Nghiên cứu thành phần hóa học của cây gắm

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ năm đầu thập niên 60 kỷ trước, xu ngành Dược giới sâu vào nghiên cứu thuốc từ cỏ Ngành dược Pháp nhiều nước công nghiệp khác Anh, Ý, Mỹ, Đức, Trung Quốc, Ấn Độ, Triều Tiên…đã đầu tư lớn cho nghiên cứu, chế biến sản xuất, phát triển thuốc từ dược liệu Ở Việt Nam vài thập kỷ qua, công tác nghiên cứu nguồn tài nguyên thuốc Nhà nước quan tâm đạo Với nguồn tài nguyên động thực vật đa dạng xếp thứ 16 tổng số 25 nước có đa dạng sinh học giới, việc nghiên cứu phát triển thuốc từ dược liệu nhiệm vụ chiến lược ngành dược Việt Nam Cây Gắm núi hay cịn gọi Dây gắm, dây Vương Tơn, dây sót, dây mấu loại dược liệu nhân dân dân tộc vùng núi phía bắc sử dụng nhiều thuốc trị xương khớp thuốc chữa bệnh ngày Y học cổ truyền dùng rễ thân dây gắm làm thuốc giảm đau, chữa phong tê thấp, sản hậu gầy mòn, giải chất độc (độc thức ăn, sơn ăn da, rắn cắn ) dùng làm thuốc chữa sốt sốt rét Rễ gắm cịn dùng chữa kinh nguyệt khơng Hiện nay, dây gắm biết đến tuyên truyền thần dược trị Gout, bệnh giới đại Được biết đến với nhiều công dụng Việt Nam chưa có đề tài nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học dây gắm Vì chúng tơi tiến hành đề tài: “Góp phần nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học Cây Gắm núi (Gnetum montanum Markgr, Gnetaceae)” với hai mục tiêu sau: Xác định số đặc điểm thực vật gắm Xác định nhóm hoạt chất gắm PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại Gắm núi có tên khoa học Gnetum montanum Markgr thuộc chi Dây gắm Gnetum Vị trí phân loại khoa học khái quát theo sơ đồ sau [1] Pinophyta Ngành Thông Gnetopsida Lớp Dây Gắm Gnetales Bộ Dây Gắm Gnetaceae Họ Dây Gắm Gnetum Chi Dây Gắm Gnetum montanum Markgr Loài Gắm núi 1.2 Đặc điểm ngành thông – Pinophyta Ngành thông xuất từ nguyên đại cổ sinh phát triển mạnh vào nguyên đại trung sinh, số loài lên tới 20.000 loài Ngày nay, số loài tuyệt chủng cịn khoảng 600 lồi Ở Việt Nam có 51 loài [1] Dạng sống gồm gỗ, bụi hay dây leo gỗ, khơng có cỏ Cơ quan sinh sản thường đơn tính, có cấu tạo nón khác với cấu tạo hoa, gồm bào tử xếp xoắn ốc xếp vịng trục ngắn có dạng nón Thụ phấn nhờ gió, nhờ trùng Lá nỗn mở khơng bao hạt, mang đến nhiều nỗn nách mép Hạt có phơi thẳng, mang đến nhiều mầm [1] 1.3 Đặc điểm lớp dây gắm – Gnetopsida Lớp dây gắm coi lớp trung gian ngành Thông ngành Ngọc lan với đặc trưng lỗ thủng hình đồng tiền mạch ngăn thủng hẳn thành mạch gỗ Phía ngồi nỗn có vẩy bao hoa chưa có vịi núm nhụy Lá bào tử nhỏ phân hóa thành nhị, trung đới bao phấn trông giống nhị ngành Ngọc lan Phơi có mầm [1] Lớp Dây gắm có bộ, có họ chi: - Bộ Ma hoàng – Ephedrales - Bộ Dây gắm – Gnetales - Bộ Hai – Welwitschiales 1.4 Đặc điểm Dây gắm – Gnetales Bộ dây gắm có họ: Họ Dây gắm- Gnetaceae chi chi Dây gắm – Gnetum [1] 1.5 Đặc điểm chung chi Dây Gắm Dây leo, cành mọc đối, chia khúc, có mấu Lá mọc đối, đơn, nguyên, gân lông chim Hoa đơn tính Cụm hoa cụm hoa đực mọc thành cụm hình sóc Lá bắc chéo hình chữ thập dính với thành tổng bao có hai thùy Hoa đực khơng có đài tràng, mang vài nhị Bao phấn hai ơ, hạt phấn hình bầu dục Hoa mang bầu đựng nỗn thẳng Quả khô đựng nhiều vỏ mỏng dày cứng có bao bọc bắc nạc Quả hạt [1], [4] Chi Dây gắm bao gồm khoảng 30-35 loài, phân bố chủ yếu rừng nhiệt đới châu Á, châu Phi, Nam Trung Mỹ [10] 1.6 Tìm hiểu Gắm núi cao - Gnetum montanum Markgr 1.6.1 Đặc điểm thực vật Dây leo gỗ, cành mọc đối, thân sần sùi, có đốt, màu nâu Lá đơn nguyên, mọc đối Phiến dày, dai, hình trừng thn, dài - 15 cm, rộng - 8cm, gần tròn hay gần nhọn gốc, gân bên - đôi; cuống dài khoảng 0,5 cm Hoa đơn tính Cụm hoa đực nách hay thân, chia nhánh - lần, gồm nhiều bơng hình trụ, mang 18 vịng sít nhau, với bao chung loe bao lấy 20 30 hoa đực xếp xắn ốc Cụm hoa phân nhánh - lần với vòng cách biệt, vòng mang - hoa Quả hình trứng thn, dài - 2,5cm, rộng - 1,3cm, không cuống hay cuống ngắn, tù hay trịn có mũi cứng đỉnh Cây hoa tháng 4-6, có tháng 8-10 [10] 1.6.2 Phân bố Cây mọc rừng rậm ẩm, nhiệt đới Trên giới: Ấn Độ, Nêpal, Butan, Atxam, Mianma, Nam Trung Quốc, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam có vùng Mã Lai Ở nước ta: Cây mọc hoang từ Vĩnh Phúc, Hà Tây, Quảng Trị, Quảng Nam, Lâm Đồng tới Tây Ninh Kiên Giang [10] 1.6.3 Thành phần hóa học Chưa có tài liệu nghiên cứu [3] 1.6.4 Bộ phận dùng Rễ dây thu hái quanh năm, rửa sạch, thái mỏng, phơi khơ 1.6.5 Tính vị, cơng Theo y học cổ truyền dây gắm có vị đắng, tính bình, có tác dụng khu phong, trừ thấp, thư cân hoạt huyết, giải độc, tiêu viêm, sát trùng [3], [10] 1.6.6 Cơng dụng Cây có vỏ cho sợi tốt, thường dùng làm dây nỏ, làm chạc hay thừng Hạt ăn Rễ dây thu hái quanh năm, rửa sạch, thái mỏng, phơi khô Rễ thân dây gắm dùng làm thuốc giảm đau, chữa phong tê thấp, sản hậu gầy mòn, giải chất độc (độc thức ăn, sơn ăn da, rắn cắn ) dùng làm thuốc chữa sốt sốt rét Rễ gắm cịn dùng chữa kinh nguyệt khơng Lá gắm giã đắp chữa rắn cắn Ở Ấn Độ, dầu hạt dùng xoa bóp trị bệnh tê thấp; thân rễ dùng làm thuốc hạ nhiệt Ở Trung Quốc, dây gắm giã nát với rượu, đắp bó chữa gẫy xương Ở Phúc Kiến, có sản xuất loại thuốc viên nén siro từ dây gắm để trị viêm họng cấp mạn tính Rễ gắm dùng để chữa bệnh hạc tất phong (sưng đau đầu gối) [10] Dây Gắm dùng riêng phối hợp số thuốc sau đây: Chữa lở sơn: Lấy rễ gắm 20g, cho 300ml nước sắc nhỏ lửa 150ml, ngày uống lần [10] Hỗ trợ chữa phong thấp: Rễ gắm, rễ cà gai leo, vỏ chân chim, rễ cỏ xước, dây đau xương, rễ tầm xuân, vị 20g, cho 500ml, sắc 200ml, uống ngày lần Dùng liền 15 ngày [10] Hoặc: Rễ gắm núi 30g, rễ xấu hổ 20g, lốt, ké đầu ngựa, thiên niên kiện vị 10g, thạch xương bồ 5g Tất thái nhỏ phơi khô đem sắc với 400ml nước, 100ml, chia lần uống ngày Dùng liệu trình, liệu trình l5 ngày, liệu trình nghỉ ngày [10] Chữa đau nhức gân xương: Rễ gắm, rễ rung rúc, vỏ hoa giẻ, ngũ gia bì thứ 80g, rễ bướm bạc, rễ tầm xuân, rễ bưởi bung, rễ cỏ xước, rễ ô dược, tầm cửi dâu, rễ bạch đồng nữ, rễ xích đồng nam thứ 40g, rễ thiên, cỏ roi ngựa, thứ 20g thái nhỏ phơi khơ, ngâm với lít rượu trắng, đậy kín, sau 15 ngày, ngày uống chén nhỏ, uống trước ngủ Tuy nhiên, tùy thể trạng mà vị gia giảm nên trước áp dụng cần lương y có uy tín bắt mạch kê đơn (Hải Thượng Lãn Ông) [10] Chữa kinh nguyệt không đau bụng kinh: Rễ gắm 20g, ích mẫu 20g, lươn 15g, nhân trần bồ bồ 15g, bạch đồng nữ xích đồng nam 15g, nghệ đen 10g, tất phơi khô, sắc với 400ml 100ml, chia làm lần uống ngày [10] Chữa rắn cắn: Lá gắm giã nhỏ với đại, đắp vào vết rắn cắn Thuốc dùng ngồi khơng kể liều lượng [10] Trị Gout: Rễ thân gắm sơ chế nấu thành cao, ngâm rượu hay hịa với nước nóng uống trị Gout, làm giảm acid uric máu Liều dùng 20g/ngày Hoặc: Dây gắm 5kg, thiên niên kiện 3kg, ngũ gia bì 2kg tất sơ chế nấu thành cao (cao Vương Tơn) Mỗi ngày dùng 20g, hịa với nước nóng uống ngày [3] 1.7 Các nghiên cứu Dây gắm Theo thông tin tài liệu “Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1”, thân gắm có chứa chất I, II, III, IV, 2,3 diphenyl pyrol N,N’-Dimethyl ethanolamin.Cịn có dẫn chất dl-dimethylcolaurin hydroclorid Theo tài liệu nước hoạt chất dl-dimethylcolaurin hydroclorid chiết tách từ gắm có tác dụng bình suyễn [10] Ở Việt Nam có đề tài “ Đánh giá an toàn tác dụng điều trị bệnh Gout cao Vương Tôn” Bác sĩ Đặng Thị Như Hoa bệnh viện y học cổ truyền Yên Bái, Bác sĩ Nguyễn Nhược Kim trường Đại học Y Hà Nội cộng thực Thành phầm cao Vương Tôn dây gắm phối hợp với thiên niên kiện ngũ gia bì Kết cho thấy thuốc có tác dụng giảm đau, giảm sưng, hạ acid uric máu rõ rệt hai nhóm bệnh nhân gút cấp gút mạn sau tháng sử dụng thuốc [3] PHẦN II: NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Nguyên vật liệu, thiết bị hóa chất 2.1.1 Nguyên liệu Nguyên liệu phận lá, thân, rễ Gắm núi thu hái huyện Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ − Thiết bị: Kính hiển vi quang học, máy soi đèn tử ngoại, tủ sấy, tủ hốt, nồi đun cách thủy…và trang thiết bị khác − Bộ dụng cụ cắt vi phẫu, nhuộm tiêu − Bản mỏng Silicagel hoạt hóa 1100C − Các dụng cụ thủy tinh: ống nghiệm, bình nón, bình gạn, cốc có mỏ, pipet 2.1.3 Hóa chất − Các dung môi dùng nghiên cứu: Nước tinh khiết, Ethanol (25%, 70%, 96%), methanol, n-butanol, etyl acetat, clorofom, n-hexan… − Các hóa chất, thuốc thử: axit sulfuric, kali hydroxyd, natri hydroxyd, dragendorff, mayer, bouchardat, fehling, acid picric, đồng acetat, chì acetat, sắt (III) clorid 2.2.Nội dung 2.2.1 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Xác định số đặc điểm thực vật − Mô tả đặc điểm hình thái − Làm tiêu quan sát đặc điểm vi phẫu lá, thân, rễ − Soi bột lá, thân, rễ tìm đặc điểm Nội dung 2: Xác định nhóm hoạt chất có − Định tính nhóm hoạt chất thường có dược liệu phương pháp hóa học − Định tính nhóm hoạt chất phân đoạn dịch chiết − Định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng 2.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn dược liệu - Dược cổ truyền, Khoa Dược Trường đại học Y Dược Thái Bình Thời gian nghiên cứu: Từ tháng năm 2014 đến tháng năm 2014 2.3.Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Xác định số đặc điểm thực vật − Đặc điểm hình thái mơ tả theo phương pháp mơ tả phân tích: Mơ tả rõ ràng từ tổng quát tới chi tiết [6], [1] − Xác định đặc đặc điểm vi phẫu đặc điểm bột lá, thân, rễ Gắm theo phương pháp vi học kiểm nghiệm dược liệu [6] 2.3.2 Xác định nhóm hoạt chất 2.3.2.1 Định tính nhóm hoạt chất thường gặp dược liệu phương pháp hóa học  Định tính saponin − Quan sát tượng tạo bọt Tính chất tạo bọt tính chất đặc trưng saponin phân tử saponin lớn có lúc đầu ưa nước đầu kị nước Thí nghiệm: Cho vào ống nghiệm to 2g bột dược liệu ml nước cất Đun sôi nhẹ, lọc nóng Gạn lấy dịch lọc cho vào ồng nghiệm to, thêm đồng lượng nước cất, lắc mạnh phút theo chiều dọc ồng nghiệm, để yên theo dõi tượng tạo bọt sau ngừng lắc Có thể xác định sơ saponin steroid saponin triterpen sau: + Lấy khoảng gam nguyên liệu khô nghiền nhỏ, thêm vào 5ml ethanol 70% Hỗn hợp đun nóng ống nghiện đến sơi bếp cách thuỷ, làm lạnh lọc lấy nước Lấy ống nghiệm, đánh số 1, Trong ống 1, thêm 5ml dung dịch HCl 0,1N (pH = 1), ống nghiệm thêm vào 5ml dung dịch NaOH 0,1N (pH = 13).Trong ống nghiệm thêm vào – giọt dịch chiết cồn lắc mạnh khoảng phút.Nếu ống nghiệm bọt tạo thành kích thước, số lượng bền vững cột bọt nguyên liệu chứa saponin triterpen Nếu pH = 13 bọt lớn vài lần số lượng bền vững nguyên liệu chứa saponin steroid + Phản ứng Liberman- Burchard: Các saponin steroid cho màu xanh lơ, saponin triterpen cho màu hồng đến tím − Phản ứng Salkowski Cho 1g bột vào ống nghiệm, thêm 5ml ethanol 90% đậy bơng Đun cách thủy đến sơi, lọc nóng để nguội Dịch lọc cho vào ống nghiệm to, nghiêng ống nghiệm 450, cho từ từ theo thành ồng nghiệm giọt H2SO4 đặc Quan sát xuất màu, màu thay đổi từ vàng, đỏ, lơ xanh hay lơ tím  Định tính Glycosid tim Cho 20g dược liệu vào cốc có mỏ 200ml, thêm 100ml nước cất Đun sơi 20 phút, lọc nóng Để nguội, chuyển dịch lọc vào bình lắng gạn 125ml, chiết lần lần 5ml clorofom Gộp dịch chiết chia vào ống nghiệm nhỏ ống khoảng 1ml Bốc nồi cách thủy tới khô Tiến hành phản ứng định tính: − Phản ứng Liberman- Burchard Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml acid acetic đặc, lắc để thuốc thử hòa tan hết cắn Nghiêng thành ống nghiệm 450, thêm đồng lượng acid sulfuric đặc (0,5ml) theo thành ống nghiệm để dịch lỏng ống nghiệm chia thành lớp; mặt tiếp xúc lớp chất lỏng xuất vòng màu nâu đỏ Lắc nhẹ ống nghiệm lớp chất lỏng phía có màu xanh − Phản ứng Baljet Chuẩn bị thuốc thử Baljet: cho vào ống nghiệm phần dung dịch acid picric 1% cồn phần dung dịch NaOH 10% cồn, lắc Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5 ml Ethanol 90% Lắc cho cắn hòa tan hết Nhỏ giọt thuốc thử Baljet vừa pha xuất màu đỏ da cam − Phản ứng Legal Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml Ethanol 90%, lắc cho cắn hòa tan hết Nhỏ giọt thuốc thử Natri nitroprusiat 0,5% cồn giọt dung dịch NaOH 10% cồn vào ống nghiệm Lắc xuất màu đỏ chóng − Phản ứng Keller- Kiliani Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5 ml Ethanol 90%, lắc cho cắn hòa tan hết Thêm vài giọt dung dịch Sắt (III) clorid 5% 0,5 ml acid acetic 10%, lắc Nghiêng ống nghiệm 450 Thêm đồng lượng acid sulfuric đặc theo thành ống ghiệm; quan sát mặt tiếp xúc chất lỏng xuất vịng đỏ tím Lắc nhẹ ống nghiệm, lớp chất lỏng phía có màu xanh  Định tính Flavoloid 10 Chiết xuất: Cho 5g bột dược liệu vào bình nón 100ml, thêm 30ml ethanol 90% Đun cách thủy đến sôi 3-5 phút Lọc nóng Dịch lọc dùng làm phản ứng định tính Dược liệu có flavonoid phản ứng sau dương tính − Phản ứng Cyanidin Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm bột magnesi kim loại thêm giọt acid HCl đậm đặc (3-5 giọt) Để yên vài phút, quan sát thấy dung dịch chuyển sang màu đỏ Thêm kiềm dư, dung dịch chuyển sang màu xanh − Phản ứng với kiềm + Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịh chiết Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% Quan sát màu thấy màu vàng dung dịch đậm lên + Nhỏ giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc Hơ khô để lên miệng lọ amoniac đặc mở nút, thấy màu vàng vết dịch chiết tăng lên − Phản ứng với FeCl3 5% Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm vài giọt FeCl 5% Quan sát xuất tủa màu xanh đen − Phản ứng diazo hóa Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa dung dịch NaOH 10% Thêm vài giọt thuốc thử diazo pha, lắc xuất màu đỏ Pha thuốc thử diazo: cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch procain, 10 giọt NaNO2 1M 10 giọt HCl 10% Lắc  Định tính Coumarin Chiết xuất: Cho 5g bột dược liệu vào bình nón 100ml, thêm 30ml cồn 90% Đun cách thủy đến sơi phút Lọc nóng qua giấy lọc Dịch lọc dùng làm phản ứng định tính − Phản ứng đóng mở vịng lacton Cho vào ống nghiệm ống 1ml dịch chiết cồn Đánh số ống 1, ống + Ống 1: Thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% + Ống 2: Để nguyên 23 3.2.1 Định tính nhóm hoạt chất thường gặp dược liệu phương pháp hóa học 3.2.1.1 Định tính saponin Bảng 1: Kết định tính saponin STT Tên phản ứng Kết Hiện tượng tạo bọt +++ Phản ứng Salkowski ++ Kết sơ định tính saponin thuộc nhóm triterpenoid hay steroid cho thấy bọt to bền vững môi trường kiềm, phản ứng Liberman cho màu xanh Nhận xét: Trong mẫu nghiên cứu có chứa saponin, sơ xác định saponin steroid Hình 8: Hình ảnh phản ứng định tính Saponin (Từ trái sang phải: Hiện tượng tạo bọt, tượng tạo bọt môi trường acid môi trường kiềm, P/ư Salkowski P/ư Liberman) 3.2.1.2 Định tính Glycosid tim Bảng 2: Kết định tính Glycosid tim STT Tên phản ứng Kết 24 Phản ứng Liberman- Burchard ++ Phản ứng Baljet - Phản ứng Keller- Kiliani - Phản ứng Legal ++ Nhận xét: Không phát mẫu nghiên cứu có chứa Glycosid tim 3.2.1.3 Định tính Flavonoid Bảng 3: Kết định tính Flavonoid STT Tên phản ứng Kết Phản ứng Cyanidin - Phản ứng với FeCl3 5% ++ Phản ứng với NaOH + Phản ứng với NH3 + Phản ứng Diazo + Nhận xét: Không phát mẫu nghiên cứu có chứa Flavonoid 3.2.1.4 Định tính Coumarin Bảng 4: Kết định tính Coumarin STT Tên phản ứng Kết Phản ứng đóng mở vịng lacton - Phản ứng Diazo + Thử nghiệm vi thăng hoa - Nhận xét: Không phát mẫu nghiên cứu có chứa Coumarin 25 3.2.1.5 Định tính Anthranoid Bảng 5: Kết định tính Anthranoid STT Tên phản ứng Kết Phản ứng Borntraeger - Phản ứng vi hóa - Thử nghiệm vi thăng hoa - Nhận xét: Không phát mẫu nghiên cứu có chứa Anthranoid 3.2.1.6 Kết định tính Alcaloid Bảng 6: Kết định tính Alcaloid STT Tên phản ứng Kết Phản ứng Mayer - Phản ứng Dragendorff - Phản ứng Bouchardat - Nhận xét: Khơng phát mẫu nghiên cứu có chứa Alcaloid 3.2.1.7 Định tính tanin Bảng 7: Kết định tính tanin STT Tên phản ứng Kết Phản ứng với FeCl3 5% ++ Phản ứng với Chì acetat ++ Phản ứng với Đồng acetat - Phản ứng với Gelatin 1% - Nhận xét: Không phát mẫu nghiên cứu có chứa tanin 3.2.1.8 Định tính acid amin Bảng 8: Kết định tính acid amin STT Tên phản ứng Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin Kết - Nhận xét: Không phát mẫu nghiên cứu có chứa acid amin ... vùng Mã Lai Ở nước ta: Cây mọc hoang từ Vĩnh Phúc, Hà Tây, Quảng Trị, Quảng Nam, Lâm Đồng tới Tây Ninh Kiên Giang [10] 1.6.3 Thành phần hóa học Chưa có tài liệu nghiên cứu [3] 1.6.4 Bộ phận dùng... dược liệu phương pháp hóa học − Định tính nhóm hoạt chất phân đoạn dịch chiết − Định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng 2.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn dược liệu... Bộ Hai – Welwitschiales 1.4 Đặc điểm Dây gắm – Gnetales Bộ dây gắm có họ: Họ Dây gắm- Gnetaceae chi chi Dây gắm – Gnetum [1] 1.5 Đặc điểm chung chi Dây Gắm Dây leo, cành mọc đối, chia khúc, có