Nghiên cứu tổng hợp phức của kẽm với NacetylLCystein

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG ĐỨC HẠNH MÃ SINH VIÊN: 1101161 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP PHỨC CỦA KẼM VỚI N-ACETYL-L-CYSTEIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG ĐỨC HẠNH MÃ SINH VIÊN: 1101161 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP PHỨC CỦA KẼM VỚI N-ACETYL-L-CYSTEIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Đình Luyện Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Đình Luyện, người trực tiếp hướng dẫn, cho lời khuyên quý báu và tạo mọi điề u kiện giúp đỡ trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp nà y Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Công Nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là TS Nguyễn Văn Hải, Th.S Nguyễn Văn Giang và CN Phan Tiế n Thành tổ môn Tổng hợp Hóa dược đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện tốt để hoàn thành khóa luận tố t nghiệp này Trong trình thực khóa luận nhận giúp đỡ cán Phòng Phân tích chất lượng môi trường - Viện Công nghệ Môi trường - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Phòng Hóa Đại cương – vô cơ, Phòng Hóa Dược Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQG Hà Nội cùng toàn thể thầy cô trường, thư viện trường Đại học Dược Hà Nội, xin chân thành cảm ơn! Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đế n bố mẹ và bạn bè - người động viên, khích lệ sống và học tập! Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Phùng Đức Hạnh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Kẽm 1.1.1 Tính chất .2 1.1.2 Vai trò kẽm với sức khỏe người .2 1.2 Tổng quan N-acetyl-L-cystein .5 1.2.1 Cấu trúc hóa học 1.2.2 Tính chất 1.2.3 Tác dụng dược lý 1.3 Vài nét phức chất 1.3.1 Định nghĩa phức chất 1.3.2 Thành phần phối tử phức 1.3.3 Dung lượng phối trí phối tử 1.3.4 Số phối trí 1.4 Các phương pháp xác định cấu trúc phức chất dạng tinh thể 1.4.1 Phương pháp hóa học – Xác định hàm lượng nguyên tố 1.4.2 Phương pháp phân tích nhiệt 10 1.4.3 Các phương pháp nhiễu xạ 10 1.4.4 Phương pháp đo phổ hấp thụ hồng ngoại 11 1.4.5 Một số phương pháp khác 11 1.5 Ứng dụng phức kẽm - NAC y - dược 11 1.6 Các nghiên cứu tổng hợp phức chất kẽm NAC 12 1.6.1 Nghiên cứu M Takaya và cộng (2005) 13 1.6.2 Nghiên cứu Y Adachi và cộng (2007) 13 1.6.3 Nghiên cứu M Singh và cộng (2013) 14 1.6.4 Nghiên cứu X Xie và cộng (2015) 15 1.6.5 Nhận xét chung 15 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên liệu 16 2.2 Dụng cụ, thiết bị 16 2.3 Nội dung nguyên cứu 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Tổng hợp hóa học 17 2.4.2 Kiểm tra độ tinh khiết 18 2.4.3 Xác định cấu trúc 18 CHƯƠNG : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 20 3.1 Tổng hợp hóa học 20 3.1.1 Tổng hợp hợp chất aquo(N-acetyl-L-cystein)zinc (H-1) 20 3.1.2 Tổng hợp hợp chất zinc N-acetyl-L-cysteinat (H-2) 25 3.2 Kết xác định cấu trúc sản phẩm 27 3.2.1 Kết phổ AAS 27 3.2.2 Kết phổ hồng ngoại 28 3.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và carbon-13 (13C-NMR) 29 3.3 Bàn luận 30 3.3.1 Về tổng hợp hóa học 30 3.3.2 Về kiểm tra độ tinh khiết 32 3.3.3 Về xác định cấu trúc 33 CHƯƠNG : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 4.1 Kết luận 37 4.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU H-NMR 1H - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 13 C-NMR 13 C - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Carbon 13) AAS Atomic Absorption Spectroscopy (Phổ hấp thụ nguyên tử) Ac Nhóm Acetyl ADN Acid Deoxyribonucleic AIDS Acquired immunodeficiency syndrome (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải người) ARN Acid Ribonucleic CA Carbonic Anhydrase CTPT Công thức phân tử đvC Đơn vị Carbon EPA United States Environmental Protection Agency EtOH Ethanol GSH Glutathion h Giờ HIV Human immunodeficiency virus Hpư Hiệu suất phản ứng IR Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại) msp Khối lượng sản phẩm MS Mass spectrometry (Phổ khối lượng) NAC N-acetyl-L-cystein Rf Retention factor (Hệ số lưu giữ) SKLM Sắc ký lớp mỏng SMEWW Standard Methods for the Examination Wastewater of Water and SOD Superoxyd Dismustase t Thời gian T°nc Nhiệt độ nóng chảy UWS University of Wisconsin solution DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Danh mục nguyên liệu Bảng 2.2: Danh mục dụng cụ, thiết bị Bảng 3.1: Khối lượng sản phẩm H-1 sau ba lần thí nghiệm theo phương pháp X Xie Bảng 3.2: Khối lượng sản phẩm H-1 sau ba lần thí nghiệm theo phương pháp M Takaya Bảng 3.3: Khảo sát tỷ lệ dung môi tinh chế H-1 từ phương pháp X Xie Bảng 3.4: Khảo sát tỷ lệ dung môi tinh chế H-1 từ phương pháp M Takaya Bảng 3.5: Kết độ lặp lại quy trình sử dụng tỷ lệ nước:ethanol = 1:4 Bảng 3.6: Khối lượng sản phẩm H-2 thu sau lần thí nghiệm Bảng 3.7: Hàm lượng kẽm lý thuyết thực tế sản phẩm Bảng 3.8: Các bước sóng đặc trưng phổ IR NAC sản phẩm Bảng 3.9: Kết phân tích phổ 1H-NMR sản phẩm H-1 Bảng 3.10: Kết phân tích phổ 13 C-NMR sản phẩm H-1 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1: Phản ứng trình hô hấp nhờ xúc tác CA Hình 1.2: Cấu trúc hóa học NAC Hình 1.3: Cấu trúc phức chất aquoaspatic(N-acetyl-L-cystein)nikel Hình 1.4: Cấu trúc phức chất diaquo(N-acetyl-L-cystein)zinc Hình 1.5: Cấu trúc phức 2:1 NAC Ni2+, Cu2+, Zn2+ Hình 1.6: Cấu tạo glutathion Hình 1.7: Cấu tạo gliotoxin Hình 1.8: Sơ đồ thiết bị phân tích nhiệt trọng lượng Hình 1.9 : Tổng hợp phức kẽm với NAC theo M Takaya Hình 1.10: Tổng hợp phức kẽm với NAC theo Y Adachi Hình 1.11: Tổng hợp phức kẽm với NAC theo M Singh Hình 1.12: Tổng hợp phức kẽm với NAC theo X Xie Hình 2.1: Sơ đồ tóm tắt phản ứng tổng hợp sản phẩm phức kẽm-NAC đề tài Hình 3.1: Sơ đồ phản ứng tạo H-1 theo X Xie cộng Hình 3.2: Thí nghiệm tạo H-1 theo X Xie cộng Hình 3.3: Sơ đồ phản ứng tạo H-1 theo M Takaya cộng Hình 3.4: Sơ đồ phản ứng tạo H-2 Hình 3.5: Quá trình xảy SKLM Hình 3.6: Công thức cấu tạo sản phẩm H-1 Hình 3.7: Công thức cấu tạo sản phẩm H-2 32 phẩm dễ hòa tan nước tan dung môi không phân cực (rất tan cồn không tan dung môi hữu khác aceton, dichloromethan ) - Khi kết tinh lại đối dung môi ethanol – nước sản phẩm kết tủa dạng tinh thể nhỏ, lọc gây bít tắc lỗ lọc khiến trình lọc khó khăn kéo dài Mục đích trình cất bớt dung môi trước tạo kết tủa để tăng nồng độ sản phẩm dung dịch, thêm ethanol sản phẩm kết tủa dạng tinh thể lớn dễ lọc - Để cho hiệu suất trình tinh chế cao nhất, sử dụng tỷ lệ ethanol:nước =4:1 - Khi sấy sản phẩm 80 oC áp suất thường thu cấu trúc H-1 dạng bột trắng đều, thể chất mịn đẹp, hòa tan tốt nước tốc độ hòa tan nhanh 3.3.1.2 Về quy trình tổng hợp chất H-2 - Thực tổng hợp chất H-2 với quy trình tương tự quy trình tổng hợp chất H-1, nhiên nhận thấy phản ứng theo X Xie có hiệu suất cao nên tổng hợp H-2 theo phương pháp - Điểm khác biệt quy trình tổng hợp hai chất giai đoạn sấy Sản phẩm H-2 sau kết tinh sấy 80o C áp suất chân không - Sản phẩm cuối có cảm quan tinh thể màu vàng nhạt, ánh kim, tan tốt nước nhiên tốc độ hòa tan chậm so với sản phẩm H-1 Như ta thấy trình sấy ảnh hưởng nhiều đến cấu trúc tính chất sản phẩm cuối - Lý có khác biệt phương pháp: trình sấy áp suất chân không khiến nước bay mạnh nhiệt độ 75-80 oC, tách khỏi phân tử phức chất khiến phân tử chuyển dạng dạng muối đơn H-2 Trong trình sấy áp suất thông thường làm bay nước cồn phân tử phức chất, nhờ bảo toàn cấu trúc sản phẩm H-1 3.3.2 Về kiểm tra độ tinh khiết Khi kiểm tra SKLM nhận thấy H-1 H-2 cho kết SKLM giống nhau, giải thích sau: 33 - Kết kiểm tra sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-BuOH:AcOH:H2O = 9:2:2,5 cho thấy môi trường acid sản phẩm bị phân hủy thành NAC muối acetat Zn, sau NAC dung môi pha động kéo lên vết sắc ký đồ tương đương với NAC chuẩn Có thể khẳng định thành phần H-1 H-2 không tồn amino acid khác NAC Hình 3.5: Quá trình xảy SKLM - Kết sắc ký hệ dung môi CH2Cl2:CH3OH=9:1 cho thấy H-1 H-2 mang chất muối có độ phân cực lớn, không tan dung môi hữu nên không dung môi pha động kéo lên rửa giải hệ Bằng kết khẳng định sản phẩm không lẫn tạp hữu amino acid dư 3.3.3 Về xác định cấu trúc 3.3.3.1 Xác định cấu trúc H-1  Phổ AAS - Sử dụng phổ hấp thụ nguyên tử giúp xác định xác hàm lượng ion kim loại có mẫu khác Với phương pháp ion hóa lửa kim loại đo Zn, độ nhạy lên đến 0,03  g / ml [10] Từ kết hàm lượng Zn thực tế so sánh với lý thuyết giúp ta khẳng định công thức phân tử sản phẩm - Kết phổ AAS cho ta hàm lượng Zn sản phẩm H-1 26,57% tương ứng với công thức phân tử C5 H7NO3 Zn.H2O 34  Phổ hồng ngoại - Phổ hổng ngoại phương pháp hữu hiệu việc xác định cấu trúc phức chất [8] - Phân tích chi tiết phổ dao động hồng ngoại cho thấy: Đỉnh hấp thụ cực đại nhóm –C=O -COOH không phổ H-1 mà thay vào có xuất đỉnh hấp phụ cực đại nhóm –C=O –COO- 1575,8 cm-1 Như khẳng định nhóm -COOH cho proton để tạo anion –COO- - Trên phổ IR H-1 không nhận thấy có đỉnh hấp thụ cực đại nhóm -SH phổ NAC ban đầu, nhóm -COOH nhóm -SH cho proton để hình thành anion –S- , tạo liên kết với cation Zn2+ -Trong phổ IR NAC[9], đỉnh hấp thụ cực đại nhóm -NH- xuất rõ rệt với νN-H=3376,0 cm-1 Khi hình thành phức chất, vân phổ thay đổi bước sóng 3278,9 cm-1 pic bị giãn rộng so với phổ NAC chuẩn Trong công trình Nakamoto phổ phức chất cho thấy dải N-H rộng dịch chuyển phía số sóng thấp so với N-H không tạo phức[8] Như H-1 có tạo thành liên kết phối trí nguyên tử N cation kim loại Zn Cấu trúc phù hợp với nghiên cứu tài liệu [21] - Ngoài phổ hồng ngoại cho thấy đỉnh hấp thụ cực đại 3373,5 cm-1 ứng với dao động hóa trị nhóm –OH nước (nước kết tinh phối trí có đỉnh hấp thụ 3550-3200 cm-1) - Qua việc phân tích phổ sản phẩm nghiên cứu kết hợp với kết AAS khẳng định cấu trúc sản phẩm H-1 hình sau: Hình 3.6: Công thức cấu tạo sản phẩm H-1 35  Phổ cộng hưởng từ - Phổ 1H-NMR sản phẩm H-1 D2 O có tín hiệu cho phép nhận biết số lượng proton vị trí chúng phân tử, cụ thể sau:  Tín hiệu singlet δ = 1,99 ppm đặc trưng cho hydro nhóm -CH3 nhóm acetyl (H-5)  Tín hiệu singlet rộng δ = 2,97 ppm đặc trưng cho hydro nhóm -CH2 (H-3)  Tín hiệu singlet rộng δ = 4,36 ppm đặc trưng cho hydro nhóm -CH(H-2) - Phổ 13C-NMR sản phẩm H-1 D2O có tín hiệu cho phép nhận biết số lượng carbon vị trí chúng phân tử Kết cho thấy tín hiệu phù hợp với cấu trúc dự kiến 3.3.3.2 Xác định cấu trúc H-2  Phổ AAS - Kết đo AAS H-2 cho kết hàm lượng Zn trung bình mẫu 28,95% phù hợp với công thức C5H7NO3Zn  Phổ hồng ngoại sản phẩm H-2 - Phân tích phổ hồng ngoại sản phẩm H-2 (phụ lục 2) nhận thấy đỉnh hấp thụ cực đại nhóm -NH- 3394,72 cm-1 cao, tức N không tạo liên kết cho nhận với cation Zn2+ Không nhận thấy xuất đỉnh hấp thụ đặc trưng SH COOH mà xuất đỉnh hấp thụ cực đại nhóm –COO- Kết hợp với kết AAS khẳng định cấu trúc chất H-2 sau: Hình 3.7: Công thức cấu tạo sản phẩm H-2 36 Như vậy, kết phân tích phổ AAS, IR, 1H-NMR 13 C-NMR giúp biện giải thành công cấu trúc sản phẩm tạo thành nghiên cứu 37 CHƯƠNG : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã tổng hợp phức chất kẽm N-Acetyl-L-cystein :  Aquo(N-acetyl-L-cystein)zinc (H-1) Tonc=276-281 o C (phân hủy)  Zinc N-acetyl-L-cysteinat (H-2) Tonc=256-260 o C (phân hủy) - Cấu trúc sản phẩm xác định phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử AAS, phổ hồng ngoại IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR 13 C- NMR 4.2 Kiến nghị Từ kết nghiên cứu tổng hợp xác định cấu trúc phức chất NAC kẽm, có số đề xuất để phát triển nghiên cứu đạt sau: - Tiến hành sử dụng thêm phương pháp khác để khẳng định xác cấu trúc sản phẩm phức chất tạo thành - Tiếp tục nghiên cứu điều kiện phản ứng thời gian tiến hành, nhiệt độ phản ứng, tỷ lệ tác nhân phản ứng, tốc độ đưa tác nhân phản ứng để tối ưu hóa hiệu suất trình - Tiến hành nghiên cứu mở rộng đặc tính lý hóa liên quan tới bào chế (độ trơn chảy, chịu nén, tá dược phù hợp, độ tan tốc độ hòa tan vv ) nhằm hướng tới tạo nên sản phẩm có khả sử dụng thực tiễn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ môn Hóa Dược (2004), Hóa Dược I, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội tr.150-151 Bộ Y Tế (2002), Dược Thư Quốc Gia Việt Nam, NXB Y Học, Hà Nội Bộ Y Tế (2007), Hóa học hữu I, NXB Y học, Hà Nội tr.301-303 Bộ Y Tế (2008), Hóa Đại Cương - Vô Cơ 1, NXB Y Học, Hà Nội tr.159-175 Bộ Y Tế (2009), Hóa Đại cương - Vô 2, NXB Y Học, Hà Nội tr.280-288 Bộ Y Tế (2010), Dược Điển Việt Nam IV, NXB Y Học, Hà Nội Trần Thị Đà, Nguyễn Hữu Định (2007), Phức chất - phương pháp tổng hợp và nghiên cứu cấu trúc, NXB Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội tr.148-179 Lê Chí Kiên (2006), Hóa Học Phức Chất, NXB Đại Học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội tr.120 - 166 Hồ Hoàng Nhân (2009), Nghiên cứu cải tiến quy trình thủy phân keratin và bán tổng hợp N-acetyl-L-cystein, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội tr.51-54 10 Nguyễn Ngọc Tuấn (2008), Phép đo AAS, Viện Nghiên cứu Hạt Nhân Đà Lạt Tiếng Anh 11 Adachi Y., Yoshikawa Y., and Sakurai H (2007), "Antidiabetic zinc (II)‐N‐ acetyl‐L‐cysteine complex: Evaluations of in vitro insulinomimetic and in vivo blood glucose‐lowering activities", Biofactors, 29(4), pp.213-223 12 Antolini L., et al (1982), "Synthesis, spectroscopic and magnetic properties of mixed-ligand complexes of copper(II) with imidazole and nitrogenprotected amino acids Crystal and molecular structure of bis(hippurate)bis(imidazole)copper(II)", Inorg Chem., 21(4), pp.1391-1395 13 Grattagliano I., et al (2004), "Effect of dietary restriction and N-acetylcysteine supplementation on intestinal mucosa and liver mitochondrial redox status and function in aged rats", Exp Gerontol, 39(9), pp.1323-1332 14 Jocelyn P.C (1972), Biochemistry of the S-H group, London, pp.117-243 15 Mandal S., Das G., and Askari H (2014), "Interactions of N-acetyl-l-cysteine with metals (Ni 2+, Cu2+ and Zn2+): an experimental and theoretical study", Structural Chemistry, 25(1), pp.43-51 16 Piper R and Newton D.E (2000), Chemical Elements: From Carbon to Krypton, JSTOR 17 Shaesta Q (2014), "Studies of Some Mixed ligand Ternary Metal Complexes of N-AcetylCysteine with Zinc (II) and Nickel (II) Metal ions", Research Journal of Chemical Sciences, 4, pp.32-35 18 Shah D.T and Larsen B (1991), "Clinical isolates of yeast produce a gliotoxin-like substance", Mycopathologia, 116(3), pp.203-208 19 Singh M., et al (2013), "Protective effect of zinc-N-acetylcysteine on the rat kidney during cold storage", American Journal of Physiology-Renal Physiology, 305(7), pp.F1022-F1030 20 Takaya M (2005), "A new synthetic method of zinc (II) complexes based on mixing", The Pharmaceutical Society of Japan, 125(10), pp.829-832 21 Xie X., Daniels R.S., and Gahan P (2015), N-acetyl L-cysteine chelates and methods for making and using the same, US patient, US Website 22 Viện Dinh Dưỡng Việt Nam (2016), Thiếu Kẽm bà mẹ và trẻ em, accessed 10/05/2016, from vaphattrien.aspx?id=681 http://viendinhduong.vn/chitietbancobietdinhduo ng- PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ IR sản phẩm H-1 Phụ lục 2: Phổ IR sản phẩm H-2 Phụ lục 3: Kết AAS sản phẩm H-1 Phụ lục 4: Kết AAS sản phẩm H-2 Phụ lục 5: Kết phổ 1H-NMR sản phẩm H-1 Phụ lục 6: Kết phổ 13C-NMR sản phẩm H-1 Phụ lục 1: Phổ IR sản phẩm H-1 Phụ lục 2: Phổ IR sản phẩm H-2 Phụ lục 3: Kết AAS sản phẩm H-1 Phụ lục 4: Kết AAS sản phẩm H-2 Phụ lục 5: Kết phổ 1H-NMR sản phẩm H-1 Phụ lục 6: Kết phổ 13C-NMR sản phẩm H-1