CHƯƠNG I: NHỮNG NGUYÊN TẮC HOÁ SINH TRONG CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT ðể tạo sản phẩm lên men ñều phải qua bước sau: - Chuẩn bị môi trường - Chuẩn bị giống - Lên men - Thu hồi tinh chế sản phẩm ðể tạo sản phẩm có chất lượng tốt suất cao cần hiểu rõ vấn ñề sau 1.1 Phân loại sản phẩm công nghệ vi sinh vật Các sản phẩm lên men công nghiệp ñược phân loại theo tiêu chuẩn sinh lí trao ñổi chất Sự phân loại dựa vào sản phẩm trình lên men trình sản xuất nhờ vi sinh vật luôn tạo thành nhiều sản phẩm 1.1.1 Vật chế tế bào (sinh khối) Cơ chất tế bào Ví dụ: + protein ñơn bào (trạng thái chết) + vi khuẩn cố ñịnh ñạm (sống): Rhizobium, Azotobacter, VK trừ sâu Bacillus thuringiensis… Việc tổng hợp sinh khối hay vật chất tế bào ñồng với sinh trưởng vi sinh vật Sinh trưởng sinh sản gắn liền với Sinh trưởng tăng khối lượng, sinh sản tăng số lượng 1.1.2 Các sản phẩm trao ñổi chất Cơ chất sản phẩm + tế bào Các sản phẩm cuối trao ñổi lượng (các sản phẩm lên men) Ví dụ: etanol, axít lactic, axeton-butanol… Lên men trình yếm khí thu nhận lượng, ñó hydro tách ñược chuyển ñến chất nhận hữu (nó không ñồng nghĩa với lên men ngôn ngữ quốc tế - ñược hiểu trình sản xuất công nghiệp nhờ vi sinh vật) Một số thể tiến hành lên men oxy làm chất nhận hydro cuối (kỵ khí tuỳ tiện), nhóm thể lên men bắt buộc không chứa enzym hô hấp Các hợp chất hữu nhận hydro hợp chất ñược hinh thành trình trao ñổi chất dị hoá Sau nhận hydro, hợp chất thải tế bào giống sản phẩm cuối hô hấp Từ ñó nảy vấn ñề sản xuất cần chọn ñiều kiện nuôi cho nhiều chất ñược chuyển thành sản phẩm lên men tốt Ví dụ: sản xuất rượu ñể tăng hàm lượng rượu cần tăng hàm lượng ñường giảm yếu tố quan trọng cho sinh trưởng 2 Các chất trao ñổi bậc Ví dụ: axít amin, nucleotit, vitamin, axít xitric Các chất trao ñổi bậc viên gạch cấu trúc có trọng lượng phân tử thấp cao phân tử sinh học tế bào chất: axít amin, nucleotit, nucleozit, ñường, axít béo, vitamin… Ngoài sản phẩm trung gian trình trao ñổi chất (các axít hữu chu trình ATC) chất trao ñổi bậc Các chế ñiều hoà phát triễn trình tiến hoá bảo ñảm cho chất trao ñổi bậc ñược tổng hợp ñến mức ñộ cần thiết Các chất trao ñổi bậc Ví dụ: kháng sinh, alcaloit Các chất trao ñổi bậc chất trao ñổi có trọng lượng phân tử thấp, không gặp thể, phân bố chúng giới hạn ñơn vị phân loại ñịnh Chúng chức chung trao ñổi chất tế bào tế bào tồn mà không cần ñến chúng Tuy nhiên, chất trao ñổi bậc có ý nghĩa với sinh trưởng thể sản sinh chúng Chẳng hạn số chất trao ñổi bậc có vai trò hấp thụ sắt thiếu nguyên tố Thường chất bậc ñược tạo thành sinh trưởng ñã kết thúc Các chủng tồn tự nhiên thường tạo thành chất trao ñổi bậc 2, chất ñược tích luỹ tế bào thải 4.Các enzym Ví dụ: enzym ngoại bào: proteaza, amylaza enzym nội bào : asparaginaza, penixilinaza Tế bào vi sinh vật chứa khoảng 1000 enzym khác Một số enzyme có mặt với số lượng vài phân tử nhiều enzym có mặt với số lượng lớn Chỉ enzym chịu trách nhiệm phân huỷ chất không hoà tan tinh bột, xenlulo, protein…mới ñược tiết từ tế bào vào môi trường Vi sinh vật có khả sử dụng chất khác cho sinh trưởng thích ứng với ñiều kiện sinh trưởng khác Trong giới hạn thể tích tế bào tổng hợp enzym mà cần Trong công nghệ sản xuất enzym cần phải ñiều khiển trao ñổi chất cho enzym mà ta mong muốn ñược tổng hợp nhiều tốt 1.1.3 Các sản phẩm chuyển hoá chất Ví dụ: oxy hoá không hoàn toàn ñể tạo thành axit axetic soboza Trong trình chuyển hoá tế bào hoạt ñộng hệ thống xúc tác cho nhiều bước chuyển hoá chất Về mặt lí thuyết phản ứng xảy nhờ enzym cô lập, nhiên ñường thực ñược không kinh tế (ví dụ với phản ứng enzym phụ thuộc lượng) Các enzym chuyển hoá chất theo cách ñặc hiệu Ví dụ: chuyển hoá tách hydro xảy nhờ phân tử steroid ý nghĩa ñối với tế bào (cũng ñó phản ứng khử ñộc) Trong chuyển hoá ñể tạo axít axetic gắn liền với sinh trưởng, gắn liền với thu nhận lượng 1.2 ðộng học sinh trưởng tạo thành sản phẩm Sinh trưởng quần thể vi sinh vật diễn qua giai ñoạn khác Sự sinh sản tế bào bắt ñầu sau giai ñoạn tiềm phát Trong giai ñoạn log xảy sinh sản theo hàm số mũ Sau thời gian sinh trưởng ngừng lại thiếu chất dinh dưỡng tích luỹ chất ức chế Các tế bào chuyển vào giai ñoạn cân Trong giai ñoạn không diễn sinh trưởng tế bào hoạt ñộng trao ñổi chất Toàn trình nuôi gắn liền với thay ñổi kéo dài ñiều kiện nuôi Chất dinh dưỡng giảm ñi, số lượng tế bào tăng lên ðồng thời hoạt tính trao ñổi chất thay ñổi Về phương diện chức sản phẩm trao ñổi chất ñối với tế bào phân biệt nhóm: - Các sản phẩm mà hình thành chúng gắn liền với sinh trưởng Ví dụ: sản phẩm lên men, chất trao ñổi bậc 1, enzym Sự tổng hợp sản phẩm xảy thời gian sinh trưởng tiếp diễn sau sinh trưởng ñã kết thúc - Các sản phẩm mà hình thành chúng xảy sau sinh trưởng ñã kết thúc; ví dụ sản phẩm trao ñổi chất bậc ðồng thời Thời gian Không ñồng thời Thời gian Hình 1: ðộng học trình sinh trưởng tạo thành sản phẩm Nhiều sản phẩm chiếm vị trí trung gian Ví dụ tổng hợp axít amin diễn thời gian sinh trưởng tiếp diễn sau sinh trưởng ñã kết thúc, trình tổng hợp tiếp diễn sở sai hỏng di truyền Sự tổng hợp nhiều enzym xảy không song song với sinh trưởng mà gắn liền với trạng thái sinh lí ñịnh tế bào lên men công nghiệp cần phải tìm trạng thái sinh lí suất cao trì thời gian dài 1.3 Sự tổng hợp thừa Vi sinh vật tồn tự nhiên sinh sản phẩm trao ñổi chất thành phần tế bào mức ñộ cần thiết cho sinh sản tối ưu cho trì loài Sự trao ñổi chất ñược bảo ñảm nhờ chế ñiều hoà Ví dụ: chế cần hoạt ñộng cho axit amin không ñược tổng hợp nhu cầu tổng hợp protein Như vậy, ñiều kiện tự nhiên sản sinh dư thừa sản phẩm trao ñổi chất bậc 1, bậc enzym Nếu tự nhiên chế ñiều hoà bị rối loạn, ví dụ kết ñột biến thể ñột biến sai hỏng trao ñổi chất thường có hại ñốt với chủng ban ñầu 1.3.1 Những nguyên tắc ñiều hoà trao ñổi chất Có chế chịu trách nhiệm ñiều hoà trao ñổi chất: ðiều hoà hoạt tính enzym nhờ ức chế sản phẩm cuối hay gọi kìm hãm theo liên kết ngược ðiều hoà tổng hợp enzym nhờ kiềm chế sản phẩm cuối giải kiềm chế ðiều hoà tổng hợp enzym nhờ kiềm chế dị hoá Các enzym cấu trúc Glucoza Kiềm chế dị hoá Kiềm chế sản phẩm cuối A E.1 B E.2 C E.3 D E.4 S.phẩm cuối Ức chế sản phẩm cuối Sơ ñồ1: Các nguyên tắc ñiều hoà enzyme * Trong chế sản phẩm cuối trình sinh tổng hợp gây ức chế trình tổng hợp Ở ñây, sản phẩm cuối dù ñược hình thành tế bào hay ñược thu nhận từ môi trường dinh dưỡng, ñiều ñó ý nghĩa Trong chế này, sản phẩm cuối nói chung ảnh hưởng ñến enzyme ñầu tiên chuỗi sinh tổng hợp Enzym có tính ñịnh protein dị lập thể Nó có ñặc ñiểm thay ñổi cấu hình không gian có mặt sản phẩm cuối nhằm giảm bớt hoạt tính xúc tác Sự ức chế xảy nhanh có hiệu * Trong chế 2, sản phẩm cuối ức chế tổng hợp enzym cần cho tạo thành sản phẩm ấy, ñó việc ñọc thông tin di truyền cần cho tổng hợp enzym (sự phiên âm) bị phong toả Ở nồng ñộ cao sản phẩm cuối tổng hợp enzym tham gia vào chuỗi phản ứng bị ngừng bị kéo dài cách ñáng kể Nếu nồng ñộ sản phẩm cuối giảm xuống mức ñó xảy giải kiềm chế, nghĩa enzym ñược tạo thành với tốc ñộ cao Sự ñiều hoà theo kiểu xảy từ từ gắn liền với tổng hợp enzym Hoạt ñộng Chất ảnh hưởng dị lập thể Chất ảnh hưởng dị lập thể Thể ñột biến Không hoạt ñộng Dạng hoang dại Hình 2: Mô hình ức chế sản phẩm cuối *Sự kiềm chế dị hoá ñiều hoà trình tổng hợp enzym dị hoá xúc tác phân huỷ chất Các enzym ñược tổng hợp nhờ cảm ứng enzym Cơ chế tương tự chế kiềm chế tức xảy mức ñộ phiên âm Trong cảm ứng enzym, chất dinh dưỡng ñóng vai trò chất cảm ứng kích thích tổng hợp enzym xúc tác cho phân huỷ nó, nghĩa chất cảm ứng tổng hợp Do ñó, việc tổng hợp enzym cảm ứng xảy có mặt chất tương ứng môi trường * Sự kiềm chế dị hoá ñiều hoà trình tổng hợp enzym dị hoá xúc tác phân huỷ chất Các enzym ñược tổng hợp nhờ cảm ứng enzym Cơ chế tương tự chế kiềm chế tức xảy mức ñộ phiên âm Trong cảm ứng enzym, chất dinh dưỡng ñóng vai trò chất cảm ứng kích thích tổng hợp enzym xúc tác cho phân huỷ nó, nghĩa chất cảm ứng tổng hợp Do ñó, việc tổng hợp enzym cảm ứng xảy có mặt chất tương ứng môi trường Gen ñiều khiển chất kiềm chế không hoạt ñộng sản phẩm cuối không phong toả truyền thông tin tổng hợp enzym Các gen cấu trúc chất kiềm chế hoạt ñộng chất kiềm chế không hoạt ñộng bị sai hỏng (ngay sản phẩm cuối ) không phong tỏa truyền thông tin tổng hợp enzym chất kiềm chế không hoạt ñộng Sản phẩm cuối Chất kiềm chế hoạt ñộng Không có truyền thông tin không tổng hợp enzym Dạng hoang dại không phong tỏa truyền thông tin tổng hợp enzym Thể ñột biến Hình 3: Mô hình kiềm chế sản phẩm cuối Nếu môi trường có mặt nhiều chất trước hết xảy tổng hợp enzym xúc tác phân huỷ chất dễ sử dụng Sự tổng hợp enzym khác bị ức chế kiềm chế dị hoá Thông thường glucoza chất thích hợp 1.3.2 Những sai hỏng di truyền ñiều hoà trao ñổi chất Các chế ñiều hoà trao ñổi chất bị thay ñổi ñột biến dẫn tới tổng hợp thừa chất trao ñổi chất Những enzyme dị lập thể vị trí phản ứng với chất, chúng vị trí khác ñối với sản phẩm cuối (hình 2) Vị trí thứ gọi trung tâm dị lập thể Hai vị trí tách biệt không gian khác cấu trúc Một ñột biến dẫn ñến kết làm protein enzyme dị lập thể bị thay ñổi cách ñi khả phản ứng với chất hiệu ứng hoạt tính xúc tác Một protein bị biến ñổi hoạt ñộng có mặt sản phẩm cuối dẫn ñến tổng hợp thừa sản phẩm cuối tương ứng (hình phía bên phải) Trong kiềm chế tổng hợp enzym xảy phản ứng liệt phạm vi thông tin di truyền, phiên âm (hình 3) Sự ñiều hoà tổng hợp enzym bị rối loạn ñột biến khác Những ñột biến ñụng chạm ñến gen kiềm chế dẫn tới sai hỏng chất kiềm chế làm biến nó; hay ñụng chạm ñến gen ñiều khiển làm cho gen khả tác dụng với chất kiềm chế (bên phải hình 3) Toàn sai hỏng tương ứng biểu cảm ứng enzyme Nhờ sai hỏng mà enzyme cảm ứng trở thành enzyme cấu trúc, nghĩa chúng tồn tế bào không phụ thuộc vào chất kiềm chế dị hoá bị ñi CHƯƠNG II: NHỮNG VẤN ðỀ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG TRONG CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT Sản xuất sinh khối sản phẩm trao ñổi chất trình lên men có nhiều ñiểm giống phương pháp kỹ thuật Việc áp dụng kỹ thuật phương pháp tuỳ ñối tượng vi sinh vật mục tiêu sản phẩm cuối Trên sở ñó áp dụng mục tiêu phương pháp riêng Chính có phương pháp chung cho tất sản phẩm Việc áp dụng kỹ thuật phương pháp sở nguyên tắc chung kỹ thuật phương pháp ñã trình bày Vì thế, chương giới thiệu nguyên tắc chung kỹ thuật phương pháp ñược áp dụng rộng rãi ngành vi sinh công nghiệp Các nguyên tắc chung ñó bao gồm việc tuyển chọn giống vi sinh vật, giữ giống vi sinh vật, trình thiết bị