Nghiên cứu đa dạng sinh học vùng gen s của virus viêm gan b tại một số vùng ở việt nam

Hiện nay có khoảng 2 tỷ người nhiễm virus viêm gan B trên toàn Thế giới, trong đó có khoảng 6% nhiễm viêm gan B cấp và 5 - 10% trong số đó chuyển sang mạn tính ở người lớn, riêng đối với

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG SINH HỌC VÙNG GEN S CỦA VIRUS

VIÊM GAN B TẠI MỘT SỐ VÙNG Ở VIÊT NAM

HÀ NỘI - 2016

Người hướng dẫn: TS Dương Tuấn Linh

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đức Hiếu

Lớp: 1202

LỜI CÁM ƠN

Trong suốt quá trình làm việc và nghiên cứu tại Khoa Vi sinh vật, Viện

Y học Dự phòng Quân đội và Phòng Độc học, Viện Y sinh Nhiệt đới, Trung Tâm Nhiệt đới Việt - Nga, tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm và giúp đỡ của các anh chị, thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước hết em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn thể thầy cô giáo trong khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã trang

bị cho em kiến thức và kĩ năng để em có thể hoàn thành khóa luận này

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn chân thành đến TS Dương Tuấn Linh – Viện Y học Dự phòng Quân Đội đã giúp đỡ tận tình và hướng dẫn em những kiến thức và phương pháp nghiên cứu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, các anh chị và các bạn, những người luôn động viên và giúp đỡ tạo điều kiện vật chất cũng như tinh thần giúp em hoàn thành khóa luận

Trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài bản thân em còn có nhiều thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp, phê bình của quý thầy

cô và anh chị trong lĩnh vực nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT I DANH MỤC HÌNH II DANH MỤC BIỂU ĐỒ III

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình nhiễm bệnh viêm gan B 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Tại Viêt Nam 5

1.2 Một số đặc điểm sinh học của virus viêm gan B 7

1.2.1 Phân loại virus viêm gan B 7

1.2.2 Cấu trúc phân tử và hệ gen di truyền của virus viêm gan B 8

1.2.3 Protein cấu trúc của virus viêm gan B 10

1.2.4 Các kháng thể trong huyết thanh sau khi nhiễm viêm gan B 13

1.2.5 Vai trò của kiểu gen viêm gan B 14

1.3 Dự phòng virus viêm gan B 15

1.3.1 Phòng chủ động 15

1.3.2 Phòng lây truyền từ mẹ sang con 15

1.3.3 Phòng không đặc hiệu 16

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng 17

2.1.1 Chọn mẫu 17

2.2.2 Bảo quản mẫu 17

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 17

2.2 Vật liệu 18

2.2.1 Thiết bị và dụng cụ phòng thí nhiệm 18

2.2.1.1 Thiết bị 18

2.2.1.2 Dụng cụ 19

2.2.2 Hóa chất sử dụng 19

2.3 Các phương pháp sử dụng 20

2.3.1 Tách DNA từ mẫu HBsAg dương tính 20

2.3.2 Phương pháp PCR 23

2.3.3 Phương pháp điện di (Điện di agarose) 25

2.3.4 Phương pháp tinh sạch DNA (sản phẩm PCR-DNA) 27

2.3.5 Phương pháp giải trình tự gen Sanger 28

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 29

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Tổng số mẫu đã phân lập và xử lý 30

3.2 Tỉ lệ nhiễm HBsAg theo vùng địa lý 31

3.3 Tỉ lệ nhiễm HBV theo độ tuổi 32

3.4 Tỉ lệ nhiễm HBV theo giới tính 34

3.5 Tỉ lệ phát hiện HBV - DNA bằng kĩ thuật PCR trong số mẫu HBsAg dương tính 35

3.6 Phân tích cây phả hệ di truyền vùng gen S của HBV 36

KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

dsDNA-RT virus Double trands DNA reverse transcriptase

cccDNA Covalently closed circular DNA

ORFs Overlapping open reading frames

HBsAg Hepatitis B surface Antigen

pHSA Polymerized Human Serum Albumin

HBcAg Hepatitis B core antigen

HBeAg Hepatitis B evolope Antigen

PCR Polymerase Chain Reaction

ddNTPs Dideoxynucleotide

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Tỉ lệ nhiễm viêm gan B hàng năm nếu không tiêm vắc xin tại Việt Nam 6 Hình 2: Cấu tạo bộ gen HBV 9 Hình 3: Cấu trúc phân tử của kháng nguyên bề mặt (HBsAg) 11 Hình 4: Ảnh điện di, kết quả PCR sử dụng cặp mồi FA3 chạy trên gel

Agarose 1% ở điều kiện 120V - 30P 36

Hình 5: Cây sơ đồ phả hệ di truyền trình tự acid nucleic vùng gen S của các

chủng HBV được thu thập được từ mẫu huyết thanh HBsAg dương tính tại

4 tỉnh Hòa Bình, Quảng Trị, Kontum và Tp Hồ Chí Minh 38

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1: Số lượng mẫu thu thập phân bố theo giới tính và nhóm tuổi 30 Biểu đồ 2: Tỉ lệ nhiễm HBsAg dương tính ở 4 tỉnh và tỉ lệ chung ở cả 4 tỉnh nghiên cứu 31 Biểu đồ 3: Tỉ lệ nhiễm HBsAg dương tính theo độ tuổi 33 Biểu đồ 4: Tỉ lệ nhiễm HBV dương tính theo giới tính 34 Biểu đồ 5: Tỉ lệ phát hiện HBV - DNA bằng kĩ thuật PCR trong số mẫu HBsAg dương tính 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan do virus B (Hepatitis B Virus - HBV) là một bệnh phổ biến trên toàn cầu, có diễn biến phức tạp, tỉ lệ chuyển sang mạn tính rất cao, thường dẫn tới sơ gan và ung thư gan Hiện nay có khoảng 2 tỷ người nhiễm virus viêm gan B trên toàn Thế giới, trong đó có khoảng 6% nhiễm viêm gan B cấp và 5 - 10% trong số đó chuyển sang mạn tính ở người lớn, riêng đối với trẻ em tỷ lệ này lên đến 90% Tỷ lệ tử vong giai đoạn cấp tính

là 1%, biến chứng của viên gan B cấp là viên gan mạn, xơ gan và ung thư gan nguyên phát, dẫn đến tử vong vào khoảng một triệu người mỗi năm (theo Tổ chức Y tế Thế giới WHO; 1994) Một số kết quả điều tra cho thấy các nước Đông Nam Á, Trung Quốc và Châu Phi là những nơi có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất trên thế giới (GLOBEDR VN; 4/12/2015)

Việt Nam nằm trong vùng có nguy cơ cao về nhiễm HBV và là một trong những nước có tỷ lệ lưu hành cao trên thế giới Tại Việt Nam có khoảng 15% - 20% người nhiễm HBV trong đó xơ gan và ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV chiếm 80 - 92% (theo WHO; 5/2007) Trước đây, HBV được phân ra làm 4 kiểu huyết thanh (Serotypes): adr, adw, ayr,

và ayw dựa trên việc xác định các kiểu kháng nguyên của kháng nguyên bề mặt của HBV, các kiểu huyết thanh này có thể phân loại thêm ra 9 kiểu phụ (Subtypes) là ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+, và adrq- Nghiên cứu dịch tễ cho thấy các vùng địa lý trên thế giới có sự phân bố của các kiểu huyết thanh khác nhau Tuy nhiên, cho đến nay có rất ít dữ liệu về vai trò của kiểu huyết thanh HBV Những tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử và tin sinh học vào những năm cuối thế kỉ 20 đã giúp khám phá và phân tích sự đa dạng di truyền của HBV Gần đây, tám kiểu gen (genotype) của HBV đã được xác định (kí hiệu từ A đến H) dựa vào sự khác nhau trên 8% của toàn bộ trình tự chuỗi DNA của HBV Các kiểu gen HBV có vai trò rất quan trọng trong việc điều trị và theo dõi diễn biến của bệnh Đặc biệt,

những thông tin về sự phân bố kiểu gen theo vùng địa lý có ý nghĩa trong công tác quản lý và giám sát về mặt dịch tễ học phục vụ cho công tác phòng chống bệnh viêm gan do HBV

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa

dạng sinh học vùng gen S của virus viêm gan B (HBV) tại một số vùng

ở Việt Nam” từ đó đề xuất một số khuyến cáo giúp việc giám sát virus viêm gan B tại các địa điểm nghiên cứu

PHẦN 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nhiễm bệnh viêm gan B

1.1.1 Trên thế giới

Bệnh viêm gan B (Hepatitis B Virus - HBV) là một căn bệnh mang tính chất toàn cầu Tổ chức Y tế Thế giới (1994) cảnh bảo đối với tất cả các quốc gia trên toàn cầu về tác hại nghiêm trọng của bệnh viêm gan virus B đối với sức khỏe của toàn nhân loại, viêm gan virus B đã lây nhiễm cho 2

tỷ người, mỗi năm loại virus viêm gan B đã gây ra cái chết cho hơn 1 triệu người Đây là một loại đại dịch âm thầm, lặng lẽ, diễn biến hết thập kỷ này qua thập kỷ khác, gây ảnh hưởng nghiêm trọng không chỉ đối với sức khỏe

mà còn đối với đời sống xã hội của người dân trên Thế giới Tuy nhiên nhiều quốc gia, các nhà hoạch định chính sách vẫn chưa lưu tâm đúng mức

để có thể kiểm soát và phòng ngừa bệnh viêm gan virus, bên cạnh đó nhiều người dân vẫn chưa có nhận thức đầy đủ về mức độ nguy hiểm của bệnh viêm gan virus dẫn dến tử vong vì xơ gan hoặc ung thư gan, chưa biết được cách tự bảo vệ, cách tự chăm sóc và phòng tránh nhiễm bệnh Để huy động mọi quốc gia, mọi người trên toàn Thế giới cảnh giác và tăng cường phòng chống viêm gan virus, năm 2010 WHO quyết định lấy ngày 28/7 hàng năm

là ngày phòng chống viêm gan virus toàn Thế giới

Mức độ nhiễm viêm gan B được chia thành 3 vùng mức độ khác nhau (Anna S.F Lok và Brian McMahon; 2007)

*Mức độ lưu hành cao (là những vùng có tỉ lệ người nhiễm viêm gan

B rất cao, HBsAg dương tính > 8%) Gần 45% dân số thế giới nằm trong vùng này bao gồm hầu hết các nước thuộc khu vực Châu Á có cả Việt Nam (trừ Nhật Bản, Ấn độ), Châu Phi, hầu hết các nước Trung Đông, vùng lưu vực sông Amazon (Nam Mỹ), hầu hết các đảo thuộc khu vực Thái Bình Dương, và một số dân tộc sống ở Bắc Cực như Eskimo, Maoris Ở những

khu vực này nhiễm HBV xảy ra từ rất sớm, ngay từ khi mới sinh và trẻ nhỏ Phương thức lây truyền chính là từ mẹ sang con (nhiễm trong thời kỳ chu sinh hay còn gọi là lây truyền dọc) hoặc lây truyền ngang trong lứa tuổi nhỏ Vì nhiễm trùng ở trẻ nhỏ thường là không phát hiện triệu chứng, do đó

tỷ lệ người mang virus và mắc các bệnh liên quan đến nhiễm virus viêm gan B như viêm gan mạn tính, ung thư gan, xơ gan trong cộng đồng này rất cao Ngoài ra, tiêm chích ma tuý, quan hệ tình dục bừa bãi cũng đóng vai trò quan trọng làm tăng tỷ lệ nhiễm HBV trong cộng đồng

*Mức độ trung bình (chính là tỷ lệ số người nhiễm virus viêm gan B nằm trong vùng có tỷ lệ lưu hành viêm gan B thấp hơn các nước trong khu vực, HBsAg dương tính 2 - 7%) 43% dân số Thế giới nằm trong vùng này bao gồm Ấn Độ, một phần Trung Đông, Tây Á, Nhật Bản, Nga, Đông Âu, hầu hết các nước Nam và Trung Mỹ Phương thức lây truyền tại đây rất đa dạng, xảy ra ở tất cả các lứa tuổi từ trẻ sơ sinh đến người lớn Trường hợp nhiễm virus viêm gan B cấp tính phần lớn xảy ra ở lứa tuổi thanh niên và người lớn tuổi Đối tượng nhiễm virus viêm gan B trong thời kỳ chu sinh sẽ trở thành người mang virus mạn tính có nguy cơ lây lan cao trong cộng đồng

* Mức độ lưu hành thấp (< 2%): Vùng nay bao gồm các nước như Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc, NewZealnd, và Nam Mỹ Phương thức lây truyền chính là lây truyền ngang ở lứa tuổi trưởng thành Đối tượng có nguy cơ cao thường gặp là những người tiêm chích ma tuý, đồng tính luyến ái, nhân viên y tế, người được truyền máu hoặc lây nhiễm trong gia đình người nhiễm virus viêm gan B

Nói một cách tổng quát, tỷ lệ bệnh viêm gan B vẫn cao nhất ở các nước kém phát triển với một hệ thống y tế thô sơ Nước càng nghèo, càng chậm tiến, con số bệnh nhân viêm gan B càng cao Trong khi Trung Quốc

có tỷ lệ viêm gan B là 12,2%, Nhật Bản với nền kinh tế phồn thịnh hơn chỉ

Mozambique, Uganda, Zambia v.v., tỷ lệ bệnh viêm gan B cũng chỉ khoảng

12 đến 14% mà thôi Với tỷ lệ 0,8%, nghĩa là khoảng 1,25 triệu bệnh nhân, Hoa Kỳ là một trong những quốc gia có tỷ lệ viêm gan B thấp nhất thế giới (theo Hội Ung thư Việt Mĩ; 2014)

1.1.2 Tại Viêt Nam

Việt Nam là 1 trong 9 quốc gia vùng tây Thái Bình Dương đang phải đối mặt với đại dịch viêm gan virus vì tỷ lệ nhiễm virus cao, khoảng 25% dân số Việt Nam nhiễm HBV (Blumberg và cộng sự, 2012) Theo một trong những thống kê mới nhất thì tỷ lệ người mang bệnh đã giảm xuống khoảng 17% (theo Hội Ung thư Việt Mĩ; năm 2012) Tuy trong những năm vừa qua, khi tiêm phòng vắc xin phòng bệnh viêm gan B tại Việt Nam được ứng dụng một cách quy mô hơn, con số bệnh nhân bị bệnh viêm gan

B, chỉ thuyên giảm một cách chậm chạp Trong quá trình điều tra cộng đồng trong khoảng 1350 người dân đang sinh sống tại Thanh Hóa, tỉ lệ HBsAg ở các nhóm tuổi khác nhau là: khoảng 12,5% bé sơ sinh (từ 9 đến

18 tháng), 18,4% trẻ em (từ 4 đến 6 tuổi), 20,5% thanh niên (từ 14 đến 16 tuổi) và 18,8% người trưởng thành (từ 25 đến 40 tuổi) đang bị nhiễm viêm gan B, và có khoảng 15 - 25% bệnh nhân viêm gan B mạn tính dẫn đến ung thư gan và xơ gan (Hipgrave và cộng sự; 2003) Ðây là một con số rất đáng ngại cho một nước xấp xỉ 100 triệu dân

Ước tính số trẻ có khả năng nhiễm viêm gan B mạn tính nếu không tiêm vắc xin viêm gan B hàng năm tại Việt Nam như hình 1 (Phan Trọng

Lân và cộng sự; cập nhật 20/4/2015):

Hình 1: Tỉ lệ nhiễm viêm gan B hàng năm nếu không tiêm vắc xin

tại Việt Nam (2015)

Tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B từ 15% - 20% dân số, nhiễm virus viêm gan C từ 2% - 6% (Trần Đắc Phu và cộng sự; 2015) Nhiều trường hợp tử vong ở các nước châu Á, trong đó có Việt Nam nguyên nhân do xơ gan và ung thư gan có liên quan đến viêm gan B và C Tổ chức Y tế Thế giới khẳng định viêm gan B có thể kiểm soát một cách hiệu quả thông qua tiêm chủng vắc xin WHO khuyến cáo gia đình cần cho trẻ sơ sinh tiêm liều vắc xin viêm gan B đầu tiên càng sớm càng tốt sau khi sinh (trong vòng 24 giờ đầu) Việc tiêm vắc xin thực hiện càng sớm thì hiệu quả càng cao, với mũi tiêm trong 24 giờ có khả năng phòng được 85 - 90% các trường hợp lây truyền từ mẹ sang con Hiệu quả phòng ngừa sẽ giảm dần theo từng ngày từ

50 - 57% và không đạt được nếu tiêm sau 7 ngày Kể từ khi đưa vắc xin này vào sử dụng năm 2002, Việt Nam đã đạt được những tiến bộ lớn trong

công cuộc phòng chống bệnh viêm gan B, đã đưa tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B có HBsAg dương tính ở nhóm trẻ dưới 5 tuổi xuống dưới 2% vào năm 2014 và tiếp tục hướng tới mục tiêu giảm xuống dưới 1% vào năm

2017 (Đoàn Anh Tuấn; 2015)

1.2 Một số đặc điểm sinh học của virus viêm gan B

1.2.1 Phân loại virus viêm gan B

Nhóm: Nhóm VII: virus sợi kép, sao chép phiên mã ngược

(dsDNA-RT virus - Double trands DNA reverse transcriptase)

Bộ (ordo): Chưa xác định

Họ (famillia): Hepadnaviridae

Chi (genus): Orthohepadnavirus

Loài (species): Hepatitis B virus

Có 2 cách phân loại HBV: theo kiểu huyết thanh (serotype) và theo kiểu gen (genotype)

Trước đây người ta phân HBV thành 4 kiểu huyết thanh adr, adw, ayr,

và ayw dựa trên việc xác định các kiểu kháng nguyên của kháng nguyên bề mặt virus B, các kiểu huyết thanh này có thể phân loại thêm ra 9 kiểu phụ (Subtypes) là ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+, và adrq- (Lieven Stuyver và cộng sự; 2000, Kramvis và cộng sự; 2005) Tuy nhiên những ý nghĩa của kiểu huyết thanh chưa được nghiên cứu nhiều Với sự phát triển của sinh học phân tử, ngày nay người ra phân loại HBV dựa trên nghiên cứu trên bộ gen của HBV và phân loại thành 8 kiểu gen được đặt tên từ A đến H dựa vào sự khác biệt 8% của toàn bộ gene HBV (Kidd - Liunggren và cộng sự, 2002; Kramvis và cộng sự, 2005; Norder và cộng

sự, 2004; Okamoto và cộng sự, 1988; Schaefer, 2005)

Sự phân bố kiểu gen dựa vào các vùng địa lý khác nhau

+ Kiểu gen A chủ yếu ở Mỹ, bắc và trung Âu

+ Kiểu gen B và C chủ yếu ở Châu Á

+ Kiểu gen D chủ yếu ở Nam Âu, Địa Trung Hải và Ấn Độ

+ Kiểu gen E chủ yếu ở Châu Phi đặc biệt ở vùng hạ Sahara

+ Kiểu gen F chủ yếu ở Nam Mĩ và Polynesia

+ Kiểu gen G chủ yếu ở Mỹ, châu Âu bao gồm các nước Pháp, Đức, Hà Lan

+ Kiểu gene H chủ yếu ở Nam và Trung Mỹ

1.2.2 Cấu trúc phân tử và hệ gen di truyền của virus viêm gan B

1.2.2.1 Cấu trúc phân tử

HBV Có 3 kiểu cấu trúc chính:

*Cấu trúc hình cầu và dạng hình ống: Dạng hình cầu có đường kính dao động từ 17 – 25 nm, dạng ống có đường kính khoảng 22 nm với chiều dài thay đổi Có chứa các kháng nguyên bề mặt nhưng có lõi không mang

hệ gen di truyền nên không có khả năng gây bệnh

*Cấu trúc hình hạt Dane hay còn gọi là hạt virus hoàn chỉnh có khả

năng lây nhiễm: Đường kính 42 nm, gồm 3 lớp là:

- Vỏ ngoài: Dày 7 nm, cấu tạo bởi 3 chuỗi polypeptide Chuỗi có kích thước bé nhất là kháng nguyên bề mặt HBsAg

- Vỏ capsid chứa 2 loại polypeptide: có cấu trúc đối xứng hình hộp, bao quanh lõi, chứa các enzim DNA - polymerase, proteinkinase

+ Chuỗi ngắn: Chứa kháng nguyên lõi của virus viêm gan B

(HBcAg)

+ Chuỗi dài: Chứa kháng nguyên E của virus HBV (HBeAg)

- Lõi: là DNA vòng và có một phần sợi kép Một sợi dài (L) gần như

khép kín có 3.200 nucleotide và một phần sợi ngắn (S) thay đổi từ 50 – 100% độ dài so với sợi dài Trọng lượng phân tử gần 2.106.000 Dalton

1.2.2.2 Hệ gen di truyền của virus viêm gan B

Với bộ gen chỉ gồm 3200 cặp base Khi xâm nhập vào cơ thể qua đường máu, HBV cởi bỏ lớp vỏ protein, HBV DNA đi vào nhân tế bào gan người, tạo nên các DNA vòng gắn chặt đồng hóa trị được gọi là cccDNA (Covalently closed circular DNA) Các cccDNA này gồm bốn đoạn khung đọc mở che phủ lẫn nhau ORFs (Overlapping open reading frames): Gen S,

Gen X, Gen C, Gen P

Hình 2: Cấu tạo bộ gen HBV (Phạm Thị Thủy, Hồ Tấn Đạt; 2005)

Bộ gen HBV là phân tử DNA dạng vòng, xoắn kép, chứa khoảng 3200 nucleotide, gồm 2 sợi đơn dài khác nhau được nối với nhau bằng liên kết Hydro:

- Chuỗi dài còn gọi là sợi âm tạo thành vòng tròn 3,2 kb, mã hóa tất cả thông tin di truyền

- Chuỗi ngắn còn gọi là sợi dương chiều dài thay đổi từ 50-100% chiều dài của bộ gen

Bộ gene có cấu trúc gồm 4 gen được xác định rõ:

Gen S: là nằm trong phần protein chính của vỏ, bao gồm vùng S,

preS1, preS2 , gen S mã hóa tổng hợp các kháng nguyên bề mặt HBsAg (s:

surface)

Gen C: mã hoá protein chính của lõi C hay kháng nguyên HBcAg và

một phần protein E của kháng nguyên HBeAg

Gen X: Mã hoá protein xuất hiện trong tế bào gan bị nhiễm HBV và

liên quan tới cơ chế gây ung thư, có vai trò quá trình nhân đôi của virus

Gen P: Hoạt động nhân đôi của HBV nhờ hoạt tính của enzyme

polymerase (Pol protein), đây là một protein lớn, phức tạp, và đa chức

năng Trên vùng gen P (Polymerase) được chia làm 4 vùng, mỗi vùng có

một chức năng riêng: Terminal protein, Spacer, RT domains và RNAase H

(Xem hình 2) Trong đó, vùng sao mã ngược (RT domains: Reverse

Transcription) chịu trách nhiệm cho việc tổng hợp enzyme RNA - dependent DNA và DNA - dependent DNA được chia ra thành 7 vùng đặt tên từ A – G (Xem hình 2) Vì vùng RT là đích tác động của thuốc Lamivudine nên những đột biến của vùng này trong quá trình phát triển tự nhiên của virus viêm gan B cũng như dưới tác động của thuốc điều trị sẽ dẫn tới vấn đề đột biến kháng thuốc

1.2.3 Protein cấu trúc của virus viêm gan B

*Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg - Hepatitis B surface

Antigen):

HBsAg là kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B Nó là dấu ấn miễn dịch quan trọng trong các nghiên cứu dịch tễ học để xác định yếu tố nguy cơ và phân loại HBV cũng như có vai trò quan trọng trong chẩn đoán viêm gan B cấp và mạn tính

Kháng nguyên HBsAg là thành phần của vỏ bọc lipoprotein của HBV giúp cho sự bám dính của virus vào tế bào gan

Cấu trúc phân tử của HBsAg gồm 3 loại protein là protein nhỏ (S), trung bình (M) và lớn (L), các protein này được sinh tổng hợp (dịch mã) từ

các mRNA pre-S1 và mRNA S2/S sao chép từ gen S của cccDNA, theo các

con đường khác nhau

Hình 3: Cấu trúc phân tử của kháng nguyên bề mặt (HBsAg) (Trần

Thị Khánh Tường; 2011)

Protein S (Small) có chiều dài 24 kD gồm 226 acid amin Protein này được mã hóa bởi vùng gen S gồm hai thành phần là p24 và Gp27 (Glycoprotein) đây là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số

Protein M (Medium) được tổng hợp nhờ đoạn S và Pre-S2 có chiều dài

33 kD gồm 281 acid amin Protein này gồm hai loại Glycoprotein là Gp33

và Gp36 Vùng Pre-S2 có vai trò giúp cho HBV bám dính và xâm nhập vào

trong tế bào gan nhờ nó liên kết với một loại albumin trùng hợp trong huyết thanh người, đồng thời trên tế bào gan cũng có các thụ thể gắp với albumin trùng hợp trong huyết thanh người pHSA (Polymerized Human Serum Albumin) Nếu trên tế bào gan thiếu các thụ thể này thì có thể làm cho tế

bào gan có khả năng đề kháng với sự nhiễm HBV (Qingrun Zhang; 2007)

Gen S, Pre-S1 và Pre-S2 tổng hợp protein L (Large) có chiều dài 39

kD gồm 2 loại p39 và Gp42 Chuỗi protein Pre-S1 có chiều dài thay đổi tùy theo từng phân typ khác nhau; đây là vùng chủ yếu mà các thụ thể trên bề mặt của tế bào gan sẽ liên kết với virus, giúp virus xâm nhập vào trong tế bào

Cả 3 loại protein này hiện diện với số lượng khác nhau trên bề mặt của

virion, trong đó protein S chiếm đa số Protein M chiếm 5 đến 10% và Protein L chiếm 20% trong vỏ bọc của hạt virus, protein bề mặt hay

HBsAg

Các quyết định kháng nguyên HBsAg:

Người ta phát hiện vùng S có ít nhất 5 quyết định kháng nguyên của

HBsAg Tùy theo sự phân bố của các quyết định kháng nguyên này mà người ta phân biệt ra các phân typ khác nhau Mỗi phân typ đều có chung phần quyết định kháng nguyên a và khác nhau tùy theo sự ghép cặp của các quyết định kháng nguyên d hoặc y ghép với w hoặc r để tạo nên các phân typ như adw, ayw, adr, ayr Chính vùng a có liên quan đến tính miễn dịch

vì nó quyết định cho sự tổng hợp kháng thể HBsAg

Ý nghĩa chẩn đoán và điều trị bệnh của HBsAg:

HBsAg dương tính: Khẳng định chắc chắn bệnh nhân nhiễm HBV HBsAg dương tính kéo dài trên 6 tháng thì khẳng định là nhiễm HBV mạn tính

Ở bệnh nhân viêm gan virus B cấp, HBsAg đạt cao nhất khi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện và mất đi sau 4 – 8 tuần, định lượng HBsAg nếu không giảm dưới 25% sau 4 – 6 tuần thì nhiều khả năng chuyển nhiễm HBV mạn tính HBsAg âm tính gặp trong giai đoạn điều trị HBsAg, hoặc dưới ngưỡng phát hiện hoặc trong các trường hợp đột biến trốn thoát (mutant escape) Ở bệnh nhân viêm gan virus B, nếu HBsAg chuyển sang

âm tính, thì có thể bệnh đang được điều trị thuyên giảm

*Kháng nguyên lõi của virus viêm gan B (HBcAg - Hepatitis B core antigen):

Đây là kháng nguyên chủ yếu của nucleocapside trong virus viêm gan

B HBcAg hiếm khi xuất hiện trong huyết thanh mà chủ yếu xuất hiện trong nhân tế bào gan Sự có mặt của HBcAg với hàm lượng cao chứng tỏ

có hoạt động sao chép của HBV trong viêm gan cấp Việc sinh tổng hợp protein lõi dài 185 acid amin được bắt đầu với một mã di truyền AUG ở đầu 5’ của RNA thông tin Hệ gen của HBV – DNA của hạt virus khi xâm nhập vào nhân tế bào bị nhiễm sẽ biến đổi thành một vòng khép kín đồng hoá trị có thể do một enzym sửa chữa DNA của tế bào; DNA này là khuôn cho mARN và sẽ được dịch mã cho protein lõi và protein polymerase

*Kháng nguyên E của virus viêm gan B (HBeAg - Hepatitis B evolope Antigen):

Kháng nguyên E của virus viêm gan B (HBeAg) được coi là một phần của kháng nguyên lõi, là một dạng protein virus do các tế bào HBV tiết ra HBeAg là kháng nguyên hoà tan, có mặt trong huyết tương ở các hình thái vật lý khác nhau và xuất hiện trong quá trình phân tách nucleocapside của

HBV in vitro HBeAg được xem như là dấu ấn biểu thị sự nhân lên của

HBV và liên quan đến tình trạng nhiễm và mức độ nặng của bệnh Thường một tuần hay một tháng sau khi nhiễm HBV thì HBsAg xuất hiện trong máu, tiếp theo là HBeAg và các kháng thể IgM, IgG Khi HBsAg biến mất thì kháng thể Anti - HBs mới xuất hiện

Trong suốt giai đoạn HBeAg dương tính, bệnh nhân bị nhiễm virus B có nguy cơ cao truyền nhiễm bệnh cho những người tiếp xúc với họ qua còn đường máu Trong viên gan B mãn tính, sự hiện diện của HBeAg chứng tỏ bệnh đã diễn biến tương đối lâu, nhất là có thể chuyển sang giai đoạn sơ gan và ung thư gan nguyên phát

1.2.4 Các kháng thể trong huyết thành sau khi nhiễm viêm gan B

* Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt (anti – HBs): xuất hiện sau 1 –

3 tháng kể từ khi HBV xâm nhập cơ thể, lúc này nồng độ kháng nguyên HBsAg giảm thậm trí dưới ngưỡng có thể phát hiện của một số bộ sinh phẩm chẩn đoán Điều này có ý nghĩa quan trọng trong quá trình phòng bệnh bằng vắc xin cho bệnh nhân chưa nhiễm HBV Vì vậy nguyên lý làm vắc xin viêm gan B là lấy HBsAg làm kháng nguyên

*Kháng thể kháng kháng nguyên lõi (anti – HBc): anti - HBc được sản sinh trong thời gian đầu của nhiễm trùng cấp tính và tiếp tục tồn tại trong nhiều năm, có thể là suốt đời Nếu anti - HBc có hàm lượng cao thì chứng

tỏ HBV đang phát triển, đang hoạt động và đang ở dạng viêm gan B cấp Anti - HBc không có giá trị bảo vệ cơ thể chống tái nhiễm HBV, không có vai trò điều hoà miễn dịch cũng như miễn dịch bệnh sinh Nó có tác dụng như một dấu hiệu chứng tỏ sự có mặt của HBcAg Xét nghiệm phát hiện anti - HBc có thể có giá trị trong quá trình nghiên cứu ở trẻ nhỏ và người lớn, vì nó là thử nghiệm đơn giản nhất để phát hiện người nhiễm HBV mà không được tiêm chủng Tiêm chủng bằng văc xin viêm gan không tạo ra đáp ứng anti - HBc Vì vậy sự có mặt của anti - HBc ở người đã được tiêm chủng có thể là do họ đã bị nhiễm HBV trước đó

*Kháng thể kháng kháng nguyên HBeAg (anti – HBe): Sự xuất hiện của anti - HBe cho thấy đây là dấu hiệu của sự lui bệnh và hàm lượng HBsAg sẽ giảm dần xuống Những người có kết quả xét nghiệm HBsAg dương tính mà có anti - HBe dương tính thì ít có khả năng lây truyền hơn những người có đồng thời HBsAg dương tính và HBeAg dương tính

1.2.5 Vai trò của kiểu gen viêm gan B

Vai trò của kiểu gen virus viêm gan B cho đến nay vẫn chưa được biết

rõ ràng Nhiều câu hỏi về vai trò của kiểu gen HBV đã được đặt ra và các nhà chuyên môn vẫn đang cố gắng để trả lời:

(1) Có hay không sự liên quan giữa kiểu gen HBV và khả năng nhân đôi

(2) Sự phân bố kiểu gen HBV theo các vùng địa lý có liên quan với dịch tễ nhiễm HBV

(3) Ảnh hưởng của kiểu gen HBV trong diễn tiến đến viêm gan B mạn tính (4) Khi nhiễm với một kiểu gen này thì có được bảo vệ khỏi nhiễm với kiểu gen khác không

Cho đến hiện nay, các nghiên cứu về kiểu gen HBV vẫn còn rải rác, số liệu không được nhiều cũng như các kết quả chưa được thống nhất hoàn toàn Kiểu gen HBV ở vùng Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam, chủ yếu

là kiểu gen B và C (Theo phân bố dịch tễ HBV toàn cầu của WHO; 1994)

Có nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên quan giữa kiểu gen HBV và các đột biến ở vùng Precore và Core Promoter: Kiểu gen B, C và D thường có

tỉ lệ đột biến nhiều hơn kiểu gen A (Phạm Thị Thu Thủy và Hồ Tấn Đạt; 2015) Về nồng độ HBeAg với kiểu gen HBV, các nghiên cứu trên bệnh nhân Châu Á cho thấy ở kiểu gen B có nồng độ HBeAg cao hơn so với kiểu gen C Mối quan hệ giữa kiểu gen virus viêm gan B và diễn tiến của bệnh cũng được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Rối loạn chức năng gan hình như ít gặp ở kiểu gen B so với kiểu gen C, và kiểu gen C thì thường gặp ở bệnh nhân xơ gan Vai trò của kiểu gen HBV và đáp ứng điều trị cũng được quan tâm Trong điều trị với Interferon, kiểu gen A có đáp ứng điều trị tốt nhất, kiểu gen B có đáp ứng điều trị tốt hơn kiểu gen C Đối với Lamivudine, kiểu gen B dễ phát triển kháng thuốc hơn (Phạm Thị Thu

Tiêm vắc xin viêm gan virus B cho các đối tượng chưa bị nhiễm HBV Cần xét nghiệm HBsAg và anti - HBs trước khi tiêm phòng vắc xin

Tiêm vắc xin viêm gan virus B cho nhân viên y tế

1.3.2 Phòng lây truyền từ mẹ sang con:

Nếu mẹ mang thai có HBsAg dương tính: Tiêm vắc xin viêm gan virus

B liều sau sinh cho trẻ theo chương trình tiêm chủng mở rộng và phối hợp với tiêm kháng thể kháng HBV cho trẻ Nên tiêm cùng thời điểm nhưng ở hai vị trí khác nhau Sau đó tiêm đầy đủ các liều vắc xin viêm gan virus B cho trẻ theo quy định của chương trình tiêm chủng mở rộng

Nếu mẹ mang thai có HBV - DNA > 106 bản sao/ml (200.000 IU/mL): Dùng thuốc kháng virus (Lamivudine hoặc Tenofovir) từ 3 tháng cuối của thai kỳ Xét nghiệm lại HBV DNA sau sinh 3 tháng để quyết định ngừng thuốc hoặc tiếp tục điều trị nếu mẹ đủ tiêu chuẩn điều trị Theo dõi sát người mẹ để phát hiện viêm gan bùng phát

1.3.3 Phòng không đặc hiệu:

Sàng lọc máu và chế phẩm máu

Không dùng chung kim tiêm và các dụng cụ xuyên chích qua da khác Tình dục an toàn

Tránh tiếp xúc với máu và các dịch tiết của bệnh nhân nhiễm HBV

Thực hiện phòng ngừa chuẩn giống các bệnh lây truyền qua đường máu

2.2.2 Bảo quản mẫu:

Những mẫu huyết thanh thu được từ các bệnh nhân viêm gan B được bảo quản dưới 48 giờ ở nhiệt độ 2- 8oC

Những mẫu huyết thanh thu được từ những bệnh nhân được bảo quản dài hạn ở nhiệt độ -20oC và -80oC

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu:

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu Viện Y sinh Nhiệt Đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga (Đường Nguyễn Văn Huyên, Cầu Giấy, Hà Nội)

Seri máy Hãng sản xuất

Máy PCR 22331 Hamburg 6325AN314502

6325AN014504

Eppendorf, Đức

Máy chạy Real

Time PCR

Rotor Gene Q R0612166 QIAGEN,

Đức Máy điện di

Máy chụp ảnh

gel

UV trandilluminator

TO12312-010 UVP,

Campridge

Mỹ

Máy li tâm lạnh Centrifuge 5415R 5426A1335700 Eppendorf,

Tủ mát 4oC CLG - 300 0903250 Hàn Quốc

Tủ lạnh âm

80oC

HAIER DW 40W380

-EN 55014 - 1 Haier Medical

and Laboratory

2.2.1.2 Dụng cụ:

- Dụng cụ thu mẫu: Găng tay, bông giòn, nhíp gắp, áo blue

- Dụng cụ dùng để phân tích và nghiên cứu: Ống nghiệm, ống

eppendoff, pipet eppendorf, đầu côn các loại,

2.2.2 Hóa chất sử dụng:

- Hóa chất sử dụng cho quá trình tách chiết DNA từ mẫu huyết thanh dương tính với HbsAg: (Sử dụng bộ Kit “DNA-Sorb-B” của Amplisens; REF K1-2-50-CE; REF K1-2-100-CE / VER 27.08.09 – 27.06.11)

+ Dung dịch đệm giải (Lysis buffer)

+ Chất hấp thụ (Universal Sorbent)

+ Dung dịch kết tủa 1 (Solution for precipitation)

+ Dung dịch rửa 2 (Washing solution 3)

+ Dung dịch rửa 3 (Washing solution 4)

+ Dung dịch đệm RNA (RNA buffer)

- Hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR: (sử dụng sinh phẩm tag 5X master mix của BIOLAB; code M0285s)

+ Dung dịch 5X Master Mix:

DNA Polymerase: 1,25 units Tris-HCl (pH = 8,8 ở nhiệt độ 25oC): 75 mM (NH4)2SO4 : 20 mM