1 Các tính chất gốc tự DPPH - Là gốc tự bền có hiệu ứng liên hợp phân tử - Độ hấp thụ cực đại 517 nm gốc tự Nitơ cho màu tím Methanol [1] - Có cơng thức cấu tạo sau : - Cơ chế phản ứng gốc tự DPPH chất chống oxy hóa : DPPH ˉ + AH ↔ DPPH-H + A˙ - Kết đánh giá thông qua giá trị IC50 (inhibitory concentration) nồng độ chất oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50% gốc tự DPPH khoảng thời gian xác định - Mẫu Vitamin C dùng để so sánh thông qua giá trị IC50 Cách tiến hành Pha mẫu: - Lấy 2ml dịch trích + ml Methanol, lắc Nồng độ mẫu lúc 400 µg/ml - Pha lỗng mẫu: Pha loãng nồng độ mẫu xuống 2, 4, 8, 16 lần Bảng 3.2: Độ pha loãng nồng độ mẫu dịch trích Độ pha lỗng (lần) 16 Nồng độ mẫu dịch trích (µg/ml) 100 50 25 12,5 Pha thuốc thử : - Cân 2,7 mg DPPH cho vào bình định mức 25 ml - Thêm 25 ml MeOH, lắc mạnh cho tan hết, sau thêm MeOH vào cho đủ 25 ml - Để ổn định tối 30 phút, 4ºC Pha dung dịch chuẩn: - Cân mg vitamin C vào bình định mức 5ml - Thêm ml MeOH vào, lắc mạnh cho tan hết, sau thêm MeOH vào cho đủ ml Nồng độ vitamin C lúc 400 µg/ml - Pha loãng dung dịch chuẩn xuống 2, 4, 8, 16 lần MeOH Bảng 3.3: Độ pha loãng nồng độ vitamin C Độ pha loãng (lần) 16 Nồng độ mẫu vitamin C (µg/ml) 100 50 25 12,5 Đo dung dịch chuẩn - Cho 1ml DPPH vào 1ml dung dịch chuẩn độ pha loãng - Để ổn định bóng tối 30 phút - Đo độ hấp thụ quang (OD) bước sóng 517nm Đo mẫu - Cho 1ml DPPH vào 1ml mẫu dịch trích độ pha lỗng - Để tất vào bóng tối, 30 phút - Đo độ hấp thụ quang (OD) bước sóng 517 nm Tính kết thử nghiệm chống oxy hóa % Ức chế DPPH = (Ao- A)/Aox 100 Đo độ hấp thu DPPH : A0= 1,67458 A: Độ hấp thu dung dịch phản ứng IC50: Nồng độ ức chế 50% gốc DPPH Khả ức chế gốc tự đánh giá phương pháp gốc tự bền DPPH Kết đo OD vitamin C Vitamin C đo lần lấy giá trị trung bình Bảng 1: Nồng độ kết đo OD vitamin C Nồng độ vitamin C (µg/ml) 100 50 25 12,5 A (OD đo 517 nm) Dựng đường chuẩn tính IC50 cách ngoại suy Kết đo OD dịch trích Sen Dịch trích mẫu Sen đo lần lấy giá trị trung bình Bảng 2: Nồng độ kết đo OD dịch trich Sen Nồng độ dịch trích sen (µg/ml) 100 50 25 12,5 A (OD đo 517 nm) Dựng đường chuẩn tính IC50 cách ngoại suy Bùi Trọng Đạt, Phùng Văn Trung, Phan Nhật Minh, Hoàng Thị Ngọc Dung Phạm Cao Thanh Tùng, 2003 Xây dựng quy trình thử hoạt tính kháng oxy hóa DPPH sàng lọc số cao chiết từ cỏ Việt Nam.Tuyển Tập Cơng Trình Nghiên Cứu Khoa Học Công Nghệ năm 2003; tr.150-155