Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -- Nguyễn Hồ ng Nhung NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội-2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -- Nguyễn Hồ ng Nhung NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Trịnh Hồng Thái TS Đỗ Minh Hà Hà Nội-2015 LỜI CẢM ƠN Lời em xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn kính trọng sâu sắc thầy, PGS TS Trịnh Hồng Thái, người tận tình hướng dẫn em suốt trình học tập thực luận văn Thầy mở cho em vấn đề khoa học lý thú, hướng em vào nghiên cứu lĩnh vực thiết thực vô bổ ích, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu Em học hỏi nhiều Thầy phong cách làm việc, phương pháp nghiên cứu khoa học Em xin trân trọng cảm ơn đến TS Đỗ Minh Hà thầy giáo, cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy cô giáo môn Sinh lý Thực vật Hóa sinh học tận tình giảng dạy dìu dắt suốt thời gian học tập trường Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị tận tình giúp đỡ bảo suốt trình học tập thực luận văn Phòng Proteomics Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, bạn học viên cao học em sinh viên làm việc phòng, người làm tôi, bên lúc thất bại hay lúc thành công Trong trình thực đề tài, nhận giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi PTNTĐ Công nghệ Enzym Protein, Trường Đại học KHTN, giúp đỡ cán nhân viên thuộc khoa Tế bào và Giải phẫu bê ̣nh , bệnh viện K, Hà Nội việc cung cấp mẫu nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Luận văn thực phạm vi nội dung kinh phí củađề tài cấp nhà nước (mã số KC.04.10/11-15) Tôi xin chân thành cảm ơn Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Bố , Mẹ người đã v ất vả nuôi khôn lớn và dạy những bài học làm người đầ u tiên , cảm ơn ông bà, cô chú…những người thân con, người dành tình cảm lời động viên Và cuối xin cảm ơn bạn bè , những người ủng hộ và giúp đỡ Hà Nội, tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Hồng Nhung DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic APS Ammonium persulfate ARN Acid Ribonucleic ATP Adenosine Triphosphate AcN Acetonitrile Bp Base pair (cặp bazơ) cs cộng EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide HCC Ung thƣ biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma) HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High-performance liquid chromatography) MT/mt Mitochondria (ti thể) mtADN ADN ti thể (mitochondrial DNA) nADN ADN nhân (nuclear DNA) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction) Smac/DIABLO Chất hoạt hóa caspase thứ hai từ ti thể/ chất ức chế trực tiếp protein gắn trình apoptosis điều kiện pI thấp (Second mitochondria-derived activator of inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI) TEA Triethylamine TEAA Triethylammonium acetate tARN ARN vận chuyển (transfer RNA) rARN ARN ribosome (RNA ribosome) caspase/direct DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Các hóa chất sử dụng cho nghiên cứu Bảng Thành phần hóa chất chạy HPLC Bảng Thành phần phản ứng PCR Bảng Thành phần phản ứng PCR thể tích 15 µl Bảng Công thƣ́c đổ gel polyacrylamide 10% 7cm Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng 10 Bảng 11 Số liệu phân tích HPLC với mẫu có tỉ số hàm lƣợng ADN chuẩn 400bp/100bp khác Số liệu phân tích HPLC với mẫu có tỉ số lƣợng mt/ACTB khác Biến đổi tỉ số mt/ACTB loại mẫu bệnh nhân ung thƣ vú và bệnh nhân u xơ vú Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học bệnh nhân ung thƣ vú Biến đổi tỉ số mt/ACTB loại mẫu bệnh nhân ung thƣ vú và bệnh nhân u xơ vú phƣơng pháp ImageJ Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học bệnh nhân ung thƣ vú phân tích phƣơng pháp ImageJ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Phân bố gen ADN ti thể Hình Sơ đồ quy trình thí nghiệm Hình Chƣơng trình chạy HPLC Hình Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân đoạn gen mt và ACTB Hình ảnh điện di ADN t số tách chiết t mô vú của bê ̣nh nhân Hình ung thƣ vú (điê ̣n di gel agarose 0,8% và nhuộm ethidium bromide) Hình Hình Hình Hình Hình 10 Kết phân tích HPLC với ADN chuẩn 100_200bp và 200_400bp Hình ảnh điện di s ản phẩm PCR đoạn mt và ACTB gel agarose 1,7% Hình ảnh điện di s ản phẩm PCR đa mồi chu kì khác gel polyacrylamide 10%, nhuộm bạc Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB 28 chu kì mẫu khác Hình ảnh khu ẩn lạc sau plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào E.coli DH5α Hình 11 Hình ảnh điê ̣n di sau tách plasmid Hình 12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR plasmid mt và ACTB Hình 13 Kết giải trình tự plasmid có chứa đoạn mt Hình 14 Kết giải trình tự plasmid có chứa đoạn ACTB Hình 15 Hình ảnh phân tích HPLC và Biểu đồ đƣờng chuẩn tỉ số hàm lƣợng ADN chuẩn 400bp/100bp Hình 16 Hình ảnh phân tích HPLC và biểu đồ đƣờng chuẩn tỉ số mt/ACTB Hình 17 Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB loại mẫu Hình 18 Hình 19 Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo nhóm tuổi bệnh nhân ung thƣ vú Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo kích thƣớc khối u bệnh nhân ung thƣ vú Hình 20 Hình 21 Hình ảnh gel phân tích phầm mềm ImageJ Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo loại mẫu phân tích phƣơng pháp ImageJ MỤC LỤC MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined Chƣơng - TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined 1.1 TỔNG QUAN VỀ TI THỂ Error! Bookmark not defined 1.1.1 Cấu trúc và chức ti thể Error! Bookmark not defined 1.1.2 Những biến đổi ti thể và bệnh ung thƣError! Bookmark not defined 1.2 TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ VÚ Error! Bookmark not defined 1.2.1 Phân loại ung thƣ vú Error! Bookmark not defined 1.2.2 Các giai đoạn ung thƣ vú Error! Bookmark not defined 1.2.3 Các yếu tố nguy Error! Bookmark not defined 1.3 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƢỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ Error! Bookmark not defined 1.4 CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ADN TI THỂ Error! Bookmark not defined Chƣơng - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.1 ĐỐI TƢỢNG Error! Bookmark not defined 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.2 Hóa chất Error! Bookmark not defined 2.1.3 Dụng cụ Error! Bookmark not defined 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 2.2.2 Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR đa mồi phục vụ mục đích định lƣợng: Error! Bookmark not defined 2.2.3 Định lƣợng ADN HPLC và phần mềm ImageJ Bookmark not defined Error! 2.2.4 Tính toán thống kê Error! Bookmark not defined Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MÔError! Bookmark not defined 3.2 THIẾT KẾ CÁC CẶP PRIMER CHO PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI Error! Bookmark not defined 3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG ADN BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC VÀ PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH IMAGEJ Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Anh: Alonso A, Martin P, Albarran C, Aquilera B, Garcia O, Guzman A, Oliva H, Sancho M (1997), “Detection of somatic mutations in the mitochondrial DNA control region of colorectal and gastric tumors by heteroduplex and single-strand conformation analysis”, Electrophoresis, 18, pp.682-685 Anderson S., Bankier A T., Barrell B G., de Bruijn M H L., Coulson A R., Drouin J., Eperon I C., Nierlich D P., Roe B A., Sanger F., Schreier P H., Smith A J H., Staden R & Young I G (1981), “Sequence and organization of the human mitochondrial genome”, Nature, 290, pp.457-465 Bassam B J., Caetano-Anollés G and Gresshoff P M (1991), “Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels”, Anal Biochem, 196 (1), pp.80-83 Bianchi M., Bianchi N and Bailliet G (1995), “Mitochondrial DNA mutations in normal and tumor tissues from breast cancer patients”, Cytogenet Cell Genet, 71, pp.99-103 Carew J and Huang P (2002), “Mitochondrial defects in cancer”, Mol Cancer, 12, pp.1-12 Chester K.A., Robson L., Begent R.H., Pringle H., Primrose L., Talbot I.C., Macpherson A.J., Owen S.L., Boxer G., Malcolm A.D (1990), “In situ and slot hybridization analysis of RNA in colorectal tumours and normal colon shows distinct distributions of mitochondrial sequences”, J Pathol, 162, pp.309-315 Dimauro S (2007), “Mitochondrial DNA medicin”, Biosci Rep, 27 (1–3), pp.5-9 DiMauro S and Schon E (2001), “Mitochondrial DNA mutations in human disease”, Am J Med Genet, 106, pp.18-26 Hileman E.O., Achanta G., Huang P (2001), “Superoxide dismutase: an emerging target for cancer therapeutics”, Expert Opin Ther Targets, 5, pp.697-710 10 Hockenbery D (2002), “A mitochondrial achilles heel in cancer?”, Cancer Cell, 2, pp.1-2 11 Jerónimo C., Nomoto S., Caballero O.L., Usadel H., Henrique R., VarzimG., OliveiraJ., Lopes C., Fliss MS Sidransky D (2001), “Mitochondrialmutations in earlystageprostatecancer and bodily fluids”, Oncogene, 20, pp.5195-5198 12 King MP., Attardi G (1989), “Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation”, Science , 246, pp.500503 13 Kornburg H (1987), "Tricarboxylic acid cycles," Bioessays , 7, pp 236-238 14 Lightowlers R.N., Chinnery P.F., Turnbull D.M & Howell N (1997), “Mammalian mitochondrial genetics, heredity, heteroplasmy and disease”, Trends Genet, 13, pp.450–455 15 Lin C.S., Wang L.S., Tsai C.M., and Wei Y.H (2008), “Low copy number and low oxidative damage of mitochondrial DNA are associated with tumor progression in lung cancer tissues after neoadjuvant chemotherapy” Interact Cardiovasc Thorac Surg., (6), pp.954-958 16 Liu V.W., Shi H.H., Cheung A.N., Chiu P.M., Leung T.W., Nagley P., Wong L.C., Ngan H.Y (2001), “ High incidence of somatic mitochondrial DNA mutations in human ovarian carcinomas”, Cancer Res, 61, pp.5998-6001 17 Liu X., Kim C., Yang J., Jemmerson R and Wang X (1996) , "Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c", Cell , 86, pp.147-157 18 Marchington D.R., Macaulay V., Hartshorne G.M., Barlow D & Poulton J (1998), “Evidence from human oocytes for a genetic bottleneck in an mtDNA disease”, Am J Hum Genet, 63, pp.769–775 19 Modica-Napolitano J.S., Singh K.K (2002), “Mitochondria as targets for detection and treatment of cancer”, Exp Rev Mol Med, (9), pp 1-19 20 Montoya J., Ojala D., Attardi G (1981), “Distinctive features of the 5'terminal sequences of the human mitochondrial mRNAs”, Nature, 290 (5806), pp.465-70 21 Parrella P., Xiao Y., Fliss M., Sanchez-Cespedes M., Mazzarelli P., Rinaldi M., Nicol T., Gabrielson E., Cuomo C., Cohen D., Pandit S., Spencer M., C Rabitti., Fazio VM., Sidransky D (2001), “Detection of mitochondrial DNA mutations in primary breast cancer and fine-needle aspirates”, Cancer Res, 61, pp.7623-7626 22 Pinz KG & Bogenhagen DF (1998) “Efficient repair of abasic sites in DNA by mitochondrial enzymes”, Mol Cell Biol, 18, pp.1257–1265 23 Polyak K., Li Y., Zhu H., Lengauer C., Willson J.K., Markowitz S.D., Trush M.A., Kinzler K.W., Vogelstein B (1998), “Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours”, Nat Genet, 20, pp.291293 24 Sharp M.G., Adams S.M, Walker R.A., Brammar W.J., Varley J.M (1992) “Differential expression of the mitochondrial gene cytochrome oxidase II in benign and malignant breast tissue” J Pathol, 168, pp.163-168 25 Shuster R.C., Rubenstein A.J & Wallace D.C (1988), “Mitochondrial DNA in anucleate human blood cells” Biochem Biophys Res, 155, pp.1360-1365 26 Susin S.A., Lorenzo H.K., Zamzami N., Marzo I., Snow B.E., Brothers G.M., Mangion J., Jacotot E Costantini P., Loeffler M., Larochette N., Goodlett D.R., Aebersold R., Siderovski D.P., Penninger J.M., Kroemer G (1999), “Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor” Nature, 397, pp.441-446 27 Staniek K., Gille L., Kozlov A.V., Nohl H (2002), “Mitochondrial superoxide radical formation is controlled by electron bifurcation to the high and low potential pathways” Free Radic Res, 36, pp.381- 387 28 Taanman J.W., Street R H., and L Nw (1999), “The mitochondrial genome : structure, transcription, translation and replication”, Biochim Biophys Acta, 1410 (2), pp.103-123 29 Tan D.J., Bai R.K., Wong L.J (2002), “Comprehensive scanning of somatic mitochondrial DNA mutations in breast cancer”, Cancer Res, 62, pp.972976 30 Thyagarajan B., Wang R., Nelson H., Barcelo H., Koh W and Yuan J (2013), "Mitochondrial DNA copy number is associated with breast cancer risk" PLoS One, 8(6), e65968 31 Wang Y, Liu V.W., Xue W.C., Cheung A.N., Ngan H.Y (2006), “Association of decreased mitochondrial DNA content with ovarian cancer progression”, Br J Cancer, 95, pp.1087-91 32 William L.D., John S.S (2002) “Cancer of the breast”, Elsevier Health Sciences, pp.169-179 33 Wu C.W., Yin P.H., Hung W.Y., Li A.F., Li S.H., Chi C.W., et al (2005), “Mitochondrial DNA mutations and mitochondrial DNA depletion in gastric cancer”, Genes Chromosomes Cancer, 44, pp.19–28 34 Warburg O (1956), “On the origin of cancer cells”, Science, 123, pp.309314 35 Xia P., An H., Dang C., Radpour R., Kohler C., Fokas E., Engenhart-Cabilic R., Holzgreve W and Zhong X (2009), “Decreased mitochondrial DNA content in blood samples of patients with stage I breast cancer”, BMC Cancer, 9, pp.454 36 Yamada S., Nomoto S., Fujii T., Kaneko T., Takeda S., Inoue S., et al (2006), "Correlation between copy number of mitochondrial DNA and clinico-pathologic parameters of hepatocellular carcinoma", Eur J Surg Oncol, 32, pp.303–7 37 Ye C., Shu X., Wen W., Pierce L., Courtney R., Gao Y., Zheng W and Cai Q (2008), "Quantitative analysis of mitochondrial DNA 4977-bp deletion in sporadic breast cancer and benign breast diseases", Breast Cancer Res Treat, 108 (3), pp.427–34 38 Yin P.H., Lee H.C., Chau G.Y., Wu Y.T., Li S.H., Lui W.Y., Wei Y.H., Liu T.Y., and Chi C.W (2004), “Alteration of the copy number and deletion of mitochondrial DNA in human hepatocellular carcinoma”, Br J Cancer, 90 (12), pp.2390–6 39 Yu M., Zhou Y., Shi Y., Ning L., Yang Y., Wei X., N Zhang, X Hao, and Niu R (2007), “Reduced mitochondrial DNA copy number is correlated with tumor progression and prognosis in Chinese breast cancer patients”, IUBMB Life, 59 (7), pp 450–457 Tài liệu trang web 40 http://benhvienk.com/ (20.05.2014) 41 http://breastcancer.about.com/od/types/a/bc_types.htm (30/1/2015) 42 http://www.cancerresearchuk.org/ (12.05.2014) 43 http://www.cancer.org/cancer/breastcancer/detailedguide/breast-cancer-riskfactors 44 http://globocan.iarc.fr/old/FactSheets/cancers/breast-new.asp [...]... (2008), “Low copy number and low oxidative damage of mitochondrial DNA are associated with tumor progression in lung cancer tissues after neoadjuvant chemotherapy” Interact Cardiovasc Thorac Surg., 7 (6), pp.954-958 16 Liu V.W., Shi H.H., Cheung A.N., Chiu P.M., Leung T.W., Nagley P., Wong L.C., Ngan H.Y (2001), “ High incidence of somatic mitochondrial DNA mutations in human ovarian carcinomas”, Cancer... Staden R & Young I G (1981), “Sequence and organization of the human mitochondrial genome”, Nature, 290, pp.457-465 3 Bassam B J., Caetano-Anollés G and Gresshoff P M (1991), “Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels”, Anal Biochem, 196 (1), pp.80-83 4 Bianchi M., Bianchi N and Bailliet G (1995), “Mitochondrial DNA mutations in normal and tumor tissues from breast cancer patients”,...TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu ti ng Anh: 1 Alonso A, Martin P, Albarran C, Aquilera B, Garcia O, Guzman A, Oliva H, Sancho M (1997), “Detection of somatic mutations in the mitochondrial DNA control region of colorectal and gastric tumors by heteroduplex and single-strand conformation analysis”, Electrophoresis, 18, pp.682-685 2 Anderson S., Bankier A T.,... Ojala D., Attardi G (1981), “Distinctive features of the 5'terminal sequences of the human mitochondrial mRNAs”, Nature, 290 (5806), pp.465-70 21 Parrella P., Xiao Y., Fliss M., Sanchez-Cespedes M., Mazzarelli P., Rinaldi M., Nicol T., Gabrielson E., Cuomo C., Cohen D., Pandit S., Spencer M., C Rabitti., Fazio VM., Sidransky D (2001), “Detection of mitochondrial DNA mutations in primary breast cancer... Jacotot E Costantini P., Loeffler M., Larochette N., Goodlett D.R., Aebersold R., Siderovski D.P., Penninger J.M., Kroemer G (1999), “Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor” Nature, 397, pp.441-446 27 Staniek K., Gille L., Kozlov A.V., Nohl H (2002), “Mitochondrial superoxide radical formation is controlled by electron bifurcation to the high and low potential pathways”... Res, 36, pp.381- 387 28 Taanman J.W., Street R H., and L Nw (1999), “The mitochondrial genome : structure, transcription, translation and replication”, Biochim Biophys Acta, 1410 (2), pp.103-123 29 Tan D.J., Bai R.K., Wong L.J (2002), “Comprehensive scanning of somatic mitochondrial DNA mutations in breast cancer”, Cancer Res, 62, pp.972976 30 Thyagarajan B., Wang R., Nelson H., Barcelo H., Koh W and... V.W., Xue W.C., Cheung A.N., Ngan H.Y (2006), “Association of decreased mitochondrial DNA content with ovarian cancer progression”, Br J Cancer, 95, pp.1087-91 32 William L.D., John S.S (2002) “Cancer of the breast”, Elsevier Health Sciences, pp.169-179 33 Wu C.W., Yin P.H., Hung W.Y., Li A.F., Li S.H., Chi C.W., et al (2005), “Mitochondrial DNA mutations and mitochondrial DNA depletion in gastric cancer”,... (1996) , "Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c", Cell , 86, pp.147-157 18 Marchington D.R., Macaulay V., Hartshorne G.M., Barlow D & Poulton J (1998), “Evidence from human oocytes for a genetic bottleneck in an mtDNA disease”, Am J Hum Genet, 63, pp.769–775 19 Modica-Napolitano J.S., Singh K.K (2002), “Mitochondria as targets for detection and treatment... S.L., Boxer G., Malcolm A.D (1990), “In situ and slot hybridization analysis of RNA in colorectal tumours and normal colon shows distinct distributions of mitochondrial sequences”, J Pathol, 162, pp.309-315 7 Dimauro S (2007), “Mitochondrial DNA medicin”, Biosci Rep, 27 (1–3), pp.5-9 8 DiMauro S and Schon E (2001), “Mitochondrial DNA mutations in human disease”, Am J Med Genet, 106, pp.18-26 9 Hileman... Markowitz S.D., Trush M.A., Kinzler K.W., Vogelstein B (1998), “Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours”, Nat Genet, 20, pp.291293 24 Sharp M.G., Adams S.M, Walker R.A., Brammar W.J., Varley J.M (1992) “Differential expression of the mitochondrial gene cytochrome oxidase II in benign and malignant breast tissue” J Pathol, 168, pp.163-168 25 Shuster R.C., Rubenstein A.J