bị từ mô thể đối chứng từ mô thí nghiệm cDNA chuẩn bị gắn nhãn với hai loại thuốc nhuộm huỳnh quang khác Thư viện DNA thí nghiệm đối chứng lai với microarray Sự kích thích dòng laser đối ngẫu kích hoạt thuốc nhuộm bổ sung, phát huỳnh quang tỉ lệ với mức độ lai vừa xảy Sự biểu gene tương ứng đo theo tỉ lệ hai biểu huỳnh quang: “up-regulation” (dò theo chiều lên) tương ứng với đối chứng thấy màu đỏ, “down-regulation” (dò theo chiều xuống) tương ứng với mẫu thí nghiệm thấy màu xanh (green), constitutive expression (biểu thành lập, tỉ lệ 1:1 so với đối chứng) thấy màu đen trung tính Cường độ màu sắc thấy tỉ lệ với chênh lệch biểu 28 Ưu điểm nhược điểm kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền Những kỷ thuật bao gồm : DNA sequencing, ESTs, microarrays, DArT, SNPs DNA sequencing Là kết hợp PCR phương pháp phân tích trình tự Sanger Sử dụng máy đọc trình tự tự động, có điện di, nhiên phản ứng không cần chia subsamples Ưu điểm: - Cho kết xác - Số lượng thông tin thu lớn - Chỉ cần sử dụng tube thí nghiệm - Do phương pháp phân tích toàn DNA thí nghiệm nên phát đột biến Nhược điểm: - Chi phí cao - Đòi hỏi kỹ thuật khắt khe ESTs: Đoạn trình tự có gắn nhãn xác định (Expressed sequence tags) - Đó đoạn trình tự DNA ngắn, thường dài từ 200 đến 500 nu - Chúng dùng để xác định phiên gen, công cụ để khám phá gen xác định trình tự gen - Được tạo việc xác định trình tự đầu gen xác định từ thư viện gen - Phương pháp có hiệu cao việc tìm gen Thuận lợi - Những trình tự tổng hợp nhanh chóng không đắt - Chỉ cần phân tích trình tự để tổng hợp cDNA - Không cần phải kiểm tra lại lỗi không phát sinh ứng dụng EST để tổng hợp trình tự - marker di truyền tốt - đồng trội - Là nguồn trình tự để lấy primer SSRs Khó khăn - Việc phân lập mRNA khó - Introns, mà chứa thông tin quan trọng, không cDNA tái Microarrays Microarray đoạn trình tự xác định (ESTs) tạo từ thư viện cDNA loci biết Thuận lợi: - Kỹ thuật cao - Có thể thăm dò toàn genome - Cho phép khám phá mối liên quan kiểu hình kiểu gene Bất lợi: - Dữ liệu trình tự phải có sẵn - Đắt - Phụ thuộc vào kỹ thuật cao - Lượng kiểu liệu tạo đòi hỏi phương tiện chuyên gia máy tính trình độ cao - Nhanh chóng thu thập liệu phân tích - Phát sở thay đổi thêm vào xóa bỏ - Phát khác biệt methyl hóa DNA, tùy thuộc vào loại enzyme sử dụng để tạo mảnh vỡ Diversity array technology (DArT) : kỹ thuật mạng đa dạng Là phương pháp để khám phá cho phép đánh dấu điểm di truyền đa hình Ưu điểm - Độc lập với trình tự DNA - Phạm vi di truyền phân tích xác định người sử dụng dễ dàng mở rộng Nhược điểm - Phức tạp, liệu đưa Single nucleotide polymorphisms (SNPs) : đa hình nucleotide đơn Một kiểu thị làm sẵn thông qua kỹ thuật xác định trình tự SNPs Sự đa hình thay base đơn độc trình tự tương đồng SNPs thường xảy kiểu đa hình SNPs xác định nhờ vào vi mạng gen hay máy DHPLC Ưu điểm: - Sản phẩm PCR nhỏ: + Marker làm việc với mẫu DNA bị cắt ngắn - Phổ biến gene - Có thể đa hình hàng trăm hàng nghìn chip - Xử lý mẫu hoàn toàn tự động - Không có sản phẩm lặp Nhược điểm: - Ít allele + Mỗi marker thông tin - Phải có nhiều kiểu di truyền SNP để có mức độ thông tin mẫu DNA - Hỗn hợp giải thích (Mixture interpretation) khó khăn - Sự đa hình không thật làm việc - Hiện sử dụng mẫu DNA nhiều STRs 29 Nguyên tắc việc phân tích đối ngẫu, sắc ký lỏng cao áp Phân tích đối ngẫu (Heteroduplex Analysis) - sản phẩm khuyếch đại PCR trộn với với lượng tương đương, biến tính 95°C sau làm lạnh - Trong suốt trình làm lạnh, chuỗi đơn gắn lại để hình thành DNA đối ngẫu - Những ghép đôi không tương xứng đối ngẫu làm cho có cấu trúc chiều khác biệt, với chuyển động bị giảm mà tỉ lệ với mức độ đa dạng chuỗi trình tự Sắc ký lỏng cao áp (DHPLC) - DHPLC: Denaturing high performance liquid chromatography - Là phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao biến tính sử dụng HPLC ngược pha phân tách SNP (Single nucleotide polymorphisms) - Được sử dụng để xác định đột biến đa hình dựa phát kiểu heteroduplex nucleotide không khớp sợi đôi DNA khuếch đại PCR - Các sợi DNA biến tính cách nung nóng sau hồi tính (reanneal) - Nhiệt độ nóng chảy phân đoạn DNA hồi tính xác định độ dài thời gian chúng giữ lại cột - Các sản phẩm hồi tính đưa vào máy DHPLC 30 Các kiểu biến động DNA mà thăm dò thị sequencing, EST SNP DNA sequencing cho phép thăm dò biến động mức độ nucleotide ESTs công cụ có hiệu lực để thăm dò đa hình vùng coding; Phương pháp có hiệu cao việc tìm gene Chúng dùng để xác định phiên gene, công cụ để khám phá gene xác định trình tự gene Microarrays DArT phân tích đồng thời nhiều loci SNPs thay base đơn độc trình tự đặc trưng cho biến dị DNA thường 31 Các bước liên quan đến việc xác định microsatellite, thiết kế primer thăm dò đa hình Tách chiết genome từ mô quan tâm (tùy loại mô ta có phương pháp chiết phù hợp) Cắt nhỏ DNA genome thành đoạn có kích thước phù hợp enzym giới hạn, thường độ dài từ 300-600 bp, dễ dàng chèn vào plasmid Phân tách đoạn DNA điện di gel thạch agarose 1%, phân tách đoạn từ 300- 500bp Chuyển lên màng lai theo nguyên tắc southernblot Dùng mẫu dò đoạn DNA đánh dấu cho lai ghép với màng lai, mẫu dò trình tự DNA tương ứng với trình tự microsatellite mà quan tâm So sánh khôi phục vạch DNA tương ứng với Microsatellite mà quan tâm Chuyển vào vector sequencing (M13) Sequencing xác định Microsatellite trình tự DNA nằm trình tự Microsatellite, phân tích vị trí primer tốt chiều dài đoạn lặp lại có ích (thường lần lặp) Tổng hợp mồi Mồi tổng hợp dựa vùng flanking phân tích lựa chọn từ bước Ngoài việc đảm bảo yếu tố cần thiết primer (như %GC, nhiệt độ chảy T m…) cần đáp ứng đặc điểm sau: o Tính tương thích cặp mồi: Cặp mồi gắn với trình tự mức độ bổ sung không cao o Không chứa đoạn làm dừng phiên mã (stop codon) đoạn trình tự làm dừng phản ứng PCR o Tránh đoạn palidrome (đối xứng đảo ngược) o Tổng chiều dài sản phẩm khuếch đại từ 100-250 bp, khả thi để phân tích trình tự gel dễ minh họa trực quan phần mềm máy tính o Tránh đoạn lặp lại gần vùng kết thúc trình tự Một vài đoạn DNA phân tích trình tự cho thấy phần lặp lại tốt, lại gần với phần kết thúc, không đủ vùng flanking để thiết kế primer (đó lí lựa chọn chiều dài đoạncắt hạn chế 300 – 600 bp tốt nhất, không ngắn để chạy trình tự không dài để tìm đoạn lặp vị trí phù hợp) Kiểm tra đa hình Microsatellite chạy điện di gel đọc băng kết Ngày người ta sử dụng phân tích tự động để kiểm tra tính đa hình microsatellite Theo đó, sản phẩm PCR đánh dấu huỳnh quang sau cho vào máy phân tích Quá trình phân tích tách đoạn với chiều dài khác vị trí khác nhau, hiển thị peak hình vi tính Theo peak này, pick có đỉnh hiển thị dạng lặp lại ví dụ (CAG) n; vị trí đỉnh peak cho biết số bp trình tự lặp lại 32 Các đặc điểm microsatellite để sử dụng làm thị phân tử, phân tích đa dạng di truyền - Có tính đa hình cao, loại có tính đa hình cao loại không bị ngắt quãng sử dụng cho nhiều mục đích khác - Được tìm thấy tất thể sống đặc biệt thể sống có gen lớn - Phân bố toàn genome, trung bình 10000 nucleotide gặp trình tự Microsatellite - Không có hoạt động phiên mã - Có thể nằm vùng intron gen, số nằm trình tự ghi mã gene thường vùng đột biến Rất nhiều DNA Microsatellite tìm vùng phía vùng khởi đầu mã vùng mang mã - Ở số trường hợp thay đổi (mất thêm) đơn vị lặp lại DNA Microsatellite làm thay đổi chức hoạt động Promotor Vị trí DNA Microsatellite gần hay xa Promotor làm hoạt động promotor thay đổi - Các đoạn nucleotide ngắn vùng phía trình tự hoạt hoá hoạt động vị trí bám cho nhiều protein điều hoà đặc biệt bám vào - Số lượng khác đoạn lặp lại DNA Microsatellite vùng mã hoá có quan hệ với biểu gen chức gen Sự thay đổi số lượng lặp lại trình tự DNA Microsatellite dẫn đến khác chức protein hoạt động gen ảnh hưởng tới chức sinh lý phát triển thể [...]... load mẫu vào gel điện di trên gel tinh bột hay acrylamine: thêm dung dịch đệm gắn dòng điện vào hệ thống, chạy trong 1h nhuộm mô hóa học: cắt lớp gel theo cùng chiều và chuyển lên các khay nhuộm nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm tùy mỗi loại enzyme phân tích kết quả điện di 14 Những điểm chính cần quan tâm để dịch mã mẫu hình các band Những vấn đề chính là: - Cấu trúc bậc 4 của enzymes... ứng PCR được thực hiện với các primer ngắn, thi t lập điều kiện phản ứng nghiêm ngặt để hạn chế tạo ra những sản phẩm không chính xác Hỗn hợp các chất cho phản ứng PCR Primer (10 base) được bán sẵn ở nhiều công ty MgCl2 (thêm) để gia tăng số lượng bands được khuyếch đại trong một phản ứng Tuy nhiên cần phải tính toán để tìm ra nồng độ thích hợp, tránh việc khuyếch đại những đoạn gene không đặc... cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao Nhược điểm RADP markers là trội Sự khuyếch đại có thể xảy ra ở cùng 1 locus hay không Có nghĩa là cá thể đồng hợp và dị hợp không thể phân biệt Thi u những thông tin về các sản phẩm khuyếch đại Khó để có thể lặp lại (kết quả phụ thuôc vào chất lượng DNA, thành phần & điều kiện của phản ứng PCR) Vấn đề của việc... được di truyền lại vì vậy có thể đánh giá dị hợp tử + Không đòi hỏi thông tin về các trình tự + Bởi vì dựa vào sự đồng dạng của các trình tự nên có thể dùng được cho những nghiên cứu sự phát sinh loài giữa các loài có liên quan + Phù hợp tốt cho việc xây dựng bản đồ di truyền + Có thể phân biệt – có thể ở mức độ loài hoặc quần thể, hoặc cá thể + Đơn giản Nhược điểm: + Đòi hỏi một lượng lớn DNA + Không... tố cần thi t của 1 primer (như về %GC, nhiệt độ chảy T m…) thì cần đáp ứng các đặc điểm sau: o Tính tương thích của cặp mồi: Cặp mồi sẽ không thể gắn với trình tự nếu mức độ bổ sung không cao o Không chứa các đoạn làm dừng phiên mã (stop codon) hoặc các đoạn trình tự làm dừng phản ứng PCR o Tránh các đoạn palidrome (đối xứng đảo ngược) o Tổng chiều dài sản phẩm khuếch đại từ 100-250 bp, sẽ khả thi để... riêng biệt có thể được đánh giá Tiêu chuẩn để chọn lựa các bands: Khả năng lặp lại (reproducibility): cần để lặp lại các thí nghiệm Độ dày Kích cỡ Sự chia cách có thể quan sát được trong một quần thể lập bản đồ 19 Thuận tiện và bất tiện của kỹ thuật RADP? Ưu điểm của RADP Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần... điện di Chất gây biến tính thường dùng là: urea hay formamide (một amide hình thành từ acid formic) Dựa vào đặc tính tái biến tính của chuỗi DNA, sự biến tính DNA xảy ra qua quá trình điện di o Phân tử DNA đầu tiên di chuyển theo chuỗi đôi, sau đó do thành phần của gel thay đổi, DNA “duỗi ra” (bị biến tính) và tách thành những chuỗi đơn o Sự thay đổi trong cấu trúc dẫn đến khả năng khác biệt dễ... màng tế bào, giải phóng các thành phần có trong tế bào ra ngoài môi trường dịch trích • Giai đoạn 2: Làm biến tính protein, loại bỏ protein và các thành phần hữu cơ khác (polysaccharides, polyphenols, lipids,…) • Giai đoạn 3: Tủa DNA bằng isopropanol hay ethanol 100 %, thường tủa bằng isopropanol lạnh trước, sau đó tiếp tục tủa bằng ethanol 100 % kết hợp với muối Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách... những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối xứng để tạo ra những phân tử đầu so le (đầu kết dính) Bởi vì các đặc tính của chúng mà tất cả những kiểu enzyme này trở thành cốt yếu cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp Enzyme hạn chế có bán sẵn trên thị trường và thường được cung cấp với thông tin 11 Thế nào là đa hình trong chuỗi DNA? Vô số những khác biệt lớn và nhỏ trong chuỗi nucleotide giữa các cá thể... chỉ primer của đầu cắt bởi EcoRI được đánh dấu huỳnh quang và do đó chỉ đoạn nào chứa trình tự hạn chế của EcoRI mới được phát hiện trên máy đọc huỳnh quang Việc sử dụng 3 nu chọn lọc sẽ hạn chế sự bắt cặp sai và do đó chỉ nhân lên các đoạn chuyên biệt 5 Thăm dò sự đa hình có thể thực hiện được với các đồng vị phóng xạ, nhuộm huỳnh quang hay nhuộm bạc 25 Những vấn đề cần quan tâm khi dịch mã mẫu hình