THƠNG TIN NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI VỀ HỌC THUẬT, LÝ LUẬN CỦA LUẬN ÁN Tên luận án: “ Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng mỹ phẩm” Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất Mã số: 62 72 04 10 Họ tên nghiên cứu sinh: Lê Thị Hường Hoa Khóa: 2010-2013 Họ tên cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu TS Đoàn Cao Sơn Cơ sở đào tạo: Trường đại học Dược Hà nội Tóm tắt đóng góp luận án Về xây dựng thẩm định qui trình phân tích - Đã xây dựng quy trình phân tích HPLC quy trình phân tích AAS, có quy trình phân tích đồng thời quy trình phân tích chất riêng biệt, cụ thể đóng góp quy trình phân tích sau: 1.1 Quy trình phân tích đồng thời chất màu cấm son mơi Về điều kiện phân tích sắc ký: Đây qui trình phân tích dựa qui trình phân tích đồng thời ASEAN Phương pháp ACM SIN 02 ASEAN để phát chất màu cấm: MY, PO, RB sử dụng pha động: nước- dd TBA 0,005M (25 : 75) Thực nghiệm cho thấy: Pha động có tủa lại kể sau lọc Thời gian để tủa trước lọc không nêu rõ, nêu “để yên vài giờ” mà thực tế để ngày cịn tủa lại Vì nghiên cứu cụ thể thời gian, cách thức để pha động tủa hoàn toàn (để lạnh 14-15 oC 72 để yên nhiệt độ phòng ngày) lọc trước đưa vào hệ thống sắc ký, đảm bảo ổn định toàn hệ thống q trình sắc ký khơng hại cột Đã đưa thêm Pigment red 53 phân tích đồng thời với chất màu MY, PO RB Về đánh giá qui trình: Qui trình đánh giá đầy đủ tiêu độ thích hợp hệ thống (các pic cân đối, tách rời hoàn toàn với Rs nhỏ 2,2, số đĩa lý thuyết thấp 2592) Kết qui trình phân tích có độ lặp lại tốt cho chất màu cấm (RSD thời gian lưu nhỏ 1%, RSD diện tích pic nhỏ 2%), độ cao (tỷ lệ thu hồi từ 94,0% đến 101,5%) LOD LOQ thấp ASEAN nhiều lần (MY 100 lần, RB 200 lần; PO 2000 lần PR 0,003 µg/ml: Khơng có chất quy trình ASEAN) nên phương pháp có độ nhạy tốt Qui trình vừa để định tính (phát hiện) thơng qua số: độ tinh khiết píc, so sánh thời gian lưu chồng phổ píc nghi ngờ với píc chất chuẩn Qui trình định lượng cách so sánh diện tích píc píc thu từ mẫu thử với píc thu từ mẫu chuẩn Đây lợi lớn phân tích, ngồi việc phát đánh giá mức độ lạm dụng nguy hiểm, thể thành công việc triển khai cải tiến qui trình sẵn có ASEAN 1.2 Quy trình phát hiện, định lượng đồng thời chất Sudan Về xử lý mẫu điều kiện sắc ký: Sau khảo sát số dung mơi hồ tan mẫu, hỗn hợp methanol – ethyl acetat (1:1) lựa chọn Hệ dung môi methanol - ethyl acetat (1:1) hệ mà nhóm chất Sudan tan tốt, dung dịch mẫu thử không bị lẫn nhiều tạp chất, qui trình chiết đơn giản, dễ dàng Hệ dung mơi có ethyl acetat nên khơng cần dùng chất THF để phân tán mẫu son dạng sáp hay sơn móng Đây dung mơi mà tác giả Nguyễn Văn Yên cộng [46] nghiên cứu năm sau dùng lại (năm 2010) để hòa tan sudan cắn thu sau chiết mẫu mỹ phẩm thực phẩm aceton Qui trình phân tích đồng thời chất Sudan với điều kiện phân tích đơn giản, dễ thực hiện, dung mơi hóa chất dễ kiếm lợi cho người làm phân tích, dễ dàng áp dụng đơn vị có máy HPLC với detector PDA Điều kiện phân tích bao gồm: cột C18 (250 x 4,6 mm, µm) (Phenomenex Apollo), pha động: methanol - nước (95:5), tốc độ dịng: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm: 20 µl, điều kiện detector PDA: quét phổ dải 300-900 nm, lấy sắc đồ 488 nm Về đánh giá quy trình phân tích: - Quy trình phân tích thẩm định chặt chẽ cho kết tốt độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, LOD, LOQ độ ổn định dung dịch chất màu Sudan - Có giới hạn phát thấp: Sudan I 0,23 µg/ml, Sudan II 0,24 µg/ml, Sudan III 0,25 µg/ml, Sudan IV 0,24 µg/ml cho phép phát chất bị cấm son, sơn móng, phấn trang điểm nồng độ nhỏ (ppm) 1.3 Quy trình phát đồng thời 12 chất steroid kem bơi da Về qui trình xử lý mẫu điều kiện sắc ký: Phương pháp hòa hợp ASEAN, mã số ACM/MAL 07 để định tính chất thuộc nhóm steroid dùng methanol làm dung môi chiết chất phân tích từ mẫu kem bơi da Tuy nhiên, qua khảo sát số chất thuộc 12 steroid nghiên cứu cho pic không cân đối, số mẫu có nhiều tạp phân tích sắc ký Vì vậy, chọn hỗn hợp dung môi dicloromethan-methanol (9 : 1) để chiết mẫu phối hợp làm nóng cách thủy Tiếp theo, thay ly tâm, hỗn hợp để lạnh nước đá để tủa tá dược, lọc bốc cách thủy tới cắn hòa tan cắn acetonitril - methanol - nước (20 : 30 : 30), lọc Với cách xử lý mẫu này, pic thu cân đối, mẫu phân tích (hầu khơng thấy xuất píc phụ) Giữ nguyên điều kiện cột sắc ký ASEAN (ODS 250 x 4,6 mm, 5µm) Pha động ACN - nước (48:52) chế độ đẳng dịng thay cho gradient dung mơi phương pháp ASEAN Nghiên cứu bổ sung thêm chất khác thuộc nhóm glucocorticoid, xây dựng qui trình định tính đồng thời 12 chất steroid có bao gồm chất phương pháp ASEAN Về đánh giá qui trình phân tích: Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống (độ lặp lại thời gian lưu, diện tích pic, hệ số phân giải R s, số đĩa lý thuyết), độ đặc hiệu độ ổn định dung dịch đảm bảo yêu cầu để phân tích phát đồng thời chất mỹ phẩm dạng kem bôi da Thực tế cho thấy để định tính đồng thời 12 chất thuộc nhóm steroid, điều kiện thiết bị, cột sắc ký, pha động (đặc biệt tỷ lệ thành phần pha động) phải ổn định số pic rửa giải gần Qui trình phân tích chạy đẳng dịng đơn giản áp dụng máy phân tích có bơm, kênh dung mơi 1.4 Về qui trình định tính, định lượng Hydroquinon Về xử lý mẫu điều kiện sắc ký: Khảo sát số dung mơi hồ tan mẫu cho thấy hỗn hợp methanol - đệm phosphat pH 5,5 (50 : 50) dung môi tốt để chiết mẫu, dung dịch mẫu thử không bị lẫn nhiều tạp chất cho pic Hydroquinon cân đối Hơn nữa, pha động chương trình sắc ký để phân tích Hydroquinon khảo sát lựa chọn Phương pháp hòa hợp ACM INO 03 dùng ethanol 96% để chiết mẫu Áp dụng điều kiện sắc ký phương pháp ACM INO 03 đưa với số đối tượng mẫu thực tế, kết thu chưa đáp ứng yêu cầu cho việc phát chọn lọc Hydroquinon pic chất không tách khỏi píc chất chưa biết có sẵn mẫu Thực tế cho thấy, pha động phương pháp ASEAN có ACN nước (45 : 55) nên khả rửa giải, phân tách chất hạn chế kể thay đổi tỷ lệ khác dung môi Thay pha động hỗn hợp acetonitril dung dịch đệm phosphat pH 5,5 (50 : 50) giải yêu cầu Sự có mặt dung dịch đệm làm thay đổi rõ rệt tính phân cực pha động, tương tác chất phân tích với pha động, kết píc Hydroquinon tách hồn tồn khỏi píc có mẫu kem mỹ phẩm Tuy nhiên, với mẫu kem đơn giản, áp dụng quy trình phân tích ASEAN cho kết tốt, thời gian phân tích nhanh Thực tế, Khoa Mỹ phẩm (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương) thu kết tốt chương trình thử nghiệm thành thạo phép thử “Xác định hàm lượng Hydroquinon kem bơi da” theo quy trình phân tích ASEAN quy trình phân tích mẫu chương trình gửi tới Về đánh giá qui trình phân tích: Những kết thẩm định độ đặc hiệu cao, độ lặp lại, độ tốt, LOD LOQ (thấp so với phương pháp ASEAN) cho thấy quy trình xây dựng thích hợp cho việc phát hiện, định lượng Hydroquinon đối tượng mỹ phẩm dạng kem bôi da mẫu có chất rửa giải gần với Hydroquinon mà dùng chương trình sắc ký phương pháp hịa hợp ASEAN khơng tách hồn tồn 1.5 Về quy trình phân tích chất màu riêng biệt lại Về xử lý mẫu: Lựa chọn dung mơi chiết mẫu: có MY PO dùng hỗn hợp dung môi chiết giống phương pháp ASEAN (Dimethylformamid - acid phosphoric (95:5)) Các chất màu lại phải khảo sát thực nghiệm để lựa chọn Cụ thể với chất màu sau: RB ACN - nước (1:1), PR dimethylsulfoxid, CV ACN - THF - dd đệm amoniac pH 9,5 -10,0 (2 : : 5) Các dung môi chọn lựa hịa tan tốt chất cần phân tích, dịch chiết mẫu thử sạch, pic thu cân đối Với mẫu son thỏi, sơn móng (dạng sáp, thể chất quánh), dùng lượng nhỏ tetrahydrofuran hay dimethylformamid để phân tán mẫu chiết thay cho chiết pha lỏng - lỏng (n-hexan dung môi chiết mẫu ASEAN) cho kết tương ứng cách làm đơn giản nhanh (vì khơng cần chuyển vào bình gạn chờ phân lớp) Về điều kiện sắc ký: Các qui trình để phân tích riêng MY, PO, PR dùng loại cột sắc ký C18, thành phần pha động hỗn hợp methanol - dd đệm pH 6,2, khác tỷ lệ thành phần pha động bước sóng lấy sắc ký đồ Đây thuận lợi thực tế thay đổi nhỏ phân tích chất màu với cột sắc ký thông dụng, dung môi dễ kiếm, cách chuẩn bị pha động đơn giản Tương tự, thay đổi bước sóng phân tích phân tích chất RB (550nm) CV (590nm) với pha động hỗn hợp: ACN – THF - dd đệm pH 9,0 (2 : : 5) cột C18 1.6 Quy trình phân tích thủy ngân mỹ phẩm dạng kem phấn bôi da Với mẫu phấn bôi da, khảo sát lựa chọn hỗn hợp acid sulfuric acid nitric tỷ lệ 1:1, vơ hóa triệt để mẫu phấn có chứa nhiều ngun liệu từ khống vật Bên cạnh đó, cụ thể hóa thơng số thiết bị vơ hóa mẫu vi sóng, bổ sung thêm giai đoạn xử lý mẫu (giai đoạn thêm dung dịch KMnO4) để phù hợp với điều kiện thiết bị đơn vị nghiên cứu Quy trình phân tích thủy ngân phương pháp hịa hợp xây dựng cho thiết bị đo dòng liên tục (khơng sẵn có điều kiện sở nghiên cứu), tiến hành khảo sát, thiết lập quy trình phân tích phù hợp với thiết bị đo gián đoạn tổng lượng thủy ngân cho đối tượng kem phấn bôi da Kết thẩm định quy trình sau xây dựng cho thấy quy trình thiết lập đảm bảo độ đặc hiệu, độ đúng, độ lặp lại, có khoảng tuyến tính phù hợp với đối tượng áp dụng, đồng thời có giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng hoàn toàn đáp ứng yêu cầu phương pháp ASEAN yêu cầu quản lý qui định Thông tư 06/2011/TT-BYT ngày 25/1/2011 Bộ Y tế Việt Nam (Giới hạn thủy ngân mẫu mỹ phẩm cho phép ≤ ppm, phương pháp xây dựng có giới hạn phát 30 ng, giới hạn định lượng 100 ng thủy ngân mẫu phân tích tương ứng với 0,15 ppm 0,5 ppm mẫu mỹ phẩm) Về thẩm định chuyển giao phương pháp - Đã thẩm định chuyển giao thành công phương pháp hòa hợp ASEAN để phát định lượng chì, arsen Tretinoin Kết đưa thơng số phân tích cụ thể điều kiện xử lý mẫu, thông số thiết bị phân tích Kết phương pháp hịa hợp hồn tồn phù hợp triển khai Việt Nam với trang thiết bị sẵn có cán đào tạo phương pháp phân tích HPLC quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS - Đã có 11/13 quy trình phân tích phê duyệt áp dụng thực tế để kiểm tra chất cấm cách kịp thời, phục vụ cho công tác quản lý chất lượng mỹ phẩm, quy trình chờ phê duyệt Về kiểm tra, đánh giá nhiễm chất bị cấm mỹ phẩm - Đã áp dụng quy trình xây dựng được, quy trình đánh giá chuyển giao để kiểm tra 12 chất nhóm chất tương ứng 230 lượt mẫu mỹ phẩm, phát thấy khoảng 13% số mẫu mỹ phẩm bị nhiễm chất cấm hay có hàm lượng vượt giới hạn cho phép: Metanil yellow, Rhodamin B, Pigment red 53, Crystal violet, Sudan, thủy ngân, Tretinoin, số corticoid Đặc biệt có mẫu kem mỹ phẩm có chứa thủy ngân tới 30 ppm Pigment red 53 nhiều giới hạn cho phép nhiều lần Về báo khoa học - Đã viết đăng 09 báo khoa học tạp chí chuyên ngành: Tạp chí Kiểm nghiệm Thuốc, tạp chí Dược học, tạp chí Dược Thông tin thuốc Về đào tạo chuyên môn kỹ thuật - Đã cung cấp tài liệu triển khai đào tạo số kỹ thuật kiểm tra phát chất bị cấm sử dụng cho hệ thống kiểm nghiệm kiểm tra chất lượng mỹ phẩm Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2013 HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Thái Nguyễn Hùng Thu TS Đoàn Cao Sơn NGHIÊN CỨU SINH Ths Lê Thị Hường Hoa ... yêu cầu phương pháp ASEAN yêu cầu quản lý qui định Thông tư 06/2011/TT-BYT ngày 25/1/2011 Bộ Y tế Việt Nam (Giới hạn thủy ngân mẫu mỹ phẩm cho phép ≤ ppm, phương pháp xây dựng có giới hạn phát 30... kiện xử lý mẫu, thơng số thiết bị phân tích Kết phương pháp hòa hợp hoàn toàn phù hợp triển khai Việt Nam với trang thiết bị sẵn có cán đào tạo phương pháp phân tích HPLC quang phổ hấp thụ nguyên